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1、体细胞杂交,体细胞杂交,引言,离体原生质体最重要特性：具有彼此融合的能力动物细胞融合只是个分析工具，而植物细胞融合为制造新杂种开辟了一条新途径。（为什么？）体细胞杂交：完全不经过有性过程，只通过体细胞融合制造杂种的方法称做体细胞杂交。针对：有性生殖能力很低或者不具备的植物（如，香蕉，马铃薯，甘薯，等）步骤：原生质体制备、原生质体融合、杂种细胞选择、杂种细胞培养、由杂种愈伤组织再生植株、杂种植株鉴定。,引言离体原生质体最重要特性：具有彼此融合的能力,细胞融合（cell fusion)，又称体细胞杂交（somatic hybridiazation），是指两个或更多个相同或不同细胞通过膜 融合形成单
2、个细胞的过程。,细胞融合（cell fusion)，又称体细胞杂交（soma,Muller于1838年观察到脊椎动的肿瘤细胞能在体内自发地融合产生多核的肿瘤细胞。Virchow于1858年描述了正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。Luginbuhl于1873年观察到天花病人的血液中也有多核的血细胞存在。Lange于1875年第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞发生融合的过程。Cienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在无脊椎动中发现了细胞合并现象。1958年日本学者冈田（Okada）发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应。1974年华裔加拿大
3、学者高国楠创立了聚乙二醇（PEG）化学融合法。1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌预定单克隆抗体的杂交瘤细胞。20世纪80年代出现了电融合技术。,细胞融合研究进展,Muller于1838年观察到脊椎动的肿瘤细胞能在体内自发地,几种细胞融合成功的例子,生物种类细胞来源成功年代烟草两个种间叶叶1972几种细胞,动物细胞融合实验使用的小白鼠,动物细胞融合实验使用的小白鼠,动植物细胞的融合过程,植物细胞融合过程,人造小鼠培育过程示意图,动植物细胞的融合过程植物细胞融合过程人造小鼠培育过程示意图,细胞融合的意义,理论上说任何细胞，都有可能通过体细胞
4、杂交而成为新的生物资源。这 对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种间 的遗传物质交换提供了有效途径。体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分 裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体DNA亦可发生重组，从而产生新 的核外遗传系统。淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的制备。,细胞融合的意义理论上说任何细胞，都有可能通过体细胞杂交而成为,细胞融合的基本原理,细胞融合的基本原理,显微镜下细胞融合过程,显微镜下细胞融合过程,融合过程中两个细胞膜从彼此接触到破裂形成细胞桥的变化过程图解,融合过程中两个细胞膜从彼此接触到破裂形成细胞桥的
5、变化过程图解,用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图,用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图,细胞融合的常用方法,细胞融合的常用方法,自发融合在酶解细胞壁过程中，有些相邻的原生质体能彼此融合形成同核体，每个同核体包含240个核，这种类型的原生质体融合叫自发融合。原理：由不同细胞间的胞间连丝的扩展和粘连造成用药物切断胞间连丝可减少自发融合的频率,自发融合,一、仙台病毒法,仙台病毒诱导细胞融合经四个阶段：两种细胞在一起培养，加入病毒，在4条件下病毒附着在细胞 膜上。并使两细胞相互凝聚；在37中，病毒与细胞膜发生反应，细胞膜受到破环，此时需 要Ca2+和Mg2+，最适PH为8.0一8.2；细胞膜
6、连接部穿通，周边连接部修复，此时需Ca2+和ATP；融合成巨大细胞，仍需ATP 。,一、仙台病毒法仙台病毒诱导细胞融合经四个阶段：,病毒促使细胞融合的主要步骤如下：,两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近；通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜间互相渗透，胞质互相渗透；两个原生质体的细胞核互相融合，两个细胞融为一体；进入正常的细胞分裂途径，分裂成含有两种染色体的杂种细胞。,病毒促使细胞融合的主要步骤如下：两个原生质体或细胞在病毒黏结,用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图,用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图,优点是易得，用法简单，融合效果稳定。聚乙二醇(PEG)结构为：HOH
7、2C（CH20CH2）nCH2OH，分子量大于 200小于6000者均可用作细胞融合剂。PEG浓度以W/W；如将10克PEG与10mlEagLe氏液混合（假定1ml 培养液为1g重)，即成50PEG溶液。PEG经高压灭菌后，与温热的Engle氏液混合。通常用分子量低于1000的PEG作融合剂最好，50PEG溶液能产生 最多杂交细胞。PEG溶液在pH6.0时细胞融合率最高。,二、聚乙二醇（PEG）法,优点是易得，用法简单，融合效果稳定。二、聚乙二醇（PEG）,聚乙二醇（PEG）处理是应用非常广泛的方法。高国楠(1974)用聚乙二醇(PEG)为融合剂诱发大豆与大麦、大豆与玉米、哈加野豌豆与豌豆的融
8、合。此法比病毒更易制备和控制,活性稳定,用PEG作为病毒的替代物诱导细胞融合。在PEG诱导细胞融合的有效浓度范围内(50%55%)对细胞的毒性应进一步减小。异核体形成频率高，可重复性强，毒性低，特异性低。,聚乙二醇（PEG）处理是应用非常广泛的方法。,聚乙二醇（PEG）法细胞融合过程,聚乙二醇（PEG）法细胞融合过程,PEG诱导融合的特点：其优点是融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。其缺点是融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害。,PEG诱导融合的特点：其优点是融合成本低，勿需特殊设备；融合,PEG诱导融合的真正机制不完全明了。可能的作用机制：由于PEG分子具
9、有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成化学键，从而在在质膜之间形成分子桥在相邻原生质体间起分子桥的作用，促进粘连。进而促使质膜的融合使膜紧密接触区电荷重新分配，导致带不同电荷的基团连接，最终引起融合。PEG使膜内蛋白或糖蛋白颗粒凝聚，使脂膜中出现不含蛋白质的双层脂类分子区，膜融合的部位就在这些区域。另外，PEG能增加类脂膜的流动性，也使细胞的核、细胞器发生融合成为可能。,PEG诱导融合的真正机制不完全明了。,聚乙二醇（PEG）法细胞融合步骤（1）将两种不同亲本细胞各5l06混匀；（2）离心沉淀，吸去上清液；（3）加1ml 50PEG溶液，用吸管吹打，使之与细胞接触
10、1分钟；（4）加9ml 培养液，离心沉淀，吸去上清液；（5）加5ml 培养液，分别接种5个直径60mm平皿，每个平皿加培养 液至 5ml，37的CO2培养箱中培养。（6）624小时后，换成选择培养液筛选杂交细胞。,聚乙二醇（PEG）法细胞融合步骤,影响PEG诱导原生质体融合的因素：除了课本所列的11条，原生质体的来源（即其来自什么物种）也可影响诱导的效果。,影响PEG诱导原生质体融合的因素：,三、电融合法,电融合法是80年代出现的细胞融合技术，在直流电脉冲的诱导下，细胞膜表面的氧化还原电位发生改变，使异种细胞粘合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜，形成融合体。电融合法的优
11、点：融合率高、重复性强、对细胞伤害小；装置精巧、方法简单、可在显微镜下观察或录像观察融合过程；免去PEG诱导后的洗涤过程、诱导过程可控性强。,缺点：融合产物少，设备昂贵。,三、电融合法 电融合法是80年代出现的细胞融合技术,电融合的基本过程：细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串；膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。,电融合的基本过程：,电融合诱导法原理示意图,电融合诱导法原理示意图,四、
12、盐类融合法（NaNO3处理）最早获得体细胞杂种的方法，但异核体形成频率不高。盐类融合剂对原生质体的破坏小。今后研究应提高其融合率,使其对液泡化发达的原生质体能够诱发融合。,四、盐类融合法（NaNO3处理）,五、高pH-高浓度钙离子处理Keller首先发现高Ca2+和高pH值可以诱发融合。Melchers用此法将烟草种内2个光敏感突变体诱导融合成功并获得100余株体细胞杂种。提高该方法的使用范围是亟待解决的问题。杂种产量较高，但对有些原生质体系统来说，高pH可能有毒。,五、高pH-高浓度钙离子处理,原生质体融合过程：凝聚作用阶段；粘连、融合阶段；异核或同核体形成阶段注意：凝聚的原生质体未必都能最
13、终融合。膜融合发生的条件：膜的贴近程度相当于分子距离1nm或更小。中和原生质体正常的表面电荷可使凝聚原生质体的质膜紧密接触。高温可引起质膜中脂类分子的紊乱，然后通过在紧密粘连的质膜中脂类分子的互作和混合，导致融合。,化学诱导融合的机制,原生质体融合过程：凝聚作用阶段；粘连、融合阶段；异核或同核体,六、空间细胞融合技术。植物细胞融合过程中由于地球重力的存在,有无液泡的原生质体密度差很大,异源细胞融合率低。在利用动物细胞融合生产单克隆抗体过程中,在地面上由于无法排除地球重力的影响,要提高B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的融合得率相当困难。20世纪80年代以来,在空间材料科学的启发下,试图利用空间微重力条件改
14、进细胞融合技术,六、空间细胞融合技术。,植物融合细胞成长状态对比,左瓶中为太空微重力环境下融合的细胞,右瓶为地面融合的细胞,植物融合细胞成长状态对比左瓶中为太空微重力环境下融合的细胞,几百斤重的太空南瓜,太空辣椒,几百斤重的太空南瓜太空辣椒,融合产物的细胞学 首先形成双核异核体,两个核有可能同步进行第一次有丝分裂，形成2个杂种子细胞（双亲亲缘关系较近）,双亲之一的染色体会逐渐消除。（亲缘关系较远）,融合产物的细胞学两个核有可能同步进行第一次有丝分裂，形成2个,杂种细胞的选择系统,一、互补选择法1.激素自主性互补根据其对外源激素的需求差异,杂种细胞的选择系统一、互补选择法,大学课程植物组织培养1
15、2体细胞杂交-组培课件,2.对培养基反应及对抗性代谢物敏感性互补只有杂种细胞对抗性代谢物不敏感。,2.对培养基反应及对抗性代谢物敏感性互补,3.野生型与白化突变互补两种矮牵牛杂种细胞可以形成绿色愈伤组织（具柔毛）,3.野生型与白化突变互补,4.营养缺陷型突变互补及抗性互补注意：抗性必须为显性,4.营养缺陷型突变互补及抗性互补,二、机械分离法1.根据可见标志选择2.根据荧光标记选择3.低密度植板选择,二、机械分离法,体细胞杂种植株的核型,少数几种是双二倍体，染色体数恰为两个亲本染色体数之和。多数情况下，染色体数会发生偏差。原因为？,1.核质互作2.两个以上原生质体发生了融合3.原生质体自发融合既
16、然这么容易偏差，为什么还要做体细胞杂交？,只要一个亲本的部分染色体能够充分整合到另一个亲本的染色体组中，那么染色体的选择性丢失可能会有其好处。,体细胞杂种植株的核型少数几种是双二倍体，染色体数恰为两个亲本,细胞质杂种,在有性杂交中，细胞质基因组只是来自双亲之一（母本），而在体细胞杂交中，杂种却拥有两个亲本的细胞质基因组。应用细胞融合技术，有可能使两种来源不同的核外遗传成分（细胞器）与一个特定的核基因组结合在一起，这种杂种称作细胞质杂种（cybrid）。,细胞质杂种在有性杂交中，细胞质基因组只是来自双亲之一（母本）,体细胞杂种和胞质杂种的鉴定方法,根据F1植株的形态特征核核型分析，即可对体细胞杂
17、种核胞质杂种进行鉴定。也可应用生化和分子生物学的手段进行鉴定。,体细胞杂种和胞质杂种的鉴定方法,以马铃薯栽培种(S. tuberosum)中薯二号的无性系3#、8#(2n=48,四倍体，中国农科院蔬菜花卉所)和二倍体野生种S. chacoense(2n=24，二倍体)的无菌苗为原生质体来源。试管苗培养采用MS基本培养基(2%蔗糖, 07%琼脂, pH58),每天光照16 h,光强30004000 lx,温度(201)。原生质体融合采用PEG (聚乙二醇)融合6和电融合7的方法,蔡兴奎等，采用野生种S. chacoense与四倍体栽培种进行原生质体融合,旨在获得抗青枯病的新材料,为马铃薯抗青枯病
18、育种提供抗性材料,同时为倍性育种奠定基础,以马铃薯栽培种(S. tuberosum)中薯二号的无性,马铃薯,马铃薯,大学课程植物组织培养12体细胞杂交-组培课件,形态学观察,形态学观察,株型差异,株型差异,大学课程植物组织培养12体细胞杂交-组培课件,大学课程植物组织培养12体细胞杂交-组培课件,大学课程植物组织培养12体细胞杂交-组培课件,通过原生质体摄入细胞器、微生物和DNA进行细胞的遗传饰变,一、叶绿体移殖,研究叶绿体基因组的结构和表达，并通过比较叶绿体和原生质体基因组，研究叶绿体在植物发育中的起源和演化。进行叶绿体移植的试验，并探索叶绿体作为外源基因载体的可能性。,通过原生质体摄入细胞
19、器、微生物和DNA进行细胞的遗传饰变一、,二、核移殖,首只克隆羊多利,二、核移殖首只克隆羊多利,芬兰多塞特白面母绵羊,苏格兰黑面母绵羊,芬兰多塞特白面母绵羊 苏格兰黑面母绵羊,三、微生物移殖共生固氮四、外源DNA的摄入目前可将各种细胞器、DNA、质粒、病毒、细菌等外源遗传物质引入原生质体,从而有可能引起细胞遗传性的改变,为某些珍稀植物的快速繁殖、植物的复壮提供可行的方法,还可应用于种质保存、无性系的快速繁殖和有用物质生产,三、微生物移殖,注意,通过体细胞杂交只能克服受精前有性不亲和障碍。体细胞杂种只能作为变易的一个来源，其真正作用还要与常规育种程序相结合才能发挥出来。,注意通过体细胞杂交只能克
20、服受精前有性不亲和障碍。,存在的问题：细胞融合的确切机理至今仍不清楚。融合后获得的杂种细胞具有染色体异倍性,致使细胞株的遗传性不稳定、植株不育性、畸形、生育迟缓等性状出现；此外,细胞融合也存在伦理方面的问题：如将人的细胞核植入牲畜细胞核内,难免会使牲畜遗传信息传入人的细胞核内,如果用于医疗,将非常危险。但是：了解细胞与细胞融合的机理有望对诸如细胞凋亡、神经系统发生、肿瘤发生、干细胞生物学等生命现象作出诠释,对癌症及传染病进行有效的防护和治疗。人体皮肤细胞与动物卵母细胞融合有望克隆出人类胚胎,用于治疗性克隆研究,获取人类胚胎干细胞,再在体外诱导分化,克隆出人体全身所有组织和器官。,存在的问题：,作业,原生质体融合的几种方法？体细胞杂种植株的鉴定方法的原理及一般程序？,作业原生质体融合的几种方法？,
