基因工程综合性教学实验.docx

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1、基因工程综合性教学实验大肠杆菌碱性磷酸单酯酶基因克隆 表达 纯化吴海珍 王善利赵健 俞建瑛 张惠展华 东 理 工 大 学应用生物学系二五年一月第一部分碱性磷酸单酯酶基因的定位、克隆与表达实 验 流 程 图 碱性磷酸单脂酶基因在染色体DNA上的杂交定位Southern Blotting 碱性磷酸单脂酶基因的体外扩增PCR扩增 PCR体外扩增片段的克隆连接于T-载体连接 连接产物转化大肠杆菌受体菌转化 转化子质粒DNA的抽提快速法制备质粒 转化子的鉴定限制性内切酶酶切 目的转化子DNA的大量制备碱法抽提质粒DNA 酶切回收克隆的目的基因片段回收目的基因 重组表达型质粒的构建连接、转化、鉴定 重组大

2、肠杆菌目的蛋白的表达蛋白电泳 实 验 路 线1 DNA的酶切摘要 本单元主要介绍限制性核酸内切酶的各种特性、酶的保存方法和使用注意点，多种酶联合酶切的常用策略等。1.1实验原理DNA重组技术中的第一步是从不同来源的DNA（染色体DNA或质粒DNA）上将待克隆的DNA片段特异性切下，同时在载体DNA分子（一般为质粒DNA）上打开相对应的缺口，然后将两者连接成重组DNA分子。这一特异性的切割过程常由特定的限制性核酸内切酶来完成。限制性核酸内切酶几乎存在于任何一种原核细菌中，它能在特定位置上催化双链DNA分子的断裂，产生相应的限制性片段。早在20世纪50年代初微生物体内的限制核修饰作用就已发现，10

3、年后细菌的限制和修饰作用的分子机制被阐明。以大肠杆菌为例，在K株和B株中都含有各自不同的限制修饰系统，两种不同来源的噬菌体（lK和lB）长期寄生于各自的宿主细胞中，宿主细胞内的甲基化酶已将其染色体DNA和噬菌体DNA特异性的保护，封闭了自身所产生的限制性核酸内切酶的识别位点，故它们在感染相应的宿主细胞（K株和B株）时DNA不被降解，因此感染频率很高。当它们分别感染其他宿主细胞时，由于没有特异性的保护作用，入侵的DNA分子被宿主细胞的限制性内切酶切割降解，从而感染频率急剧下降，普遍能低一或几个数量极。这一现象普遍存在与原核细菌中。但由于宿主细胞内的降解作用的不完全，入侵的DNA分子总有极少数能完

4、整保留下来并得以在细胞体内复制，而且在复制过程中被宿主细胞的甲基化酶所修饰。这修饰过的DNA分子再重新制备后导入该宿主细胞时，感染频率又能恢复到原来的高位，即限制修饰作用被解除。1.1.1限制性核酸内切酶的分类目前在细菌中发现有600多种限制性核酸内切酶，根据其性质不同可分为三大类（见表1-1）。其中II类限制性核酸内切酶与其所对应的甲基化酶是分离的，不属同一酶分子，而且由于这类酶的识别切割位点比较专一，因此广泛用于DNA的重组实验。I类和III类酶严格地说应该称为限制修饰酶，因为它们的限制性核酸内切活性及甲基化活性都作为亚基的功能单位，包含在同一酶分子中。表1-1各类限制性内切酶的特性I类酶

5、II类酶III类酶酶分子三亚基双功能酶内切酶和甲基化酶分开二亚基双功能酶识别位点二分非对称序列46bp短序列，大多数为回文结构57bp非对称序列切割位点距离识别位点至少1 000bp，无特异性在识别位点中或靠近识别位点在识别位点下游2426bp处限制性反应与甲基化反应互斥分开的反应同时竞争限制作用所需的辅因子ATP、Mg2+、S-腺苷甲硫氨酸Mg2+ATP、Mg2+、S-腺苷甲硫氨酸（非必需）DNA重组中的用途无有无1.1.2 II类限制性核酸内切酶的基本特性II类限制性核酸内切酶是Smith等人于1968年在流感嗜血杆菌d型菌株中发现的。该类酶是一种分子量较小的单体蛋白，其双DNA的识别与切

6、割活性仅需要Mg2+，且识别与切割位点的序列大都具有严格的特异性，因而在DNA重组实验中广泛使用。目前已分离出400余种II类限制性核酸内切酶，鉴定识别及切割位点的有300多种，商品化的酶NEB（New England Biolabs）公司品种最多，达220余种，其中在DNA重组实验中常用的有20多种。这些酶的统一命名由酶来源的生物体名称缩写构成（见图1-1）图1-1 限制性内切酶的命名原则与示例1.1.2.1识别位点II类限制性内切酶的识别位点具有180旋转对称的回文结构，常用的识别序列往往为6个碱基对，例如HindIII的识别序列：其中一部分的识别序列某一或某两位碱基并非严格专一，但都在两

7、种碱基中具有可替代性，这种不专一性并不影响内切酶和甲基化酶的作用位点，只是增加了DNA分子上的酶识别与作用频率，例如AvaI的识别序列就是典型的结构：有的酶识别位点为4或5碱基对，如AluI、HaeIII和Sau3AI（见图1-2）等，在DNA上的出现频率则较高，而象Sau3AI切割DNA后产生的是粘性末端，且与BamHI切割后的粘性末端相同，为大规模克隆提供了可能。实际应用中利用Sau3AI高频现象，结合DNA的部分酶切策略进行研究也是常用的实验手段。图1-2 限制性内切酶的命名原则与示例另外一些不常见的酶识别位点相对较长，在DNA链上出现频率也相对较低，如FseI（5-GGCCGGCC-3

8、），出现频率为1/48 = 1/65kb。实际上由于不同生物体的DNA碱基含量不同，酶的识别位点的分布和频率也不同。大肠杆菌基因组中AT含量较丰富，所以富含AT的识别序列（如DraI：5-TTTAAA-3；PshBI：5-ATTATT-3；SspI：5-AATTAA-3）较为频繁的出现，而链霉菌基因组因GC含量高，相应的富含GC碱基对的识别序列（NaeI：5-GCCGGC-3；SmaI：5-CCCGGG-3；SacII：5-CCGCGG-3）较常见。1.1.2.2粘性末端限制性内切酶切割DNA产生的末端根据被切开的DNA末端性质的不同（不考虑碱基序列）可分两大类：平端和粘端，而后者又可分为3-

9、OH突出或5-P突出两种，分布情况见图1-3，故DNA分子的连接通常发生在同种限制性内切酶酶切后的DNA间。图1-3 DNA酶切产生的三种末端实际上DNA重组应用中，由于不同限内酶酶切能产生相同粘性末端，因此DNA分子的连接可发生在不同限内酶之间，常见的DNA分子连接情况见图1-4。而在重组工作中如没有合适的酶切口产生相同的粘性末端，则可对酶切后的突出粘性末端进行补平，采用平头连接策略。图1-4 DNA粘性末端的连接效果1.1.2.3甲基化影响大多数大肠杆菌菌株中含有Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶，前者可以在GATC序列中腺嘌呤N-6位上引入甲基，后者在CCA/TGC序列的第一个胞嘧啶C-5位

10、置上引入甲基。部分限制性内切酶对甲基化的DNA不能切割，如FbaI和MboI等，一般生物公司提供的内切酶说明中均有说明。而要解除这种限制修饰作用通常有两种方法：（1）选用上述酶的同功酶，如Sau3AI，DNA识别切割位点与MboI相同；但不受甲基化影响；（2）利用甲基化酶缺失的受体细胞进行DNA的制备，如E.coli JM110和链霉菌等，前者Dam和Dcm甲基化酶已敲出，而后者细胞内本就没有甲基化酶，从这些细胞中抽提的DNA就能被上述酶切割。1.1.2.4近末端切割基因工程的操作中经常要对DNA片段进行精细切割，在PCR产物中有些甚至只切割一个碱基对。不同的内切酶对裸露的酶切位点不能切断，因

11、此必需在酶切位点外侧加上一个或几个保护碱基，表1-2中列举了常用的十五种内切酶在不同保护碱基下的切割效果，一般保护碱基大于三个碱基对时能完全切割。但是在有些PCR产物中即使保护碱基大于五时也不一定能被有效切断，这可能是PCR产物纯化中残留的杂质影响酶切或是PCR产物末端聚合不完整。表1-2 DNA末端酶切位点的切断情况Enzyme末端碱基数0123BamHI-+BglII-+ClaI-+EcoRI-+EcoRV-+HindIII-+KpnI-+NcoI-+PstI-+SacI-+SalI+SmaI-+SphI-+XbaI-+XhoI-+-：不能切断；不能完全切断；+：完全切断1.1.3限制性核

12、酸内切酶的使用限制性核酸内切酶在基因工程属常用工具酶，主要用于基因物理图谱的绘制、基因片段的鉴定或获得、用于杂交的DNA探针的制备等，而酶切的条件控制则是非常重要的。1.1.3.1作用条件在DNA的酶切反应中酶切条件是酶切成功的关键，主要影响因素有：（1） 反应温度 常规酶切反应均在37进行，但有些酶的最佳反应温度并不是此温度，如SmaI，最适反应温度为30，故最好根据所选用的酶确定反应温度。当采用联合酶切进行实验时尤其要注意选择的反应温度是否都满足两者的要求，如果有一个酶的最适温度不符，建议分步酶切（见1.1.3.3）。（2） 缓冲体系 厂商提供的限制性核酸内切酶有其相对应的缓冲液，一般的缓

13、冲液种类为4-10种左右，按盐离子浓度可分为三大类：高盐、中盐和低盐。缓冲液配制为10的母液，酶切时稀释10倍。常规酶切中均选用最佳缓冲液进行酶切反应，但联合酶切时，根据厂商提供的联合酶切的缓冲液选择表（宝生物工程公司）选择缓冲液或采用万能缓冲液（Promega）。（3） 反应时间 常规酶切反应时间为1.5小时，但可根据酶切对象和酶的用量将保温时间延长23小时，有时甚至可以过夜。一般来说，在DNA量固定的前提下，长时间酶切所需的酶量可适当减少，所以在大剂量酶切DNA时，可以考虑酶切过夜。另对特殊实验，如对基因组DNA进行部分酶切，则在酶量投入一定的前提下，减少反应时间降低对DNA切割的程度。（

14、4） 加入酶量 在底物（DNA）一定的条件下，酶量投入越多则酶切效果越好。但实验中常常出现酶量加入过多酶切效果反差的现象，这主要是酶的储存液中含有50的甘油，但酶量加入过多，超过酶反应体系的10时，过多的甘油抑制了限制性内切酶活性。因此，在酶切反应时，酶量的加入原则：不超过反应总体积的10，在能切开的条件下加入越少越好（可减少酶的Star活性）。（5） DNA纯度 在满足上述条件下影响酶切效果的主要因素是DNA的纯度，DNA样品中蛋白含量过高、有机溶剂（苯酚或氯仿）的残留、高浓度的RNA等。另外DNA浓度过高也会导致酶切失败，一般DNA的质量浓度在1mg/ml体系中能取得好的酶切效果。当发生不

15、明原因的酶切失败时，常用的解决方法是采用稀释酶切，即将酶切体系放大（如从15ml-30ml），将杂质相对浓度稀释，这样不需多增加酶量就能取得较好的酶切效果1.1.3.2酶切方式酶切方式可分为部分酶切与完全酶切：（1） 部分酶切 指的是同一DNA片段上的位点有些被切开而另一些未被切开，此法主要用于基因的克隆。在某些基因内部可能有此酶的切点，用完全酶切进行克隆时难以得到完整基因。部分酶切实施方法：a）在不同的时间从同一个酶反应管中取样终止反应，利用时间控制酶切程度，该方法比较繁琐，不易掌握得恰到好处；b）固定酶切的反应温度和反应时间，控制酶的投入量，一般是在反应管中加入不等量稀释的酶，利用不同酶浓

16、度控制酶切程度，该方法因易控制而被广泛应用。（2） 完全酶切 适用于除目的基因克隆以外的绝大多数DNA操作，例如载体的切割，酶切图谱的制作，基因的鉴定与DNA片段的分离等。1.1.3.3双酶切的解决方法在DNA重组实验中，经常会用双酶切（甚至是3个酶切鉴定）鉴定重组子或获得不同粘性末端的DNA片段，而在厂商提供的联合酶切缓冲液表中并不包括所有类型的酶，即使提供了“万能缓冲液”，有些酶的联合酶切也不一定能取得比较好的效果，这里介绍两种通用的解决方法：（1） 分步酶切法 对将进行的两种酶的酶切采用分步的方法，即先选择一个酶，采用此酶的最佳反应条件进行酶切，酶切完全的DNA进行沉淀后再溶解，然后选用

17、第二个酶进行最佳反应。在酶切时，一般选择便宜的酶进行酶切沉淀，而后在进行第二个酶的酶切反应。此方法通用性较强，联合酶切也比较完全，但较耗时，而且DNA在沉淀时后有部分损失，要求开始时DNA的投入量要比较高。（2） 同步酶切法 取两种酶的最佳缓冲液各50加入到酶切反应体系中，并同时加入两种酶进行反应。特别是对不同厂商提供的酶进行联合酶切时，即可节约时间也可取得比较好的酶切效果。1.1.3.4酶切反应设计在进行酶切反应时，首先要确定需切割的DNA量，根据DNA 的量确定总反应体系和酶量（最多占1/10），一般体系如下：total(ml) ddH2O(ml)10Buffer(ml)Enzyme(ml

18、)DNA(50ng/ml)20 14.520.53一般较好的酶切体系DNA的投入量不高于1.5mg/50ml，当DNA的投入量为1.5mg/20ml时酶切将发生困难。加样顺序：水-缓冲液-DNA-酶。各组分加完后要混合均匀，并用离心机低转速将溶液离心至管底。1.1.3.4酶切失败的原因及处理办法酶切失败主要表现为两方面：（1） 不完全酶切甚至是DNA基本未发生酶切；主要原因有：a）缓冲体系不合适，可进行重新酶切；b）酶量加入过多而导致甘油抑制酶活，可将反应体系适当稀释；c）DNA样品杂质含量高，可采用稀释酶切或将DNA样品重新抽提后酶切（2） DNA被降解（不成带状）；主要原因是DNA样品中含

19、有痕量的DNA酶，建议重新抽提除去DNA酶。1.2试剂与器材1. 试剂（1）常用的限制性内切酶（2）酶切缓冲液，购酶时附（3）无菌双蒸水（4）DNA样品2. 器材（1）eppendorf管（2）枪头（3）恒温水浴（4）移液器1.3实验步骤2 DNA的凝胶电泳摘要 本单元主要介绍DNA电泳的基本原理及各种影响因素，学习制胶，电泳等基本分析技术。2.1 实验原理DNA电泳是基因工程中最基本的技术，DNA制备及浓度测定、目的DNA片段的分离，重组子的酶切鉴定等均需要电泳完成。根据分离的DNA大小及类型的不同，DNA电泳主要分两类：（1）聚丙烯酰胺凝胶电泳 适合分离1kb以下的片段，最高分辨率可达1b

20、p，也用于分离寡核苷酸，在引物的纯化中也常用此中凝胶进行纯化，也称PAGE纯化。（2）琼脂糖凝胶电泳 可分离的DNA片段大小因胶浓度的不同而异，胶浓度为0.50.6%的凝胶可以分离的DNA片段范围为20bp50kb。电泳结果用溴化乙锭（EB）染色后可直接在紫外下观察，并且可观察的DNA条带浓度为纳克级，而且整个过程一般1小时即可完成。由于该方法操作的简便和快速，在基因工程中较常用。2.1.1 琼脂糖凝胶琼脂糖是从琼脂中分离得到，由1，3连接的吡喃型b-D-半乳糖和1，4连接的3，6脱水吡喃型阿a-L-半乳糖组成，形成相对分子量为104105的长链。琼脂糖加热溶解后分子呈随机线团状分布，当温度降

21、低时链间糖分子上的羟基通过氢键作用相连接，形成孔径结构，而随着琼脂糖浓度不同形成不同大小的孔径。表2-1给出了不同浓度凝胶对DNA片段的线性分离范围。表2-1不同类型琼脂糖分离DNA片段大小的范围琼脂糖/标准高强度低熔点低粘度低熔点0.30.5700bp25kb0.8500bp15kb800bp10kb800bp10kb1.0250bp12kb400bp8kb400bp8kb1.2150bp6kb300bp7kb300bp7kb1.580bp4kb200bp4kb200bp4kb2.0100bp3kb100bp3kb3.0500bp1kb500bp1kb4.0100bp500bp6.010bp

22、100bp由于琼脂糖凝胶是通过氢键的作用，因此过酸或过碱等破坏氢键形成的方法常用于凝胶的再溶化，象NaClO4能用于凝胶的裂解，一般的凝胶回收试剂盒利用的也是这一原理。随着实验技术的发展，也针对不同用途开发了各种类型的琼脂糖凝胶：（1）低熔点琼脂糖凝胶，用于DNA片段的回收，且由于该种凝胶中无抑制酶，可在胶中进行酶切、连接等；（2）高熔点凝胶，可分离小于1kb的DNA片段，专用于PCR产物的分析；（3）快速凝胶，电泳速度比普通凝胶中快一倍，可节省实验时间；（4）？，适用于DNA大片段的分离。（5）其它类型。各生产商还开发很多类型的凝胶，可根据实验要求选择不同类型的，选择原则是考虑合适的机械强度

23、和熔点。2.1.2 DNA电泳影响因素DNA为碱性物质，在电泳（缓冲液pH=8）时带负电荷，在一定的电场力作用下向正极泳动。而DNA链上的负电荷伴随着DNA分子量的增加而增加，荷质比是一常数，故电泳中DNA的分离类似分子筛效应。电泳中影响DNA分子泳动的因素很多，主要分两方面：DNA分子特性和电泳条件。（1） DNA分子大小 DNA分子越大在胶中的摩擦阻力就越大，泳动也越慢，迁移速率与线状DNA分子质量的对数值成反比。（2） DNA分子构型 对于质粒DNA分子即使具有相同分子质量，因构型不同也会造成电泳时受到的阻力不同，最终造成泳动速率的不同。常规电泳中质粒DNA分子的3种构型泳动速率：超螺旋

24、最快、线状分子次之，开环分子最慢。（3） 不同的胶浓度 对于同种DNA分子胶浓度越高，电泳速率越慢。不同胶浓度对于DNA片段呈线性关系有所区别，浓度较稀的胶线性范围较宽，而浓的胶对小分子DNA片段呈现较好的线性关系。所以常规实验中对于小片段DNA分子的分离采用高浓度的胶分离（有时甚至用2的凝胶），而对于分离大片段则用低浓度的凝胶。（4） 电场强度 电泳时为了尽快得到实验结果，所用的电场强度约为5V/cm，这样的场强下虽能得到结果，但分辨率不高。在精确测定DNA分子大小时，应降低电压至1V/cm。电场强度偏高时电泳分离的线性范围会变窄，电压过高时也会由于电泳中产生的大量热量导致DNA片段的降解。

25、实验中要根据需要选择合适电压，如对于DNA大片段的分离可适当选择较低电压进行（在Southern杂交中的DNA电泳），避免托尾现象的产生；而对于小分子DNA，由于其在凝胶中的快速扩散会导致条带模糊，可选用相对较高的电泳以缩短电泳时间。 （5） 溴化乙锭 简称EB，电泳中的染色剂，具有扁平结构，能嵌入到DNA碱基对间，对线状分子与开环分子影响较小而对超螺旋态的分子影响较大。当DNA分子中嵌入的EB分子逐渐增多时，原来为负超螺旋状态的分子开始向共价闭合环状转变，电泳迁移速度由快变慢；当嵌入的EB分子进一步增加时，DNA分子由共价闭合环状向正超螺旋状态转变，这时电泳迁移速率又由慢变快。这个临界点的游

26、离EB质量浓度为0.1mg/ml0.5mg/ml，即电泳时所加的浓度。因此一般电泳可以忽略此因素，而对于特殊电泳，消除此因素影响可采用电泳后染色。（6） 电泳缓冲液 目前有3种缓冲液适用于天然双链DNA的电泳：TAE、TBE和TPE，其组成及特点见表2.2。一般常用的DNA电泳选用TAE较多，其电泳时间较快，而且成本比较低，但是其缓冲容量较低，需经常更换电泳液。表2.2常用DNA电泳缓冲液缓冲液存储液组成成份/L特点及用途TAE50双链DNA分子的泳动速率比另两者快10%242gTris超螺旋在其中电泳时更符合实际分子质量57.1ml 冰乙酸回收DNA片段时首选，大片段分离效果好100ml 0

27、.5mol/L EDTA (pH8.0)缓冲容量小，过夜电泳不可选用TBE5小片段（10 kb）当上样量超过200ng就有可能产生托尾现象。2.1.5 DNA电泳的标准分子量目前各厂商开发了各种类型的标准分子量，有广泛用于PCR产物鉴定的小分子Marker，也有常规用的大分子Marker，图2-1为TAKARA公司提供的DNA标准分子量电泳（示意）图。 图2-1 常用的DNA标准分子量电泳图2.2 试剂与器材1. 试剂（1）50TAE电泳缓冲液242.0g Tris碱100ml 0.5mol/EDTA（pH=8.0）57.1ml 冰醋酸（2）EB母液（1mg/ml）称取一定量的EB溶于无菌水中

28、，室温避光保存凝胶中浓度为0.5mg/mlEB为强诱变剂，实验中要防止污染（3）DNA标准分子量（自制）片段大小依次为：0.5，1.1，1.6，2.7，3.1，4.1，5.4，9.4和17单次电泳电样量34ml即可，回收电泳加倍（4）10Loading buffer（pH7.0）EDTA50mM甘油60%Xylene Cyanol FF（W/V）0.25%Bromophenol Blue（W/V）0.25%（5）无菌双蒸水（6）琼脂糖2. 器材（1）eppendorf管（2）枪头（3）移液器（4）电泳槽（5）电泳仪（6）微波炉（7）电泳板和梳子（8）紫外投射分析仪（9）数码相机（带紫外滤色镜和

29、近射镜）2.3实验步骤(1) 用1TAEBuffer按照被分离DNA分子的大小配制一定浓度(0.7%)的琼脂糖凝胶50ml，在微波炉中加热至琼脂糖溶解。(2) 待溶液冷却至50左右，加入溴化乙锭（贮存液: 用水配制为1mg/ml）至终浓为0.5mg/ml充分混匀。(3) 用透明胶封固玻璃板两头，在距底板0.51.0mm的位置上放置梳子，将温热的琼脂糖凝胶倒入胶模中，凝胶厚度在35mm之间。(4) 在凝胶完全凝固后，撕去透明胶，小心地将玻璃板移至装有1TAE缓冲液的电泳槽中，轻轻地拔去梳子，且使缓冲液没过胶面约1mm。(5) DNA样品与10Loading-buffer(含有溴酚蓝和甘油等物质)

30、混合后，用微量取样器慢慢将混合物加至样品槽中。(6) 盖上电泳槽并通电，使DNA向阳极（红线）移动，采用电压为80100V。(7) 溴酚蓝在凝胶中移出适当距离后切断电流，取出玻璃板，在紫外灯下观查凝胶。（注：对于DNA片段回收的电泳一般建议采用0.6%低浓度的凝胶，而且采用的电泳液需第一次使用，电泳槽要洗净）3 DNA的制备摘要 本单元主要介绍质粒DNA和细菌染色体DNA的常规制备方法，要求学会根据不同实验需求选择不同实验方法。3.1实验原理3.1.1质粒DNA的基本特性质粒（Plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于

31、宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活，而宿主即使没有它们也可以正常存活。质粒的存在使宿主具有一些额外的特性，如对抗生素的抗性等。F质粒（又称F因子或性质粒）、R质粒（抗药性因子）和Col质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。质粒在细胞内的复制一般有两种类型：紧密控制型（Stringent control）和松驰控制型(Relaxed control)。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，当染色体不复制时，它也不能复

32、制，通常每个细胞内只含有1个或几个质粒分子，如F因子。后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中有许多拷贝，一般在20个以上，如ColE1质粒。在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时，细胞内蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制，紧密型质粒复制停止，而松驰型质粒继续复制，质粒拷贝数可由原来20多个扩增至1000-3000个，此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-50%。利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在，当两种质粒同时导入同一细胞时，它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争，在一些细胞中，一种质粒占优势，而在另一些细胞中另一种质粒却占上风

33、。当细胞生长几代后，占少数的质粒将会丢失，因而在细胞后代中只有两种质粒的一种，这种现象称质粒的不相容性（Incompatibility）。但利用不同复制系统的质粒则可以稳定地共存于同一宿主细胞中。质粒通常含有编码某些酶的基因，其表型包括对抗生素的抗性，产生某些抗生素，降解复杂有机物，产生大肠杆菌素和肠毒素及某些限制性内切酶与修饰酶等。质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。与天然质粒相比，质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因（如抗生素抗性基因）和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量尽可能减少，以便于基因工

34、程操作。大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列，这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：（1）分子量小、多拷贝、松驰控制型；（2）具有多种常用的限制性内切酶的单切点；（3）能插入较大的外源DNA片段；（4）具有容易操作的检测表型。常用的质粒载体大小一般在1kb至10kb之间，如pBR322、pUC系列、pGEM系列和pBluescript（简称pBS）等。表3-1列举了不同复制子类型的质粒。表3-1 常见质粒特性及复制子类型质粒复制子类型拷贝数用途pBR3

35、22pMB11520早期克隆载体pUC系列pMB1（改良）500700常规克隆载体pET系列pMB11520常规表达载体（T7）pGEM系列pMB1（改良）300700克隆与表达载体（T7）pSP系列pMB1（改良）300700克隆与表达载体（T7）3.1.2质粒DNA抽提的基本原理在细菌细胞内，共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中，除了超螺旋DNA外，还会产生其它形式的质粒DNA。如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成松驰型的环状分子，称开环DNA(Open circular DNA，简称 ocDNA)；如果质粒DNA的两条链在同一处断裂

36、，则形成线状DNA(Linear DNA)。当提取的质粒DNA电泳时，同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。3.1.2.1 碱裂解法质粒DNA的抽提主要包括3个基本步骤：裂解细胞、分离和纯化质粒DNA。（1）裂解细胞基本上先加入溶菌酶作用一段时间，破壁后再加入非离子型去污剂或直接加入碱性SDS等以及作煮沸处理，以便破壁与膜，处理的同时也能去除细胞碎片、染色体DNA等杂质。非离子去污剂法较温和，适用于抽提10kb左右的质粒；而煮沸法与碱性SDS法相对较剧烈，只能抽提小于10kb的质粒。本实验采用碱性SDS法。（2）分离细菌基因组均比较大，如大肠杆菌的染色体约有470

37、0 kb长，在处理细胞过程中断裂成不同长度的双链DNA片段。当溶液的pH值调节到大于12时，双链DNA中的氢键被破坏，于是染色体DNA双链分离成单链；而超螺旋状态的质粒DNA仅仅部分氢键被破坏，只是部分双链解离成单链。再将溶液的pH值调回中性时，单链DNA互相缠绕并且与蛋白质结合生成网络状大分子，而超螺旋的质粒发生复性反应后仍然是小分子，通过离心很容易将两者分开。达到分离的目的。（3）纯化细胞裂解液中的杂质除了染色体DNA外，还有各种细胞壁、膜的碎片、各种酶与其他蛋白质、脂质类杂质以及RNA等。纯化步骤应有针对性地将它们去除。离心去除各种细胞碎片；用酚处理去除蛋白质，包括各种酶；用RNA酶处理

38、去除RNA等。酚是一种作用非常强烈的蛋白质变性剂，能非常有效地是蛋白质变性进而去除。氯仿有强烈的溶脂性，可去除脂质类杂质。酚/氯仿可节约重蒸酚。氯仿能将微量的溶于DNA水溶液中的酚抽提掉，否则微量的酚对于以后的酶切、转化等过程都会产生不利影响。抽提完成后的水溶液中仍有痕量的酚、氯仿等，可用乙醇沉淀的方法将它们除去。乙醇沉淀的特点是能在浓缩DNA的同时更换整个缓冲系统，但DNA会有一定的损失。由于杂质不易在乙醇中沉下，沉淀过程可在0进行。乙醇较异丙醇易挥发，沉淀得到的DNA比较干净。盐等杂质易在异丙醇中沉下。沉淀DNA时加入盐类的目的是中和链上的电荷，使DNA易于形成沉淀。该方法抽提质粒主要的试

39、剂为溶液I、II和III，其在抽提质粒DNA中的作用如下：溶液I：由葡萄糖、EDTA、TrisCl组成。葡萄糖的作用是增加溶液的粘度，减少抽提过程中的机械剪切作用，防止破坏质粒DNA；EDTA的作用是络和掉Mg2+等二价金属离子，防止DNA酶对质粒分子的降解作用；TrisCl能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围。溶液II：由SDS与NaOH组成。SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性；NaOH(pH12)的作用是破坏氢键，使DNA分子变性。溶液III：由KAc与HAc组成，是pH值为5.5的高盐溶液。能中和溶液II的碱性，使染色体DNA复性而发生缠绕并使质粒DNA复性。K+离子会与

40、SDS形成溶解度很低的盐并与蛋白质形成沉淀而除去。溶液中的染色体DNA也会与蛋白质-SDS形成相互缠绕的大分子物质，很容易与小分子的质粒DNA分离，此外，高盐溶液也有利于各种沉淀的形成。3.1.2.2 煮沸法质粒DNA的抽提煮沸裂解法是将细菌悬浮在含有能消化细胞壁的溶菌酶的缓冲液中，然后加热到100使其裂解。加热除了能破坏细菌外壁，还有助于解开DNA链的碱基配对，并使蛋白质和染色体DNA变性。但是闭环质粒DNA链彼此不会分离，这是因为它们的磷酸二酯骨架具有互相缠绕的拓扑结构。当温度下降后闭环DNA的碱基又各就各位，形成超螺旋分子。离心除去变性的染色体DNA和蛋白质，就可以从上清中回收质粒DNA

41、。煮沸裂解法对于小于15kb的小质粒抽提非常有效。但对于那些经变性剂，溶菌酶及加热处理后能释放大量碳水化合物的大肠杆菌菌株，则不推荐使用该法。这是因为碳水化合物很难除去，会抑制限制酶和聚合酶的活性。大肠杆菌菌株HB101及其衍生菌株（其中包括TG1）能产生大量的碳水化合物，不适用于煮沸法裂解。该方法的优点是可以快速省时获得一定量的质粒DNA，用于酶切鉴定。3.1.3基因组DNA抽提的基本原理基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交（包括RFLP）及PCR分离基因等。利用基因组DNA较长的特性，可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分

42、子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中，可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部，从而达到提取的目的。在提取过程中，染色体会发生机械断裂，产生大小不同的片段，因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作，如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓，以保证得到较长的DNA。一般来说，构建基因组文库，初始DNA长度必须在100kb以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RFLP和PCR分析，DNA长度可短至50kb，在该长度以上，可保证酶切后产生RFLP片段（20kb以下），并可保证包含PCR所扩增的片段（一般2kb以下）。不同生物（植物、动物、微生物）的基因组D

43、NA的提取方法有所不同，不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法，以获得可用的DNA大分子。尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用，因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时，应考虑除去多糖和酚类物质。目前针对不同类型的细胞均开发除了相应的抽提试剂盒。常规实验中从细菌基因组上PCR扩增目的基因时，一般所用的DNA量较少，可以采用较简单的沸水浴裂解法制备少量的DNA。在短时间的热脉冲下，细胞膜表面会出现一些孔洞，此时就会有少量的染色体DNA从中渗透出来，然后离心去除菌体碎片，上清中所含的基因组DNA即可用于PCR模板。而对于大量的基因组DNA制备（如Southern Blotting，需大量基因组），可采用试剂盒抽提。3.2 试剂与器材1. 试剂（1）溶液I碱溶法抽提质粒DNA葡萄糖50mMTris-HCl50mMEDTA10mM