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1、内切葡聚糖酶基因在巨大芽孢杆菌中重组表达载体的构建生物科学 2003 级 廖俊华16指导教师 陈 惠 教 授摘要：以生物化学与分子生物学实验室克隆并测序的枯草芽孢杆菌C-36内切葡聚糖酶基因（Genbank 登录号：DQ782954）为模板，通过PCR将编码信号肽的序列去除，然后与pMD18-T Vector克隆载体连接，构建pMD18-T Vector亚克隆载体。对pMD18-T Vector质粒先进行Bgl单酶切，回收后再进行Sph单酶切，通过两次单酶切胶回收内切葡聚糖酶基因（不含信号肽），并构建巨大芽孢杆菌重组表达载体pHEC-End，将重组表达载体转化到大肠杆菌DH5中。通过对转化子进
2、行菌落PCR和质粒的酶切检测证明成功构建了内切葡聚糖酶的巨大芽孢杆菌表达载体。关键词：巨大芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌， 内切葡聚糖酶 ，重组表达载体Construction of eukaryotic Expression Vector of the gene of endoglucanase in Bacillus MegateriumLIAO Jun-hua Biological Science, Grade 2003Directed by Chen Hui( Prof)Abstract: By the way of PCR, the sequence coming from endogluc
3、anase gene (Genbank No. DQ782954 ) in B.subtilis C-36 strain and coding for the signal peptide of endoglucanase was removed.The endoglucanase gene was cloned and sequenced in the Laboratory of Biochemistry and Molecular Biology.Then the gene without the signal peptide sequence was ligated with the c
4、lone plasmid pMD18-T.The pMD18-T Vector was constructed. First, the pasmid was cuted by Bgl.Then,the pasmid was cuted by Sph.By double enzyme-cut , the gene of endoglucanase in B.subtilis C-36 strain without signal peptide was recived. The eukaryotic expression vector pHEC-End was constructed.Eventu
5、ally, the eukaryotic expression vector was transformed into competent E.coli DH5 . By the way of colony PCR and restriction enzyme digesting analysis, the eukaryotic expression vector of the gene of endoglucanase in Bacillus Megaterium was constructed succesfully.Keywords: Bacillus Megaterium，Bacill
6、us subtilis，endoglucanase，eukaryotic expression vector纤维素酶是一类能够降解纤维素，使之生成纤维二糖、葡萄糖等一系列酶的总称，按各酶功能的不同可以分为内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和-葡萄糖苷酶三大类1。纤维素被它降解后可转化为人类急需的能源、食物、化工原料，对于人类社会解决食物短缺和能源危机具有重大的现实意义2。随着中性纤维素酶和碱性纤维素酶在棉织品水洗整理工艺及洗涤剂工业中的成功应用，细菌纤维素酶制剂已显示出良好的使用性能和巨大的经济价值3。纤维素酶成本高以及酶活力低已成为制约纤维素酶广泛应用的两大瓶颈，因此，构建高效表达的基因工程菌是降低
7、纤维素酶成本、提高产量的有效手段。几乎所有已克隆到的纤维素酶基因都在大肠杆菌中得到了表达，但是都几乎存在着表达量低、分离提纯困难的缺陷。而芽孢杆菌因具有独特的蛋白分泌系统，使得在表达外源蛋白的宿主菌中深受青睐。其中枯草芽孢杆菌是应用较广泛的一种外源蛋白表达系统，并且已用于商业化生产酶制剂，例如，Genecor 厂家就以该菌作为生产碱性蛋白酶的工程菌4。近年来，巨大芽孢杆菌也在这方面显示出了较好的应用前景，与枯草芽孢杆菌相比，巨大芽孢杆菌还具有两大优点：首先是它不具有碱性蛋白酶，从而使外源蛋白能很好的表达而不被降解；再次是重组质粒能够在宿主菌中稳定存在5。有很多蛋白已经成功地在巨大芽孢杆菌中得到
8、过量表达，如：Rygus和Hillen6（1991）在巨大芽孢杆菌中成功地表达了四种外源蛋白基因，在木糖操作子的调控下，这些基因的表达提高130到350倍不等，且未发现蛋白酶水解情况。目前还未见有关在巨大芽孢杆菌中表达内切葡聚糖酶的报道，四川农业大学生物化学实验室通过自行筛选得到一株产内切葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌并克隆到了编码该酶的基因（Genbank No. DQ782954），拟在此基础上构建该基因的巨大芽孢杆菌表达载体，实现该基因在巨大芽孢杆菌中的分泌表达。本实验将不含信号肽枯草芽孢杆菌C-36内切葡聚糖酶基因与巨大芽孢杆菌表达载体pHIS1525进行连接，构建重组表达载体，使之能在表达载
9、体自身信号肽的引导下进行融合表达，为进一步研究枯草芽孢杆菌C-36内切葡聚糖酶基因在巨大芽孢杆菌中的高效表达及基因工程菌投入生产奠定基础。1 材料与方法1.1 菌株及载体：本工作所使用的菌株和质粒见表1。表1 实验所用的菌株及质粒Tab 1 The strain and plasmid used in the experimentstrain/plasmidCharacteristicssourceJM109recA1 supE44 endA1 hsdR17 gyrA96 relA1 thi(lac-proAB)FStored in this labDH5supE44lacU169(80lac
10、ZM15) recA1Stored in this labpMD18-T VectorAmpr lacZTaKaRa BiotechnologypHIS1525Tetr Ampr xylR PxylAMoBiTecB3 plasmidpMD18-T Vector including the endoglucanase gene Constructed in this lab1.2 分子生物学试剂：引物由上海英俊生物技术有限公司合成；BglII、SphI、重组Taq DNA Polymerase、dNTP、T4 DNA Ligase、pMD18-T Vector购自TaKaRa Biotechn
11、ology；质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒、DNA Marker III、DNA Marker VII、DNA/Hind III购自天为时代；氨苄青霉素购自上海生工。1.3 主要药品NaCl、胰蛋白胨、酵母浸出粉、琼脂粉、琼脂糖、0.1mol/L CaCl2、甘油（终浓度为30%）。1.4 主要仪器：电热恒温培养箱、HZQ-F全温振荡培养箱、酸碱pH计、TGL-16G台式普通离心机、板式电泳槽、电热恒温水浴锅、PCR仪、凝胶成像仪等。1.5 培养基、抗生素贮存液及琼脂糖电泳缓冲液：LB培养基：1%胰蛋白胨，1% NaCl，0.5%酵母浸出粉，pH7.0（用1mol/L的NaOH调PH值）；配制
12、固体培养基时需加入1.5%-2.0%的琼脂粉；配制抗生素培养基时需加入氨苄青霉素（终浓度为100g/mL）。氨苄青霉素（Amp）贮存液7：100g/mL（溶于双蒸水中），过滤除菌，小份分装（1mL/份）后，-20保存。琼脂糖电泳缓冲液8：5TBE贮存液：54g Tris碱，27.5g硼酸，20mL 0.5mol/L EDTA（pH8.0），溶于1L去离子水，用时稀释10倍。0.5mol/L EDTA（pH8.0）：将186.1g二水乙二胺四乙酸（EDTA-Na.2H2O）加入800mL水中，用磁力搅拌器剧烈搅拌，用NaOH调节pH至8.0，定容至1L。0.7%的琼脂糖凝胶：称取0.7g琼脂糖于
13、100 mL 0.5TBE中，用微波炉加热置溶液澄清为止，然后加入5L的Gold View核酸染料，混匀即可用。1.6 方法.1.6.1 引物的设计：根据已经克隆并测序的内切葡聚糖酶基因（Genbank 登录号：DQ782954），结合信号肽预测结果，应用Primer premier5.0软件设计一对引物，使其通过PCR去掉该基因自身信号肽编码序列，同时加入适当的酶切位点（BglII、SphI），使其能够通过连接将该基因置于表达载体信号肽编码序列之后（表达载体pHIS1525的多克隆位点序列如图1），且保证正确的阅读框。已经预测的枯草芽孢杆菌C-36内切葡聚糖酶蛋白序列信号肽切割位点在29位和
14、30位氨基酸残基之间，成熟蛋白为470氨基酸多肽，因此设计引物如下：上游引物（P1）：5AGATCTCAGCAGAGACAAAAACGCCAGT 3下游引物（P2）：5GCATGCCTAATTTGGTTCTGTTCCCCAA 3下划线是引入的酶切位点，分别是Bgl、Sph；A是为了不改变阅读框而引入的碱基。图1 pHIS1525的多克隆位点序列Fig1 Sequence of the multiple cloning sites(MCS)of pHIS15251.6.2 目的基因的获得：1.6.2.1 B3质粒的提取及其PCR接种一环B3菌株于10mL LB液体培养基中，37200r/min培
15、养过夜，用质粒提取试剂盒按操作说明提取B3质粒9。以提取的B3质粒为模板根据设计合成的引物进行PCR10，通过PCR获得目的基因，其反应体系如表2：表2 PCR反应体系Table 2 Composition of PCR试剂名称 用量ddH2O 32.5L10PCR buffer 5.0L25mmol/L MgCl2 2.0LP1 1.0L P2 1.0LdNTP mixture 6.0L模板DNA 2.0L Taq 聚合酶 0.5LTotal volume50.0L按上述顺序加入各组分后混合均匀，PCR反应参数为：94预变性2 min，94变性1min，65退火1min，72延伸90s，30
16、个循环后，72再延伸10min，4保存。反应结束后取3LPCR产物进行0.7%琼脂糖凝胶电泳检测。1.6.2.2 PCR产物的纯化由于克隆需要的DNA片段需要较高的纯度，PCR产物需经过琼脂糖凝胶电泳充分分离后，利用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒从凝胶中回收目的DNA片段11。1.6.3 目的基因的克隆:1.6.3.1 大肠杆菌JM109（或DH5）感受态细胞的制备：参照分子克隆试验指南（第三版），采用氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞，具体方法如下： 挑取一环E.coli JM109（或DH5）菌株在LB平板上划线37培养后，挑取单菌落转到10mL LB液体培养基中，37200r/min培养过夜
17、； 将上述培养液按2%接种量接种到50mL LB液体培养基中37200r/min振荡培养2-3小时； 将培养后的菌液置冰浴中10min后转移到无菌的50mL离心管中，44000r/min离心10min，去掉上清液，将管倒置1min使痕量培养液流尽； 向管中加入20mL无菌的预冷的0.1mol/LCaCl2溶液重新悬浮菌体，44000r/min离心10 min，去掉上清液； 向管中加入2mL无菌的预冷的0.1mol/LCaCl2溶液重新悬浮菌体； 刚做的感受态细胞可直接用于转化试验，也可将剩余的感受态细胞加入终浓度为30%的甘油分装于1.5mL离心管（100L/管）置-70保存。1.6.3.2
18、连接与转化1.6.3.2.1 连接：（连接体系12如表3）表3 目的基因与pMD18-T Vector克隆载体的连接体系Table 3 The ligation systerm试剂名称 用量胶回收PCR产物 5 LpMD18-T Vector 1 L Ligation Mix 4 LTotal volume10L将该反应管置PCR仪16保温3 h。1.6.3.2.2 转化：（转化方法13如下所述） 取装有100L E.coli JM109感受态细胞的1.5mL离心管一支，置冰浴中解冻； 将上述连接好的连接液全部加入到上述离心管中，并用加样器轻轻混合均匀； 将离心管放置冰浴中静置30min； 3
19、0 min后将离心管放置42恒温水浴中静置2min； 迅速将离心管置冰浴中静置5min； 向离心管中加入890L LB液体培养基置37培养箱培养90min，使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素抗性标记基因； 取培养后的菌液200L用玻棒涂布在含有100g/mL氨苄青霉素的LB平板上，将平板置37直至液体被吸收后将平板倒置继续培养12-16 h后可出现菌落。1.6.3.3阳性克隆菌株的筛选及鉴定将涂布在抗性平板上长出的菌落，挑取大小适中的单菌落进行菌落PCR鉴定，反应体系如表2。按表2所述体系先加入各组分液体后混匀，再分装在0.2mLPCR管中，每管装25L，最后用牙签挑取适量的单菌落作为模板，PC
20、R反应参数为同1.6.2.1所述，有一点不同就是：94预变性需5 min。反应结束后取3LPCR产物进行0.7%琼脂糖凝胶电泳检测，能够扩增出与目的基因大小一致的DNA片段初步认为是阳性克隆菌株。阳性克隆菌株的鉴定14：将初步筛选得到的阳性菌株分别接种10mLLB液体培养基37200r/min培养过夜，用质粒提取试剂盒提取质粒进行酶切鉴定，酶切体系如表4和表5。表4 单酶切 表5 双酶切Table 4 Single Enzyme-cut method Table 5 Double Enzyme-cut method试剂名称 用量试剂名称 用量10H buffer 1.0 L10H buffer
21、 1.0 L质粒DNA 4.0 L质粒DNA 4.0 LBgl/Sph 0.5 LBgl、Sph各0.5 L ddH2O 4.5 L ddH2O 4.0LTotal volume10.0LTotal volume10.0L将上述反应体系置37恒温培养箱酶切过夜，反应完后向各体系中加1L10loading buffer,将其全部点样到0.7%的琼脂糖凝胶中进行电泳检测。将酶切鉴定符合要求的菌株随机取一个（命名为KMQZ3）送TaKaRa宝生物公司测序。1.6.4 表达载体的扩增由于购买的表达载体是以纯质粒的形式提供，需要将其转入大肠杆菌内进行扩增。故先进行表达载体的常规转化，再从大肠杆菌中提取质
22、粒进行后续试验操作。将购买的表达载体pHIS1525（10g）用适量的水（约20L）溶解后，取1L转化大肠杆菌DH5感受态细胞（感受态细胞的制备与转化方法与E.coli JM109相同），在含有100g/mL氨苄青霉素的LB培养基上筛选阳性转化子，并通过提取质粒和酶切进行鉴定，将阳性转化子命名为DH5- pHIS1525。1.6.5 重组表达载体的构建1.6.5.1 内切葡聚糖酶基因（已经去掉信号肽编码序列）的准备挑取一环E.coli JM109（含目的基因）在含氨苄青霉素的LB平板上划线培养过夜，然后挑取单菌落接种10mL含相应抗生素的LB液体培养基，37剧烈振荡培养12-14h后，按质粒提
23、取试剂盒说明进行质粒的提取，提取完后进行琼脂糖凝胶电泳检测提取质量和大致浓度。先将质粒进行BglII单酶切，后进行SphI单酶切，两者酶切体系与方法一致。酶切完后向两管中加入5.5L10loading buffer，最后将两次单酶切的质粒DNA进行琼脂糖凝胶电泳，然后从凝胶中回收所需要的目的条带，其方法与PCR产物的琼脂糖凝胶回收相同，并取5L电泳检测其回收的大致浓度。1.6.5.2 表达载体的准备挑取一环大肠杆菌DH5（含表达载体质粒）在含氨苄青霉素的LB平板上划线培养过夜，然后挑取单菌落接种10mL含相应抗生素的LB液体培养基，37剧烈振荡培养12-14h后，按质粒提取试剂盒操作进行质粒的
24、提取，提取完后进行琼脂糖凝胶电泳检测提取质量和大致浓度。将提取的质粒进行Bgl和Sph双酶切。同样，为了保证酶切后回收的DNA浓度，需做3管该反应体系。将上述反应体系置37恒温培养箱酶切过夜，酶切完后向管中加入5.5L10loading buffer混合均匀，取5L进行电泳检测酶切情况，将其余反应液进行琼脂糖凝胶电泳，然后从凝胶中回收所需要的目的条带，其方法与PCR产物的琼脂糖凝胶回收相同，并取5L电泳检测其回收的大致浓度。1.6.5.3 连接及转化将已经准备好的内切葡聚糖酶基因与表达载体按表6加入进行连接反应：表6 连接体系Table 6 The ligation system表达载体/L目
25、的基因/LT4 DNA ligase/L连接buffer/L超纯水/L总体系/L3523215将上述两个连接体系置PCR仪中16连接过夜，转化时分别取10L连接液分别转化大肠杆菌DH5感受态细胞并涂布在含有100g/mL氨苄青霉素的LB平板上，待菌落长出后，进行菌落PCR、酶切鉴定15,16。2 结果与分析2.1 目的基因的获得以提取的B3质粒为模板根据设计合成的引物进行PCR，获得的PCR产物为不含目的基因信号肽序列的片断，其大小约为1.5Kb，对获得的PCR产物取3L进行电泳，结果见图2。结果表明PCR产物大小与目的基因大小（1500bp）接近。然后对产物进行胶回收，以去掉PCR体系中的引
26、物、模板DNA、酶等杂质，使其纯度满足随后连接要求，回收后取5L进行电泳，结果见图2。图2 PCR扩增产物结果及产物胶回收Fig2 The results of PCR and gel reclaim2.2 目的基因的克隆将胶回收后的目的基因与克隆载体pMD18-T Vector进行连接后转化E.coli JM109感受态细胞，长出菌落后挑取大小均一的菌落进行菌落PCR检测阳性转化子，菌落PCR结果如图3所示。 图3 E.coli JM109转化子的菌落PCR检测Fig3 Identification of recombinant E.coli JM109 by colony PCR从电泳结果
27、可以看出，在挑取的9个转化子中，有8个转化子通过其菌落PCR后得到与目的基因的大小相一致的产物，只有9号转化子未得到PCR产物，说明它是一个假阳性。根据以上菌落PCR结果，在28号转化子中随机挑取一个单菌落（命为KMQZ3）接种10mL LB液体培养基（含100g/mL氨苄青霉素）37剧烈振荡培养12-16h后按质粒提取试剂盒操作提取质粒，分别取3L和5L进行单双酶切鉴定，结果如图4。 图4 E.coli JM109转化子的酶切检测Fig4 Identification of E.coli JM109 recombinant by restriction analysis电泳结果表明：通过双酶
28、切后可以得到与目的基因大小一致的条带，但转化子质粒Sph单酶切后发现了两条条带，和该质粒的双酶切结果一致，经过分析发现其原因是：PCR产物与克隆载体pMD18-T Vector在连接时没有按目的基因的正向顺序进行连接，刚好相反，目的基因反向连接在了克隆载体上，但这不影响本试验的后续试验，酶切结果表明目的基因已经连接到了克隆载体pMD18-T Vector上。2.3 表达载体的扩增购买的表达载体是以冻干的质粒形式提供，按操作手册说明需要将其转入大肠杆菌内进行常规的扩增后再提取质粒进行重组操作，故先进行表达载体的常规转化。将购买的表达载体质粒pHIS1525（约10g）用适量的水（约20L）溶解后
29、，取1L转化大肠杆菌DH5感受态细胞（感受态细胞的制备与转化与E.coli JM109相同），涂布在含有100g/mL氨苄青霉素的LB培养基上，待长出转化子后（约24h），挑取大小均一的单菌落接种10mL LB液体培养基，37剧烈振荡培养12-16h后按质粒提取试剂盒操作提取质粒，再分别取3L和5L进行未酶切和单酶切的鉴定，电泳结果见图5。图5 表达质粒pHIS1525的酶切检测Fig5 Restriction analysis of the plasmid pHIS1525电泳结果表明，未经酶切的pHIS1525质粒其分子量比实际分子量（约7.4Kb）大，但单酶切后分子量符合实际大小，其可能
30、原因是质粒在复制过程中形成了质粒多聚体，单酶切后未发现非特异性切割，说明该质粒是pHIS1525质粒。同时将该转化子命为DH5-pHIS1525。2.4 重组表达载体的构建2.4.1 内切葡聚糖酶基因（已经去掉信号肽编码序列）的准备通过转化子的菌落PCR和酶切检测后，发现目的基因（已经去掉信号肽编码序列）反向连接在pMD18-T Vector克隆载体上，为保证随后的酶切和表达载体的正确连接，提取转化子质粒后先进行Bgl单酶切，回收后再进行Sph单酶切，这样通过两次单酶切后保证了目的基因两端分别是由Bgl、Sph酶切后产生的粘性末端，通过两次单酶切后用胶回收试剂盒回收目的条带，取5L电泳检测其大
31、致浓度，结果见图6。图6 胶回收的目的基因与表达质粒pHIS1525 Fig6 Reclaimed target gene and plasmid pHIS1525 2.4.2 表达载体的准备含表达载体质粒pHIS1525的大肠杆菌DH5在含氨苄青霉素的LB平板上划线培养过夜，然后挑取单菌落接种10mL 含相应抗生素的LB液体培养基，37剧烈振荡培养12-14h后，按质粒提取试剂盒操作进行质粒pHIS1525的提取，并对质粒进行Bgl、Sph双酶切，电泳后切取目的条带进行胶回收，并取5L电泳检测其大致浓度，结果见图6。2.4.3 转化子的筛选及检测用T4 DNA连接酶连接胶回收的目的基因（即去
32、掉信号肽编码序列的内且葡聚糖酶基因）与表达质粒pHIS1525，将连接体系置PCR仪中16连接过夜，取10L连接液转化大肠杆菌DH5感受态细胞并涂布在含有100g/mL氨苄青霉素的LB平板上，待菌落长出后，挑取菌落大小均一的单菌落进行菌落PCR，结果见图7。 菌落PCR结果表明，转化子3、5、6、7均能得到与目的基因大小相一致的条带。根据电泳结果随机挑取其中的一个单菌落培养后提质粒进行酶切检测，结果见图8。 图7 E.coli DH5转化子菌落PCR 图8 转化子质粒酶切结果Fig7 Recombinant E.coli DH5colony PCR Fig8 Restriction analy
33、sis of recombinant结果表明，质粒经过单酶切后没有出现非特异性条带，双酶切后可得到与目的基因大小相一致的条带，说明目的基因包含的该质粒中。通过对转化子进行菌落PCR及其质粒酶切检测，表明重组质粒已经转进了大肠杆菌DH5中。将该菌命为pHEC-End。3 讨论3.1 芽孢杆菌作为表达体系的优点芽孢杆菌为革兰氏阳性细菌，细胞壁不含内毒素，能分泌大量的蛋白到体外，能形成芽孢，是一些重要工业酶制剂的生产菌。自1958年Spizizen17发现枯草杆菌168菌株能摄取外源基因以后，随着DNA重组技术的发明，特别是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)带抗性标志的质粒
34、可作为其载体的发现，芽孢杆菌基因工程的工作迅速发展。作为很有吸引力的外源基因表达的宿主，芽孢杆菌有以下一些优点: 除炭疽杆菌(Bacillus anthracis)和蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)等外，多数芽孢杆菌对人畜无害，不像大肠杆菌那样具有热源性脂多糖。 遗传学现在相当先进，很多噬菌体和质粒适合于用作克隆载体。 具有蛋白分泌能力强的特性。当分泌蛋白跨过细胞膜后，就被加工和直接释放到培养基中，这使得回收和纯化目的蛋白较为简单。 良好的发酵基础和生产技术。芽孢杆菌在工业上长期被用于生产蛋白酶、a-淀粉酶以及苏云金杆菌的杀虫晶体蛋白等。在相对简单的培养基中能生长到很高的密度。细
35、胞的生长特性和生理学性质都被广泛、深入研究。经过几十年的努力，芽孢杆菌表达系统的优越性得到发挥，许多原核和真核基因被克隆和表达，其中有的己应用于工业生产，取得了不少成绩。但是，用芽孢杆菌作为产品生产菌也暴露出一些问题:蛋白酶对目的蛋白的降解，质粒的不稳定，真核蛋白分泌表达量低或不能分泌表达等。3.2 信号肽对外源基因表达的影响信号肽对外源基因分泌表达至关重要，同一种蛋白酶在不同信号肽的作用下，即使都能分泌表达，其分泌效率也会相差甚远。Yang Yang18等人研究表明：当使用巨大芽孢杆菌的胞外脂酶的信号肽代替自身的信号肽时，可提高青霉素酰胺酶G表达量1.7倍；Nagarajan19选择了枯草杆
36、菌蛋白酶、中性蛋白酶、芽孢杆菌RNA酶和果聚糖蔗糖酶等四种酶的信号肽，以芽孢杆菌BE1510为宿主菌，分别研究它们对重组链霉抗生素蛋白分泌效果的影响。结果表明，携带四种融合基因的菌株都能有效分泌四聚体链霉抗生素蛋白，但以用中性蛋白酶信号肽时效率最高。大肠杆菌由于细胞壁结构与芽孢杆菌不同，很少能将外源蛋白分泌在胞外，大多在胞内形成包含体的形式。在大肠杆菌中似乎信号肽的存在对外源基因的表达存在不利，如李相前等20通过PCR方法分别克隆Cel 12B完整基因和不带信号肽基因至pET一20b载体，构建重组质粒pET-20bCel12B和pET一20bCel12B-WS，转化至大肠杆菌JM109DE3诱
37、导表达后，分析酶活，结果表明去除信号肽重组菌单位酶活是未去除信号肽重组菌的11倍多。3.3 引物的设计Rygus T21、Yang Yang22均报道表明，外源基因在表达载体的信号肽引导比基因自身信号肽引导下具有较高的表达水平。Yang发现来自Thermobifida fusca的水解酶只有其密码子适合巨大芽孢杆菌时才能成功的表达，黄玉杰等23人在巨大芽孢杆菌中克隆到了编码内切酶的基因，该基因片段同己发表的枯草芽孢杆菌glyBaprE之间的同源性为35；同芽孢杆菌BP23 celB、短小芽孢杆菌内切葡聚糖酶和多粘芽孢杆菌- 1，4-内切葡聚糖酶的编码基因的同源性只有27。表明巨大芽孢杆菌在密码
38、偏爱性上与其他芽孢杆菌存在着差别。因此，在设计引物时，通过分析巨大芽孢杆菌和编码该基因的密码子使用频率，引入碱基A。使编码的内切葡聚糖酶能够正确的与表达载体pHIS1525上的信号肽融合而不至改变阅读框。在本实验中，我们通过PCR去除枯草芽孢杆菌C-36内切葡聚糖酶基因中编码信号肽的序列。4 结论 本实验成功去除枯草芽孢杆菌C-36内切葡聚糖酶基因中编码信号肽的序列，并且将去除信号肽的枯草芽孢杆菌C-36内切葡聚糖酶基因与巨大芽孢杆菌表达载体pHIS1525进行连接，成功构建了重组表达载体。参考文献1 谢占玲，吴润.纤维素酶的研究进展.草业科学J,2004,21（4）:72-75.2 徐昶，龙
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45、Appl.Microbiol.Biotechnol., 1991, 35: 594-59922 Yang Y, Malten M, Grote A, et al. Codon optimized Thermobifida fusca hydrolase secreted by Bacillus megateriumJ. Biotechnol Bioeng, 2007, 96（4）: 780-79423 黄玉杰, 杨合同, 丁爱云等. 巨大芽孢杆菌内切葡聚糖酶编码基因的克隆及序列分析J. 中国生物防治, 2004, 20（4）: 256-259致谢本文是在导师陈惠教授，以及生物化学实验室师兄们精心指导下完成的。在学习和研究等方面他们都给予了悉心的指导和关怀，培养了我较强的实验动手能力和思考能力。他们严谨求实的态度和孜孜不倦的精神感染了我，激励我不断的前进。在此论文完成之际，我向指导了我的导师和师兄致以最衷心的感谢！吴琦老师、韩学易老师在我论文设计及完成过程中，提出了许多宝贵和富有建设性的意见，在此表示感谢！生物化学与分子生物学实验室研究生胥兵、官兴颖、李陈、李成磊、吴正芳、曾民在我实验过程中都给予了极大的帮助和关心，在此，我对他们一并表示最衷心的感谢！最后，感谢我的家人和朋友！他们一直默默地支持我，关心我，鼓励我，是我论文顺利完成的坚强后盾。感谢所有关心和帮助过我的人！
