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1、,专题1 基因工程,DNA重组技术的基本工具 和基本操作程序复习,转基因抗虫棉是我国目前最主要的转基因作物，如何获得转基因抗虫棉呢？,基因工程培育抗虫棉的简要过程：,知识网络构建,1.1基因工程的概念,一、基因工程的基本概念(原理)：“按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫DNA重组技术。,优点：定向改造生物的遗传性状以及克服远缘杂交不亲和障碍。,生物体外,基因,DNA分子水平,获得人类需要的基因产物或定向改造生物性状,基因重组(广义),1
2、抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来,2抗虫基因与载体DNA连接,3抗虫基因导入受体(棉花)细胞,分子手术刀限制性内切酶分子缝合针DNA连接酶分子运输车基因进入受体细胞的载体,二、转基因抗虫棉操作的基本工具 ?,2基因工程的操作工具,(1)基因的“分子手术刀”分布(来源)：种类：约4000种。作用特性：切割结果：产生两个带有 末端或 末端的DNA片段。,限制性核酸内切酶(简称限制酶),主要存在于原核生物中。,黏性,平,识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。(切割具有专一性),切割磷酸二酯键,EcoR,黏性末端,黏性末端,Sma,平末端
3、平末端,要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？,要切两个切口，产生四个黏性(平)末端。,为什么原核生物的限制酶不能将自己的DNA分子剪切掉？,DNA分子不具备该种限制酶的识别切割序列；通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，限制酶不能识别。,2基因工程的操作工具,(2)分子缝合针类型：,DNA连接酶,把切下来的具有互补黏性末端或平末端的DNA分子拼接成新的DNA。(即将脱氧核糖与磷酸通过 连接起来),磷酸二酯键,Ecoli-DNA连接酶,T4-DNA连接酶,大肠杆菌,T4噬菌体,都缝合磷酸二酯键,DNA连接酶：,Ecoli DNA连接酶或T4DNA连
4、接酶,Ecoli DNA连接酶或T4DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键,两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来,T4DNA连接酶(可用于连接平末端，但连接效率低),限制性内切酶与DNA解旋酶的区别,切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯键,将DNA两条链的氢键打开形成两条单链,DNA连接酶与DNA聚合酶的区别,切割磷酸二酯键将DNA水解为单个核苷酸,易混辨析,只能将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键,形成磷酸二酯键,在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键,以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键连接成一条互补的DNA链,
5、将DNA双链上的两个缺口同时连接起来，不需要模板,你能辨析限制酶与DNA连接酶、 DNA聚合酶、DNA解旋酶作用不同点吗？,疑难解析,例1 如右图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示何种酶的作用？,限制酶,DNA连接酶,解旋酶,DNA聚合酶,2基因工程的操作工具,(3) “分子运输车”载体条件：常用载体：,a能自我复制：具有复制原点，在宿主细胞内能够保存和复制;,b有一个或多个酶切位点，能够运载多种目的基因；,c有标记的基因，如抗性基因、特殊生化表型基因,d对受体细胞无害，不影响受体细胞正常的生命活动,质粒、噬菌体衍生物、某些动植物病毒。,常用的载体：质粒,能复制并带着插入的
6、目的基因一起复制,有一个至多个酶切位点,有标记基因的存在，可用含氨苄青霉素的培养基鉴别,质粒主要存在于细菌、放线菌和酵母菌等生物体内。质粒是一种能自我复制的小型环状双链DNA分子。,填写概念图,二、培育转基因抗虫棉基因工程的基本操作程序 ?,1.2 基因工程的基本操作程序,基因工程基本操作的四个步骤,1、获取目的基因,2、构建重组质粒,3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,怎样获得苏云金芽孢杆菌Bt毒蛋白基因？目的基因的获取常有哪些方法？,1、目的基因的获取,基因组文库法,cDNA文库法,PCR技术,人工合成法,基因组DNA文库,cDNA文库,（1）基因组DNA文库与cDNA文
7、库的比较,RNA聚合酶结合位点,RNA聚合酶脱落位点,真核细胞的基因结构(补充内容),编码区,非编码区,非编码区,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,内含子,外显子,真核细胞的基因结构,编码区,非编码区,外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列,：有调控作用,上游有启动子，下游有终止子,非编码序列：,包括非编码区和内含子,转 录,加 工,mRNA前体,成熟mRNA,原核细胞的基因结构(补充内容),非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,：编码蛋白质 ,连续不间断(没有内含子),编码区,非编码区,原核细胞的基因结构,RNA聚合酶
8、脱落位点,不编码蛋白质。,调控遗传信息表达,上游有启动子,下游有终止子,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,连续,不连续,编码区,非编码,（2） 如果用PCR只扩增所需目的基因的关键前提和条件是什么？过程如何？原理是什么？,PCR技术,前提：原理：过程:,DNA复制,一段已知目的基因的核苷酸序列，合成引物,低温退火（复性）55-60 ,高温解链（变性）90-95,子链延伸70-75 循环,（2）目的基因的获取方法,PCR反应过程可分为三步：解链（变性）、退火(复性)、延伸,解链（变性）。双链模板DNA解离为单链结构。(9095),退火（复性）。引物与模板互补成双链。,延伸。在Taq酶作用下，合成
9、特异DNA序列。7075,每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。,利用PCR技术扩增目的基因,易错辨析：PCR技术扩增与DNA复制的比较,碱基互补配对,四种脱氧核苷酸,模板、能量、酶,DNA在高温下变性解旋,解旋酶催化,体外复制,细胞核内,热稳定的DNA聚合酶（taq酶）,细胞内的DNA聚合酶,1.已知DNA链的合成方向是53，若要扩增出抗虫基因并利于载体构建，应该选择下图所示的哪种引物？请说明理由。,抗虫基因,前提条件：基因比较小 ，核苷酸序列已知。DNA合成仪用化学方法直接人工合成设备：DNA合成仪,（3）目的基因的获取方法用DNA合成仪人工合成目的基因,如何构建基因表达载体
10、？基因表达载体包含哪些基本组成元件？通过cDNA文库提取的目的基因需要加启动子和终止子吗？,2、构建基因表达载体,基因工程的基本操作程序,构建目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以以传给下一代。基因表达载体的组成：,2、表达载体的构建 基因工程的核心,启动子：位于目的基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需蛋白质。终止子：位于基因的尾端，使转录在所需要的地方停止下来。标记基因：为了鉴别受体细胞中是否含目的基因，从而筛选出来。如：抗生素抗性基因复制原点：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以复制遗传给下一代,复制原点+目的基因+启动子+
11、终止子+标记基因,易混辨析,你思考过实际操作过程中,如何防止酶切后的末端发生任意连接吗？,实际操作过程中，连接得到的DNA一定是重组DNA吗？操作：目的基因自体环化,基因表达载体构建时限制酶的选择,根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择Pst。不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择Sma。为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选用Pst和EcoR两种限制酶，但要确保质粒上也有这两种酶的切点。根据质粒的特点确定限制酶的种类所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相
12、同的黏性末端。质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶Sma会破坏标记基因。如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能会丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重 组后的片段进入受体细胞后将不能自主复制。,基因工程的基本操作程序,3、将目的基因导入受体细胞转化,常用的受体细胞：有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。导入方法：,方法,将目的基因导入植物细胞,将目的基因导入动物细胞,将目的基因导入微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞,农杆菌特点：生活在土壤中，能够在自然条件下感染 双子叶植物和
13、裸子植物，受植物体伤口处的细胞分泌的大量酚类化合物的吸引，农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA 可转移至受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。,原理：将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌转化，使目的基因进入植物细胞，并将其插入到植物细胞染色体的DNA上。使目的基因的遗传特性得以稳定的维持和表达。优点及应用：此法比较经济和有效，约80%的转基因植物都是通过这种方法获得。,1)将目的基因导入植物细胞,a.农杆菌转化法(采用最多的方法),我国科学家周光宇独创的一种方法实例：我国的转基因抗虫棉,常用于单子叶植物的基因转化 缺点：成本较高,b.基因枪法,c.花粉管通道法,1)将目的基因导
14、入植物细胞,该法的最大优点是不依赖组织培养人工再生植株，技术简单。缺点：受自然花期限制，在自然田间进行操作，受环境条件的影响很大。,花粉管通道法,十分简便经济,2)将目的基因导入动物细胞,最常用最有效的方法:显微注射技术,受体细胞：受精卵原因是：受精卵全能性较高，可使外源基因在相应的组织细胞内表达。基本操作程序：,提纯基因表达载体,体外显微注射入受精卵,经胚胎早期培养后移植到雌性体内,受精卵发育,新性状动物,3)将目的基因导入微生物细胞,应用最为广泛的受体细胞是大肠杆菌方法：Ca2+处理法或者感受态细胞法第一步：用Ca2+处理细胞(以增加细菌细胞壁的通透性)，使细胞处于一种能吸收周围环境中DN
15、A分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞；第二步：是将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链,这些糖链是在内质网和高尔基体上加工完成.大肠杆菌是原核生物,不存在这两种细胞器,因此在大肠杆菌生产这种糖蛋白是不可能的.,如何检测Bt毒蛋白基因是否成功导入棉花?最简单直观的鉴定方法是?外源基因在受体细胞能够表达的理论基础？,4、目的基因的检测与鉴定,基因工程的基本操作程序,4、目的基因的检测与鉴定,1).抗药性筛选法 利用标记基因,2).检测,导入检测,检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的
16、基因,方法DNA分子杂交,表达检测,转录检测,翻译检测,检测目的基因是否转录出了mRNA,方法分子杂交,检测目的基因是否翻译成蛋白质,方法抗原抗体杂交,核酸子检测,分子水平杂交技术,3).鉴定个体水平检测：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,是否赋予个体新的遗传特征或产物。,利用DNA分子杂交筛选含有目的基因的细菌克隆,检测方法：,1、DNA分子杂交技术,检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因,将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做,探针；,通过检测标记基因和转录出的mRNA的有无，来判断目的基因是否导入受体细胞。,检测方法2：分子杂交技术,用DNA探针和转基因生物的mR
17、NA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA,检测方法3：免疫检测抗原-抗体杂交,检测目的基因是否翻译成蛋白质,提 取,Bt毒素蛋白,将Bt毒蛋白注射小鼠体内,从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体,抗体,出现杂交带,检测方法3：免疫检测抗原-抗体杂交,以上检测是分子水平，有时还需进行个体生物学水平的鉴定，如对植物的抗虫抗病特性的鉴定等。,脱分化,组织培养,转入Bt毒素蛋白基因的植物细胞,Bt毒蛋白质,3).个体水平鉴定抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等是否赋予个体新的遗传特性包括抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性以及抗性的程度；基因工程产品与天然产品的活性比较，以确定功能是否相同等。,
