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1、转录组分析,张彩华20151031,1 转录组的定义,转录组： 广义转录组 是指某一生理条件下，细胞中所有转录和加工的RNA分子(包括 信使RNA， 核糖体RNA， 转运RNA和非编码RNA）。 狭义转录组 是指可直接参与翻译蛋白质的mRNA总和。,2 转录组的研究内容和意义,转录组的研究主要包括三个内容,发育调控,环境适应,免疫互作,发育调控,发育调控研究的核心内容是形态建成；形态建成是高等动植物外部形态和内部结构的起源、发育和建成的过程。例如：动物胚胎发育过程，植物种子萌发及形态建成等一直是研究的热点。,环境适应,含水量变化；新陈代谢变化（分解大于合成）；激素变化（ABA/IAA/GA）光
2、合强度变化等；,光合作用下降；酶活性变化；破坏正常物质代谢（蛋白质分解，脯氨酸积累，破坏核酸代谢）；激素变化。,SOD活性下降；光合作用变化；叶绿素含量降低；蛋白质分解；脯氨酸、甜菜碱含量变化，激素变化。,酶的变化，增加或分解（如混合功能氧化酶等），超氧化物歧化酶、蛋白质合成或DNA修复均会受到影响。,蛋白质变性；膜脂液化；有毒物质积累等；,低温及冻害,高温,干旱及洪涝,盐碱,环境污染,哺乳动物,植物,微生物,海洋生物,昆虫,免疫互作,自然环境中，动植物常会经历各种病原物（病毒、细菌、真菌、害虫）侵害，严重危害动植物生长、发育及健康。在长期演化过程中，为更好的适应坏境，动植物逐渐形成了多种与病
3、原物对抗的生理途径。,转录组的研究意义,转录组的研究不仅可以解释细胞或组织的基因组的功能元件，揭示分子成分，还可以用来认识生物学进程和疾病发生机制，同时，对基因及其转录表达产物功能研究的功能基因组学，将为疾病控制和新药开发、作物和畜禽品种的改良提供新思路，为人类解决健康问题、食物问题、能源问题和环境问题提供新方法。,3 转录组研究方法,三代转录组测序,基于杂交技术的cDNA芯片和寡聚核苷酸芯片,3 转录组研究方法,3 转录组研究方法,基于Sanger测序法的SAGE、 LongSAGE和MPSS,3 转录组研究方法,基于二代测序技术的转录组测序（RNA-Seq）,3 转录组研究方法,RNA-s
4、eq的优势,4 转录组测序(RNA-seq)的原理和流程,样品制备（植物RNA提取的方法）,4 转录组测序(RNA-seq)的原理和流程,1. 利用RNeasy Plant Mini Kit提取总RNA2. 利用TRIZOL试剂盒提取RNA3. CTAB法提取植物总RNA,RNA质检参数OD260/OD280,OD260/OD230 A230: 测定其它碳源物质，如酚，糖类等。 A260：核酸的吸收峰测，测RNA，DNA，引物等的浓度用的。 A280：蛋白质的吸收峰。RIN值：RIN=RNA integrity number，即 RNA 分子完整数，从 0-10，直接反应了 RNA 质量的好坏
5、，此数值越大表明 RNA 质量越好越完整。,4 转录组测序(RNA-seq)的原理和流程,RNA样品检测,RIN=6.0,RIN=10,合格标准：1. rRNA 比率28s/18s 1.1, RNA完整系数(RIN) 7 2. 28s和18s条带明显(变性琼脂糖凝胶电泳) 3. 比率260nm/280nm 2.0 (分光光度计测量)。,4 转录组测序(RNA-seq)的原理和流程,RNA文库构建,文库库检,4 转录组测序(RNA-seq)的原理和流程,文库构建完成后，分别使用Qubit2.0和Agilent 2100对文库的浓度和插入片段大小（ Insert Size）进行检测，使用Q-PCR
6、方法对文库的有效浓度进行准确定量，以保证文库质量,上机测序,5 转录组分析方法,测序数据处理和过滤,测序数据以fq格式保存：,碱基质量值 = (字符的)ASCII值 64/33范围：2-40 碱基质量值与测序错误率的对应关系：Qphred = -10 log10(e),5 转录组分析方法,测序数据过滤：1.去除含接头的reads；2.去除 unknown bases(碱基N) 比例高于5%的reads；3.去除低质量reads(一个read中质量值 7 的碱基含量高于65%)数据要求：1.Q20%80%；2.有效数据量达到要求；NewMaster：/home/share/users/zhang
7、caihua2013/projects/Pop.Timeseries.Transcriptome/NaCl/02.filter_fastq_gz.pl,5 转录组分析方法,5 转录组分析方法,两种组装思路,Assembly-first (de novo) Trinity SOAPdenovo(-Trans) (Trans-)AByss Velvet OasesMapping-first (reference-based)： Tophat Cufflinks Scripture,5 转录组分析方法,5 转录组分析方法（de novo组装）, de novo组装流程,5 转录组分析方法（de no
8、vo组装原理）,对于一个给定的read: GTCGAGGread长度：7bps取kmer长度为4bps如下：,构建De Brui jn 图：,5 转录组分析方法（de novo组装原理）,5 转录组分析方法,简化,5 转录组分析方法（de novo组装原理）,纠错：Tips removed,5 转录组分析方法（de novo组装原理）,纠错：Bubbles removed,5 转录组分析方法（de novo组装原理）,解开短的重复序列（If therere reads assigning one outgoing branch for each incoming branch）,5 转录组分析
9、方法（de novo组装原理）,构建Scaffold：Map reads to contigs,5 转录组分析方法（de novo组装原理）,Contigs are connected by paired reads to form a scaffolding graph,将reads比到 scaffolds ,根据 overlap 在gap处延伸,5 转录组分析方法（de novo组装原理）,Trinity,5 转录组分析方法（de novo组装）,5 转录组分析方法（de novo组装）,1. 构建kmer库(k = 25)；2. 去掉潜在的测序错误k-mer；3. 选取最高频的k-mer
10、 作为种子进行组装；4. 将种子序列向两边延伸, 使用过的k-mer 从库中去除掉；5.若序列不能继续延长，则输出该contig；6. 重复第3-5步，直到kmer库中的所有kmer被用完。,Inchworm,5 转录组分析方法（de novo组装）,1. 利用contig之间的overlap关系，将具有k-1个 overlap关系的contig作为一个cluster；2. 对每一个cluster，以k 1作为节点，构建一个De Bruijn graph；3. 通过比对，将reads分配给contig(该reads至少必 须有k-1个碱基与contig有overlap)。,Chrysalis,
11、5 转录组分析方法（de novo组装）,1. 对De Bruijn graph图进行简化，将连续的节点合并。2. 利用reads的支持关系，去掉不可信的边，最后输出转录本序列。,Butterfly, 聚类去冗余步骤,5 转录组分析方法（de novo组装）,1.所有scaffolds用mgblast进行相似性比对2.以scaffold作为节点，以scaffold之间的相似性作为边连接形成 一个图，每一个连通的子图作为一个类（cluster）。3.对每一个cluster，用CAP3组装软件分别进行组装，得到 consensus序列（构建UniGene）。, 聚类去冗余工具,5 转录组分析方法（
12、de novo组装）,TGICLCAP3（或phrap）Cd-hit,NewMaster：/home/users/luowenchun2010/Project/LuSongShaxi/03.cap3/CAP3,1.Contig长度分布、Scaffold长度分布、Unigene长度分布；2.N50：将序列按照长度递减累加，当累加之和刚好大于 总长度的一半时，最后被累加的那条序列长度， 即为N50；3.组装准确性（注释，近缘物种之间相似性分析）。, 组装评估,5 转录组分析方法（de novo组装）, 预测CDS,5 转录组分析方法（de novo组装）,使用transdecoder从trinit
13、y的转录本中提取coding region，得到对应 的protein序列 ，利于下一步的功能注释。,OldMaster：/home/share/software/trinity/trinityrnaseq_r20131110/trinityplugins/TransDecoder_r20131110/TransDecoder,按优先级数据库顺序将Unigene序列与以上 蛋白库做blastx比对，如果某个Unigene序列比对上高优先级数据库中的蛋白，则不进入下一轮比对，否则自动跟下一个库做比对，如此循环直到跟所有蛋白库比对完。我们取blast比对结果中rank最高的蛋白确定该Unigene
14、的编码区序列，然后根据标准密码子表将编码区序列翻译成氨基酸序列，从而得到该Unigene编码区的核酸序列和氨基酸序列。,比对不上的Unigene用软件ESTScan预测其编码区。,NRKEGGSWISS-PROTCOGGO, 功能注释,5 转录组分析方法（de novo组装）,GO（gene ontology） 基因本体，是对基因或者蛋白质进行注解和分类的系统。三个本体（Ontology）： 分子功能(Molecular function),元件的活性。例如：结合活性、 催化活性 生物过程(Biological process ),某些代谢过程从开始到终止的过 程。例如：嘧啶代谢、 配糖基的运
15、输 细胞组分(Cellular component),基因产物的位置。例如： 细胞核、线粒体基质。, GO数据库,5 转录组分析方法（de novo组装）,功能注释,5 转录组分析方法（de novo组装）,1.去掉较短的组装序列(如要求：L 200)；2.对数据库进行物种分类（近缘种）；3.blastx比对，得到同源蛋白序列，对unigene进行功能注释。,表达量的计算,RPKM ：Reads Per Kilobase per Million readsFPKM ：Fragments/Reads Per Kilobase of exon per Million fragments mappe
16、d,Xt ：map至该基因的外显子上的片断数M ：所有map至基因组的测序reads的碱基数Lt：该基因外显子碱基全长,Nat Biotechnol. 2010,28(5):511 Bioinformatics 2009, 25(8):1026 Geno Biol. 2010, 11:R106,5 转录组分析方法（de novo组装）,= 10 6 Xt / 10 3, 表达量的计算,5 转录组分析方法（de novo组装）,Final.assembly.fa.1.bt2 Final.assembly.fa.2.bt2Final.assembly.fa.3.bt2 Final.assembly
17、.fa.4.bt2Final.assembly.fa.rev.1.bt2 Final.assembly.fa.rev.2.bt2,NewMaster：/home/share/users/zhangcaihua2013/projects/Pop.Timeseries.Transcriptome/NaCl/01.Bowtie2/4.RPKM.pl, 表达量,5 转录组分析方法（de novo组装）, 差异表达基因（DEGs）,5 转录组分析方法（de novo组装）,NewMaster：/home/share/users/zhangcaihua2013/projects/Pop.Timeserie
18、s.Transcriptome/NaCl/03.edgeR/2.run_edgeR.pl.sh,FDR= 2,5 转录组分析方法（Reference-based 组装）,Tophat and Cufflinks,5 转录组分析方法（Reference-based 组装）,Tophat and Cufflinks pipeline,5 转录组分析方法（Reference-based 组装）,转录组重构,Bowtie第一步建库：/opt/blc/genome/biosoft/bowtie-0.12.8/bowtie-build *.fa *.ebwt 第二部比对：/opt/blc/genome/b
19、iosoft/bowtie-0.12.8/bowtie,Tophat/programs/tophat -o TophatOutputPE/ -p 8 /programs/indexes/hg19 Experiment1.r1.fastq Experiment1.r2.fastq,5 转录组分析方法（Reference-based 组装）,表达量的计算,cufflinkscufflinks -p 8 -G transcript.gtf -library-type fr-unstranded -o cufflinks_output tophat_out/accepted_hits.bam,5 转录
20、组分析方法（Reference-based 组装）,差异表达基因的筛选,5 转录组分析方法,https:/,5 转录组分析方法,同源基因鉴定（Orthologs）,5 转录组分析方法,几种简单的聚类方法,简单聚类 层次式聚类 K-means聚类 SOM自组织映射神经网络,热图,K-means聚类,SOM 自组织映射聚类,5 转录组分析方法,K-means聚类,1 导入已经标准化的数据,3 计算FOM值,5 转录组分析方法,K-means聚类,5 转录组分析方法,K-means聚类,6 聚类参数设置,7 聚类结果,5 转录组分析方法,K-means聚类,8 图片结果保存, GO,5 转录组分析方
21、法,Blast2GOWEGO, COG, 功能富集,5 转录组分析方法, GO功能富集,5 转录组分析方法,SI S2 S3,PHYA、PHYB：红光或远红外光信号基因，参与花芽发育早期的调控，S1到S3逐渐下调。,6 与研究背景相关联,实验设计：来源于20个生长区域的珊瑚2个环境（29、35）2个时间（5h、20h）共152个样品。,测序方法及数据量：HiSeq2000，SE50bp；每个样品平均1M 的reads,6 与研究背景相关联,1.数据组装：经组装得到33469条unique contigs，并与UniProt、KEGG及GO等进行比对注释。,2. 差异基因分析：在处理组样品中，共
22、检测到8372个差异基因，其中部分基因在处理5h后表达量回复正常。,1.对照组中相同时间点之间样品整体差异较小，但处理时间跨度较大的2个样品间差异明显增大；2.对照组与处理5h后样品间基因表达模式明显不同。随处理时间增加，部分与高温胁迫相关的转录本表达会恢复到处理前；3.受温度胁迫瞬时表达的差异基因主要出现在处理5h后的样品中，而非处理后20h样品中。,6 与研究背景相关联,研究结果-PCA分析表达模式,TRAF3应答因子与珊瑚褪色表现出极度正相关。在处理过程中，TRAF3低表达时珊瑚褪色不明显， TRAF3高表达时珊瑚褪色最明显。,将处理20h后基因的表达与珊瑚褪色观测值进行关联分析，仅5.3%的contigs与珊瑚褪色为正相关，大部分contigs延迟应答。,研究结果-测序数据与表型数据关联分析,6 与研究背景相关联,谢谢！,
