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1、1,主讲人:杜珍武E-,吉林大学 药学院 基因工程教研室,基因工程,Genetic Engineering,基因体外转录与翻译 in vitro transcription/translation,基因工程,基因体外转录与翻译,一、基因体外转录与翻译的意义二、基因体外转录原理与操作三、基因体外转录应用四、基因体外翻译的原理与操作五、基因体外翻译的应用,基因工程,基因体外转录与翻译,一、基因体外转录与翻译的意义,基因工程,基因体外转录与翻译,一、基因体外转录与翻译的意义,费事、费力、工序烦琐,？,体外操作,体内操作,研究蛋白质、RNA方便需要,快速、方便获得蛋白质、RNA,基因工程,基因体外转录
2、与翻译,二、基因体外转录原理与操作,1、基因体内转录的过程,需要的基本物质：DNA模板 启动子、结构基因 转录终止子RNA聚合酶四种核糖核酸转录因子,基因工程,基因体外转录与翻译,二、基因体外转录原理与操作,1、基因体内转录的过程,真核基因转录,原核基因转录,基因工程,基因体外转录与翻译,二、基因体外转录原理与操作,2、基因体外转录的原理 基本的工作原理是以DNA为模板，在转录体系中的一系列转录因子的作用下，经RNA聚合酶合成RNA。基因体外转录体系在1976年由PELHAM和JACKSON建立。体外转录体系逐渐成熟。,基因工程,基因体外转录与翻译,二、基因体外转录原理与操作,3、基因体外转录
3、的操作（1）RNA聚合酶（RNA Polymerases）常用的聚合酶为噬菌体来源的RNA聚合酶 T7、SP6、T3,特异识别模板启动子转录效率比大肠杆菌的聚合酶效率高酶的来源及质量高,基因工程,基因体外转录与翻译,二、基因体外转录原理与操作,3、基因体外转录的操作（1）RNA聚合酶（RNA Polymerases）,基因工程,基因体外转录与翻译,二、基因体外转录原理与操作,3、基因体外转录的操作（2）线形的DNA模板（linear DNA template）要求：有RNA聚合酶识别的双链启动子，被转录基因。质粒（Plasmids）,基因工程,基因体外转录与翻译,二、基因体外转录原理与操作,3
4、、基因体外转录的操作（2）线形的DNA模板（linear DNA template）PCR产物（PCR Products）,基因工程,基因体外转录与翻译,二、基因体外转录原理与操作,3、基因体外转录的操作（2）线形的DNA模板（linear DNA template）寡核苷酸（Oligonucleotides）CDNA,基因工程,基因体外转录与翻译,二、基因体外转录原理与操作,3、基因体外转录的操作（3）基本反应体系,基因工程,基因体外转录与翻译,二、基因体外转录原理与操作,3、基因体外转录的操作（）基本反应分型 普通型（Conventional Synthesis）在一个反应体系内得到的量较
5、少，主要由于探针制备大规模型（Large Scale Synthesis）在一个反应体系内得到的量，一般在体系内得到，主要用于结构与功能的研究,基因工程,基因体外转录与翻译,三、基因体外转录应用,1、制备病毒RNA片段 用于证明病毒的侵染性,利用长链RT-PCR技术方法扩增出病毒全长cDNA，克隆入带有T7 RNA聚合酶启动子质粒，以此cDNA为模板作体外转录，转录产物转染细胞后观察到了典型的病毒病变。从而判定病毒的侵染性,基因工程,基因体外转录与翻译,三、基因体外转录应用,2、获得干扰用siRNA,基因工程,基因体外转录与翻译,三、基因体外转录应用,3、获得核酶（Ribozyme）核酶(Ri
6、bozyme)是一种具有核酸内切酶活性的RNA分子，可特异性地切割靶RNA序列。,锤头状核酶,发夹状核酶,基因工程,基因体外转录与翻译,三、基因体外转录应用,4、获得RNA探针,基因工程,基因体外转录与翻译,四、基因体外翻译的原理与操作1、基因体内翻译的过程,基因工程,基因体外转录与翻译,四、基因体外翻译的原理与操作2、基因体外翻译的原理,无细胞蛋白质合成系统是一种以外源mRNA或DNA为模板,通过在细胞抽提物的酶系中补充底物和能源物质来合成蛋白质的体外系统.与传统的体内重组表达系统相比,体外无细胞合成系统具有多种优点,如可表达对细胞有毒害作用或含有非天然氨基酸(如D-氨基酸)的特殊蛋白质,能
7、够直接以PCR产物作为模板同时平行合成多种蛋白质,开展高通量药物筛选和蛋白质组学的研究等.,基因工程,基因体外转录与翻译,四、基因体外翻译的原理与操作3、基因体外翻译系统（1）兔网织红细胞系统Rabbit Reticulocyte Lysate,网织红细胞由红细胞分化而来，在体内主要是负责合成大量血红蛋白（90%以上），以及球蛋白。这种未成熟的红细胞本身不带细胞核，但却保留了这种高效翻译各种核酸信息的能力，可减少背景，即使在较低的丰度下也能比较高效地合成产物。根据测定，体外合成外源蛋白的效率接近完整网织红细胞自身合成内源蛋白的效率。此外网织红细胞体系内源的核酸酶很少，有助于长链RNA的稳定（包
8、括有帽子或者没帽子结构的RNA），因而可以合成较大的蛋白。网织红细胞体系是最有希望做到微粒体糖基化的体系。,基因工程,基因体外转录与翻译,四、基因体外翻译的原理与操作3、基因体外翻译系统（1）兔网织红细胞系统,兔网织红细胞用新西兰大白兔制备，通过纯化除去兔网织红细胞以外的污染细胞。网织红细胞裂解后，提取物用微球菌核酸酶破坏内源mRNA，最大限度降低翻译背景。裂解物包含蛋白质台成所必须的细胞内组分(tRNA，核糖体，氨基酸，起始、延伸、终止因子)。为使系统更适于mRNA 的翻译，兔网织红细胞中还添加了磷酸肌酸和磷酸肌酸激酶的能量生成系统，以及氯化高铁血红素防止翻译起始的抑制，此外还添加了tRNA
9、s混合物用于扩大mRNA翻译的范围，以及乙酸钾和乙酸镁等。兔网织红细胞具有一定的翻译后加工活性，包括翻译产物的乙酰化，异戊二烯化，蛋白酶水解和一些磷酸化活性。信号肽切除以及蛋白质糖基化等翻译后加工事件可以通过加入犬微粒体膜来实现。,基因工程,基因体外转录与翻译,四、基因体外翻译的原理与操作3、基因体外翻译系统（1）兔网织红细胞系统,体外翻译系统中兔网织红细胞系统是真核体外翻译系统中应用最广泛的一种，常用于较大的mRNA种类鉴定，基因产物性质的分析，转录和翻译调控的研究，以及共翻译加工的研究等。,基因工程,基因体外转录与翻译,四、基因体外翻译的原理与操作3、基因体外翻译系统（2）麦芽提取物 Wh
10、eat Germ Extract,麦胚提取物的制备 通过碾磨麦胚，离心去除细胞残渣，上清液通过层析将抑制翻译的内源氨基酸和植物色素等分离出去。提取物用微球菌核酸酶处理 破坏内源mRNA，是大限度降低翻译背景。提取物中添加磷酸肌酸和磷酸肌酸激酶的能量生成系统和增加链延伸效率的亚精胺，以及一定量的乙酸镁。麦胚提取物系统可稳定地表达一些在兔网织红细胞系统中翻译受到抑制的DNA,基因工程,基因体外转录与翻译,四、基因体外翻译的原理与操作3、基因体外翻译系统（2）麦芽提取物 Wheat Germ Extract,麦芽提取物是不同于网织红细胞裂解物的另一个无细胞体外合成体系。由于内源的mRNA很少，这个系
11、统可用于各种病毒、酵母、高等植物乃至哺乳动物蛋白的合成。当表达产物较难与球蛋白区分（1215kD）、或者表达产物正好可能是哺乳动物细胞中富含而植物中没有的调控因子一类的蛋白时、或者是不明原因表达不出时，就不妨尝试麦芽提取物体系。不过要记住，这个体系要求RNA有帽子结构才能更好的翻译。如果上述情况又无法给RNA加帽，就只好借助大肠杆菌体系了。,基因工程,基因体外转录与翻译,四、基因体外翻译的原理与操作3、基因体外翻译系统（3）细菌提取物 E.coli Cell-Free System,原核系统主要利用大肠杆菌的提取物进行表达。利用大肠杆菌体系进行体外表达，某些蛋白质每小时每个反应（50ul）产物
12、量可高达数百微克，在优化的批量系统中蛋白最终的产量达到1mg/ml也是可能达到的，这一产率还可以通过连续反应器进一步得到提高。人们可以根据需要加入特殊添加剂如蛋白酶抑制剂，分子伴侣，代谢物，非天然氨基酸甚至是少量的变性剂，也可掺入特殊标记的氨基酸获得带标记蛋白质。这样这种体系的弹性就非常大，可以加入许多其它优化成份以提高产率和提高溶解性。大肠杆菌的材料来源成本最低，实用性高，表达效率也高,基因工程,基因体外转录与翻译,四、基因体外翻译的原理与操作3、基因体外翻译系统（3）细菌提取物 E.coli Cell-Free System,s30原核体外翻译系统的Ecolis30提取物是由OmpT内切蛋
13、白酶和Lon蛋白酶缺陷的EcoliB菌株制备，所以在s30系统中表达基因可以增加产物的稳定性，尤其适用于在体外表达时易被蛋白酶降解的蛋白质。s30体外翻译系统也适台表达那些在体内表达时由于宿主编码的抑制酶作用而表达水平低的蛋白质，使其能高水平表达。s30系统还可用于转录和翻译调控的研究 此外，s30体外翻译系统的应用还包括台成少量标记蛋白质用于蛋白纯化中作为示踪物质以及在蛋白质中掺人非天然的氨基酸用于研究蛋白质的结构功能,基因工程,基因体外转录与翻译,四、基因体外翻译的原理与操作3、基因体外翻译系统,基因工程,基因体外转录与翻译,四、基因体外翻译的原理与操作3、基因体外翻译系统,（4）对mRN
14、A 要求,用原核和真核细胞的mRNA转录本有明显的区别。通常真核mRNA带有转录后加工的5-7 methyl-GTP cap 和3poly(A)tail，有助于增加mRNA的稳定性，防止降解。同时5帽子结构有助于核糖体与mRNA的结合和AUG起始密码的正确识别。对应不同的体外表达系统，我们在设计RNA模版的时候就要区别对待。,原核生物中，核糖体受一段富含嘌呤的SD序列引导从而识别AUG起始密码。这段位于AUG上游的序列和30S核糖体亚基的16s rRNA一段序列互补，保守区5-UAAGGAGGUGA-3，核糖体结合位点RBS和起始密码AUG之间的距离以及碱基的组成对翻译的效率有显著影响，在设计
15、的时候要注意。,真核生物的那段保守序列成为Kozak序列（5-GCCACCAUGG-3），要高效翻译，+1G和-3A就很重要。不过如果mRNA没有这段Kozak序列而有一段适当长度5UTR也能够有效地在无细胞体系中得到翻译。,基因工程,基因体外转录与翻译,四、基因体外翻译的原理与操作3、基因体外翻译系统,（5）体外翻译与转录的连接,基因工程,基因体外转录与翻译,五、基因体外翻译的应用,1、基因产物的检测 目前应用的最普遍的可能就是这个用途，在获得一段DNA序列后，通过启始密码子ATG（少数情况是GTG）和终止密码子（TAA、TAG或者TGA）初步判断为开放读码框（ORF）。利用快捷的体外表达可
16、迅速确定此序列是否有表达产物、表达产物的特性等第一手信息。对于一次检测多个ORF产物，这个方法尤为方便。,基因工程,基因体外转录与翻译,五、基因体外翻译的应用,2 预合成 高通量蛋白表达和纯化 在进行体内表达前往往先进行体外表达，因为体外表达可以表达一些毒性强、对水解敏感或者不稳定的蛋白。另外，体外表达另一个优势就是可以合成时插入带有光敏性、荧光或者生物素残基等标记，方便对蛋白进行定位。一个典型的体外表达系统产量大约是50l，现在随着技术的改进许多公司的产品表达量也可以达到毫克级。,基因工程,基因体外转录与翻译,五、基因体外翻译的应用,3 高通量筛选筛选病毒特异翻译抑制复合物筛选分子伴侣抑制药
17、物*确定新型的孤受体（orphan receptor）,基因工程,基因体外转录与翻译,五、基因体外翻译的应用,4 分子结构和定位分析*膜蛋白研究 曾经有实验证明在体外表达系统中加入犬类的微粒体膜可以让跨膜蛋白G蛋白偶连受体正确折叠。*加入非天然氨基酸进行标记 有实验表明经过修饰的带赖氨酸反密码子的tRNA可以将非天然的氨基酸插入到体外表达合成的多肽中。*蛋白折叠和分子伴侣相互作用研究*实时翻译/折叠实验*高分子组装,基因工程,基因体外转录与翻译,五、基因体外翻译的应用,5 分子诊断*蛋白截短实验（Protein truncation test，PTT）这项实验发明1993年，可快速检测出基因突
18、变。,基因工程,基因体外转录与翻译,五、基因体外翻译的应用,6 功能基因组学体外表达克隆*核糖体展示技术 Ribosomal Display，RD,基因工程,基因体外转录与翻译,五、基因体外翻译的应用,7 功能研究*酶活分析 有些蛋白通过体外表达方式仍然保持活性，因此可以应用这些样品进行酶活测定。如果在体外表达系统中不含有与待测定酶相同的酶活性，那么表达产物无需纯化就可以直接进行测定。另外，在体外表达系统中可以方便加入一些外部因子，从而可能省去一些要在细胞中进行的研究。*突变分析*翻译后修饰分析 许多蛋白需要进行高级修饰后才能形式功能。目前，在兔网织红细胞系统中已经成功进行过磷酸化、腺苷酸化、
19、豆蔻酰化、法呢醇化、异戊二烯化和蛋白水解活性修饰。额外的微粒体膜则可以对糖基化、甲基化和信号序列去除进行研究。,基因工程,基因体外转录与翻译,五、基因体外翻译的应用,8 分子间相互作用检测*蛋白蛋白相互作用 这些作用包括特异结合（例如：抗原抗体、配体受体结合），高分子组装（macromolecular assembly）和转录功能复合物的形成。通常相互作用的蛋白分别用体内表达系统和体外表达系统表达，利用体外表达可方便的对蛋白进行标记，以此为探针检测另一蛋白。利用这个方法还可以对酵母双杂交的结果进行验证。*蛋白DNA和蛋白RNA相互作用 表达的蛋白可以通过电泳迁移率移位实验（electrophoretic mobility shift assay,EMSA）发现蛋白是否能够与核酸结合，结合后的蛋白泳动会较慢。*DNA-RNA和RNA-RNA相互作用 互补的核酸序列会抑制转录或翻译的进行。,基因工程,基因体外转录与翻译,课后复习重点1、体外转录常用的RNA聚合酶2、体外转录模板DNA来源以及要求3、体外翻译常用的翻译系统4、体外翻译对于要求,
