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1、课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,一、课题背景,1、尿素的利用,尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。,2、细菌利用尿素的原因,土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶,3、常见的分解尿素的微生物,芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。,4、课题目的,从土壤中分离出能够分解尿素的细菌,统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌,一.研究思路,.筛选菌株,.统计菌落数目,.设置对照,1、实例：,寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。,因为热泉温度708
2、00C，淘汰了绝大多数微生物只有Taq细菌被筛选出来。,DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。,(一).筛选菌株：,原因：启示：,要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等；配置合适的培养基方法：抑制大多数微生物生长造成有利于该菌生长的环境，结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过稀释涂布平板法等方法对它进行纯化培养分离。,2、实验室中微生物的筛选原理：,人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。,3、选择培养基,在微生物学中，将允许特定种类的微生
3、物生长，同时抑制或阻止 其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。,4、配制选择培养基的依据,根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某种物质以达到选择的目的。例如：培养基中不加入有机物可以选择培养 微生物；培养基中不加入氮元素，可以选择培养 的微生物，加入高浓度的食盐可选择培养金黄色葡萄球菌等。,自养型,固氮,5、本课题使用的培养基的配方：,从物理性质看此培养基属于哪类？,固体培养基,在此培养基中哪些作为碳源、氮源？,碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素,培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，
4、所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。,4、培养基选择分解尿素的微生物的原理,怎样证明此培养基具有选择性呢？,以尿素为唯一氮源的培养基,牛肉膏蛋白胨培养基,是,分离尿素细菌,判断该培养基有无选择性,只生长尿素细菌,生长多种微生物,是,1、显微镜直接计数：,利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。,.统计菌落数目：,不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；,缺点,2.间接计数法（活菌计数法）（1）常用方法：,每克样品中的菌落数(CV)M其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的
5、体积(ml)，M代表稀释倍数。,当样品的稀释度足够高时，培养基表 面生长的一个菌落，来源于样品稀释 液中的一个活菌，通过统计平板上的 菌落数，就能推测出样品中大约含有 多少活菌。,（2）原理：,稀释涂布平板法。,2.间接计数法（活菌计数法）（1）常用方法：,当样品的稀释度足够高时，培养基表 面生长的一个菌落，来源于样品稀释 液中的一个活菌，通过统计平板上的 菌落数，就能推测出样品中大约含有 多少活菌。,（2）原理：,稀释涂布平板法。,思考？,1、1个菌落 1个活菌。2、统计的菌落数 实际活的细菌数。3、用稀释涂布平板法一定要重复实验，一般至少要涂布3个平板。4、重复实验结果中小于30菌落的不用
6、。,不一定,（3）统计原则：,选 30300 个菌落的平板统计。每个稀释度取3个平板取其平均值。,（4）统计结果：,统计的菌落数往往比活菌的实际数目 ，因此统计结果一般用 表示。,低,菌落数而不是活菌数,每克样品中的菌落数(CV)M其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。,注意事项为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板上进行计数。为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。涂布平板法所选择的稀释度很重要，一般以三个稀释度中的第二个稀释度
7、所出现的平均菌落数在50个左右为最好。,例：两位同学用稀释涂布平板法测定同 一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。 1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。 2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。 你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？,甲：没有重复实验（至少涂布3个平板） 乙：A组结果误差过大，不应用于计算平均值,?,是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。,.设置对照：,（1）设置对照的目的：,（
8、2）对照实验：,指除了 的条件外，其他条件都 的实验。满足该条件的称为 对照组，未满足该条件的称为 实验组。,被测试,相同,实验组：对照组：设置对照 - 同等条件下，培养空白培养基。,设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。,.设置对照：,设置对照的方法：,空白对照：不给对照组任何处理因素。,条件对照：给对照组施以部分实验因素，但不是所要研究的 处理因素。,自身对照：对照组和实验组都在同一研究对象上进行。,相互对照：不单设对照组，而是几个实验组相互对照。,A同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种。,一是由于土样不同；,二是由于培养基污染或操作失误。
9、,实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。分析其原因。,原因：土样不同，培养基污染或操作失误(或者是混入了其他的含氮物质),小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。,方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验,方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。,结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。,（一）土壤取样（土壤是天
10、然培养基） （1）取样的位置： 土壤，天然培养基，含有大量的微生物，土壤中7090是细菌，细菌适宜在酸碱度接近中性的的潮湿土壤中生长。在富含有机质的土壤层的38cm处中分布着绝大多数的细菌。 （2）取样要求：铲去表层土。注意无菌操作：取土样用的小铁铲和盛土样的信封等用具在使用前都要灭菌。应在火焰旁称取土壤。并在火焰附近将土样到入锥形瓶并塞好棉塞。,二.实验的具体操作,.制备培养基：,制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。,（三）样品的稀释,注意灭菌：应在火焰旁称取土壤10g。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行,（1）测细菌数：一般用104、105、106稀释液 （2）测放线菌：一般用1
11、03、104、105稀释液 （3）测真菌数：一般用102、103、104稀释液,分离不同的微生物采用不同的稀释度原因：不同微生物在土壤中含量不同目的：保证获得菌落数在30300之间、适于计数的平板,.取样涂布,实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。,如果得到了2个或2个以上菌落数目在30300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。,.微生物的培养与观察,培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌：3037培养12d放线菌：2528培养57d霉菌：2528的温度下培养34d。,
12、观察：,在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。原因：不同种类的微生物，往往需不同的培养温度和培养时间，每隔24h统计1次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。b. 以“稳定菌落”为观察对象。原因：不同种类的细菌形成的菌落，在大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等方面具有一度的特征，菌落特征可作为菌种鉴定的重要依据。,微生物的培养与观察,筛选后必鉴定-鉴别培养基,鉴别培养基：不影响微生物的生存 根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品，用于鉴别不同种类的微生物，如加入伊红-美蓝培养基鉴别饮用水或乳制品中是否大肠杆菌（如有，
13、菌落呈深色，并带有金属光泽）,酚红培养基： 鉴定分解尿素的细菌。 原理：脲酶催化尿素分解成氨培养基碱性增强 酚红变红脲酶阳性,（一）培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落 对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。（二）样品的稀释操作是否成功 如果得到了2个或2个以上菌落数目在30300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。（三）重复组的结果是否一致 如果学生选取的是同一种土样，统计的结果应该接近。如果结果相差太远，教师需要引导学生一起分析产生差异的原因。,四.结果
14、分析与评价,三.结果分析与评价1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。2.提示：选择每个平板上长有30300个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。,四、操作提示,无菌操作,做好标记,规划时间,（一）、无菌操作,1、土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。2、制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。,3、样品的稀释：,注 意
15、、为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板上进行计数。、为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。、统计的菌落往往比活菌的实际数目低。这是因为两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。、涂布平板法所选择倒平板的稀释度很重要，一般以三个稀释度中的第二个稀释度倒平板所出现的平均菌落数在50个左右为最好。,（1）、应在火焰旁称取土壤10g。将称好的土样倒入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，塞好棉塞。 （2）、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行。（3）、分离不同的微生物采用不同的稀释度，其原因是不同微生物在土壤中含量不同，其目的是保证获得菌落数在30300之间、适于计数的平板。（4）、如果得到了2个或2个以上菌落数目在30300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。,（三）、制定计划,
