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1、酱油中霉菌和酵母菌计数检测(二),回忆：1、什么是霉菌？霉菌易在什么环境下生长？2、酵母菌的菌落有哪些特点？,霉菌： 霉菌是在培养基上长成绒毛状、棉絮状或蜘蛛网状的真菌。 霉菌喜好在相对温度较低，湿度较高的环境中生长。酵母菌： 酵母菌属于真菌，单细胞个体较大，菌落成圆形，边缘光滑，菌落个体与细菌菌落形状类似但个头较大。,工作任务,第一大组任务一：马铃薯葡萄糖琼脂培养基的制备,第二大组任务二：无菌间梯度稀释和接种操作,交换任务,分两小组完成任务，每组制备500mL马铃薯-葡萄糖琼脂培养基，分装包扎后放入框内，灭菌。,分两小组完成任务，轮流进入无菌间，进行样品的梯度稀释和接种工作。无菌间外等候的小
2、组进行培养基预热和仪器设备准备。,实训目的,1、掌握霉菌酵母菌梯度稀释和接种操作手法2、能够区分霉菌酵母菌与细菌总数梯度稀释 和接种方法差异3、掌握霉菌酵母菌计数检测中梯度稀释和倾 注法接种中的无菌操作要点,仪器和设备,吸量管1mL 4支，25mL1支，带有225mL无菌水的三角瓶1只，带有9mL无菌水的试管3只，吸耳球，酒精灯，记号笔，样品原液。 预热到45度左右的马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基，培养皿4个，电炉或电热套。 培养箱。,任务一：培养基制备,马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基制备配方：马铃薯（去皮切块） 150g葡萄糖 10.0g琼脂 10.0g氯霉素 0.05g蒸馏水 500mL制法：将马
3、铃薯去皮切块，加500mL蒸馏水煮沸10-20min。用纱布过滤，补加蒸馏水至500mL。加入葡萄糖和琼脂，加热熔化，分装后，121度灭菌20分钟。倾注平板前，用少量乙醇溶解氯霉素加入培养基中。,任务二：梯度稀释和接种,梯度稀释和倾注法接种：1、吸取25mL液体样品或称取25g固体样品，无菌操作法加入225mL无菌水中，摇匀制备成1：10样品溶液。 用1mL无菌吸量管吸取1：10样品溶液，用无菌方法各取1mL，分别加入到2个无菌培养皿中。2、换一只无菌吸量管吸取1mL1：10样品溶液，加入到装有9mL无菌试管中反复吹吸，制备成1：100样品溶液。用这支吸量管各取1mL1：100溶液，加入到2个
4、培养皿中。,3、再换一只无菌吸量管吸取1mL1：100样品溶液，加入到装有9mL无菌试管中反复吹吸，制备成1：1000样品溶液。用这支吸量管各取1mL1：1000溶液，加入到2个培养皿中。4、再换一只无菌吸量管，吸取1mL空白溶液，加入到无菌培养皿中。5、将预热到45度左右的马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基加入15-20mL到装有1：10、1：100、1：1000和空白的培养皿中，混匀冷却，倒置培养28度，5天后观察。,1、样品的稀释固体和半固体样品：称取25g样品至盛有225ml灭菌蒸馏水的锥形瓶中，充分振摇，即为 1:10充分稀释液。或放入盛有225ml 无菌蒸馏水的均质袋中，用拍击式均质器拍打
5、2min，制成1:10的样品匀液。液体样品：以无菌吸管吸取25ml样品至盛有225ml无菌蒸馏水的锥形瓶（可在瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。取1ml1:10稀释液注入含有9ml无菌水的试管中， 另换一只1ml无菌吸管反复吹吸，此液为1：100稀释液。按上述操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1ml无菌吸管,2、接种根据对样品污染状况的估计，选择2个3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释的同时，每个稀释度分别吸取1ml样品匀液于2个无菌平皿内。同时分别取1ml样品稀释液加入2个无菌平皿作空白对照。及时将
6、 15ml20ml 冷却至 46的马铃薯葡萄糖琼脂或孟加拉红培养基（可放置于461恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。,国家标准介绍,目前使用标准：中华人民共和国国家标准 GB4789.152010 食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数 适用范围：本标准规定了食品中霉菌和酵母菌 的计数方法。 本标准适用与各类食品中霉菌和酵母的计数。,检测流程,检样,25g（ml）样品+ 225ml无菌蒸馏水，均质,10倍系列稀释,选择2个3个适宜稀释度的样品匀液，各取 1ml 分别加入无菌培养皿内,每皿中加入15ml20ml 马铃薯葡萄糖琼脂或孟加拉红培养基,菌落计数,报告,操作
7、步骤,1、 样品的稀释固体和半固体样品： 称取25g样品至盛有225ml灭菌蒸馏水的锥形瓶中，充分振摇，即为 1:10充分稀释液。或放入盛有225ml 无菌蒸馏水的均质袋中，用拍击式均质器拍打2min，制成1:10的样品匀液。液体样品： 以无菌吸管吸取25ml样品至盛有225ml无菌蒸馏水的锥形瓶（可在瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。取1ml1:10稀释液注入含有9ml无菌水的试管中， 另换一只1ml无菌吸管反复吹吸，此液为1：100稀释液。按上述操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1ml无菌吸管。,2、接种根据对样品污染状况的估计
8、，选择2个3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释的同时，每个稀释度分别吸取1ml样品匀液于2个无菌平皿内。同时分别取1ml样品稀释液加入2个无菌平皿作空白对照。及时将 15ml20ml 冷却至 46的马铃薯葡萄糖琼脂或孟加拉红培养基（可放置于461恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。,3、培养待琼脂凝固后，将平板倒置，281培养5d，观察并记录。4、 菌落计数肉眼观察必要时可用放大镜，记录各稀释倍数和相应的霉菌和酵母数。霉菌蔓延生长覆盖整个平板的可记录为多不可计。菌落数应采用两个平板的平均数。,5、结果与报告结果计数： 计计算两个平板菌落数的平均数
9、，再将平均值乘以相应稀释倍数计算。 若所有平板上菌落数均大于150 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均落数乘以最高稀释倍数计算。报告：菌落数在100以内时，按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字报告。菌落术大于或等于100时，前3位数字采用两位有效数字，后面用0代替位数来表示结果：也可以10的指数来表示，此时也按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/g为单位报告，报告或分别报告霉菌和/或酵母菌。,附表：,孟加拉红培养基配方：蛋白胨 5.0g 葡萄糖 10.0g磷酸二氢钾 1.0g 硫酸镁（无水） 0.5g琼脂 20.0g 孟加拉红 0.033g氯霉素 0.1g 蒸馏水 1000mL制法：将上述成分加入蒸馏水中，加热熔化，补足蒸馏水至1000mL，分装后121度灭菌20min。倾注平板前，用少量乙醇溶解氯霉素加入培养基中。,工作任务,按照此流程，每四个同学分为一小组，逐次完成：1、培养基制备（3组）2、玻璃器皿包扎,工作注意事项,1、小组协作，分工进行2、注意个人卫生、工作服穿戴整齐3、工作认真仔细，安全操作,
