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1、肺炎克雷伯菌分离鉴定,标本：尿培养基：血平板、MAC（EMB、SS、XLD）KIA、MIU、葡萄糖蛋白胨水、枸橼酸盐培养基、鸟氨酸脱羧酶培养基及对照管试剂：革兰染液、荚膜染液、V-P试剂、吲哚试剂、95%乙醇溶液器材：孵育箱、接种环、酒精灯、显微镜,基本特性直接涂片，镜下观察。接种：在镜下观察细菌的大致形态及其数量，直接将标本用接种环蘸取后接种在血平板、MAC（EMB、SS、XLD）上，进行培养。温育：37 孵育18-24小时。,观察菌落形态：血平板上形成圆形、凸起、灰白色、不溶血、光亮的大菌落，相邻菌落易于融合，粘液状，若用接种针蘸取呈长丝状拽起；MAC上形成乳糖发酵产酸的菌落，即红色或粉红
2、色、较大、浑浊、凸起、有光泽的粘液型菌落（EMB上是大、粘稠、红色、易溶于一片的菌落，SS上是红色或粉红色、或具有粉红中心的无色菌落，XLD上呈不透明黄色的菌落）。,制片1.载玻片准备：玻片先在95乙醇中去除油污，再在火焰上烧去粘附的乙醇，待冷，做好标记。2.涂片：在洁净无油腻的玻片中央放一小滴蒸馏水（或用接种环挑1-2滴水），用无菌的接种环挑取少量菌种与水滴充分混匀，涂成极薄的菌膜，涂布面积约1cm2。 3.干燥：涂片在室温下使其自然干燥，也可以小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。 4.固定：手执玻片一端，有菌膜的一面朝上，通过微火三次
3、（手指触摸反面不烫手为宜），待玻片冷却后再进行染色。,革兰染色：挑取可疑菌落涂在干净的玻片上自然晾干，用结晶紫（1液）覆盖细菌初染1min，清水冲洗干净玻片再滴加革兰染液（2液）媒染1min，清水冲去表面的染液，用95乙醇（3液）脱洗约30s（以乙醇不再有颜色为好），最后用稀释的复红（4液）复染30s。自然晾干后在显微镜下观察形态。荚膜染色,1.染色：玻片置于玻片搁架上，加适量（以盖满菌膜为度）草酸铵结晶紫（或石炭酸复红染液）于菌膜部位，染色1-2min。 2.水洗：斜置载玻片，在自来水龙头（或洗瓶）下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。 3.干燥：自然干燥或用吸水纸吸去涂片上的水，用吸水
4、纸时切勿将菌体擦掉。 4.镜检：用高倍镜和油镜观察并绘细菌形态并绘图于记录表中。,镜下形态：G-杆菌，卵圆形或球杆状细菌，长成双排列，有荚膜，无鞭毛。（如有需要，可进行荚膜染色，染色后菌体呈卵圆形或球杆状，成双排列，菌体外绕以明显的荚膜长较菌体宽2-3倍。）,生化鉴别定科：氧化酶试验（-）、IMViC（- - +）定属：KIA（AA+ -）、MIU（- - +）、 O/F（F）、鸟氨酸脱羧酶试验（-）定种：吲哚（-）编码鉴定血清学鉴定,氧化酶试验：氧化酶（细胞色素氧化酶）是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶。具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素C氧化，再由氧化型细胞色素C将盐酸二甲基对苯二胺或盐酸四甲
5、基对苯二胺氧化成红色或蓝色的醌类化合物。主要用于肠杆菌科细菌与假单胞菌的鉴别，前者为阴性，后者为阳性。奈瑟菌属、莫拉菌属细菌也呈阳性反应。 back,I（吲哚）：有些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚，与对甲基氨基苯甲醛结合，生成红色化合物玫瑰吲哚。主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。M（甲基红）：某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸可进一步分解为甲酸、乙酸等酸性物质，不再继续分解，故培养基pH在4.5以下，加入甲基红指示剂后呈紫红色（阳性）。有些细菌将分解葡萄糖产生的酸进一步转化为醇酮等非酸性物质，使培养基pH在6.2以上，加入甲基红试剂成橘黄色（阴性）。一般用于肠杆菌科各菌属的鉴别。
6、Vi：某些细菌分解葡萄糖生成丙酮酸，丙酮酸可进一步脱羧生成乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在碱性环境下被氧化成二乙酰，后者与蛋白胨中的精氨酸所含的胍基起作用，生成红色胍缩二乙酰，为VP试验阳性。若培养基中胍基含量少，加入少量含胍基的化合物如肌酸肌酐，可加速其反应。一般用于肠杆菌科各菌属的鉴别。C（枸橼酸盐）枸橼酸盐培养基中不含任何糖类，枸橼酸盐为唯一碳源，磷酸二氢铵为唯一氮源。如果细菌能利用铵盐作为唯一氮源，并能利用枸橼酸盐作为唯一碳源，在枸橼酸盐培养基上生长，并分解枸橼酸盐为碳酸盐，使培养基变碱，指示剂溴麝香草酚蓝由绿色变为深蓝色，为枸橼酸盐利用实验阳性。若细菌不能利用枸橼酸盐为碳源，则细菌不能生
7、长，培养基不变色。back,KIA（克氏双糖铁）克氏双糖铁斜面培养基，用酚红作指示剂，在酸性时呈黄色，碱性时呈红色，培养基中的葡萄糖含量仅为乳糖或蔗糖的1/10，若细菌只分解葡萄糖而不分解乳糖，分解葡萄糖产酸使ph降低，因此斜面和底层均先呈黄色，但因葡萄糖含量较少，所以生成的少量酸可因接触空气而氧化，并因细菌生长繁殖利用含氮物质而生成碱性化合物中和，使斜面部分又变成红色；底层由于处于缺氧状态，细菌分解葡萄糖所生成的酸类一时不被氧化而仍保持黄色。若细菌分解葡萄糖、乳糖产酸产气，斜面与底层均呈黄色，且有气泡。细菌产生硫化氢时与培养基中的硫酸亚铁作用，形成黑色的硫化铁。主要用于鉴别肠杆菌科细菌。ba
8、ck,MIU（动力、吲哚、尿酶）培养基为尿素、蛋白胨成分的半固体培养基，指示剂为酚红。具有色氨酸酶的细菌能分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚，加入吲哚试剂后，培养基上层的吲哚试剂会变红；具有尿酶的细菌能分解尿素产氨，使整个培养基变碱呈红色；有动力的细菌沿穿刺线扩散生长。back,O/F（氧化、发酵）不同细菌对不同的糖分解能力及代谢产物不同，这种能力因是否有氧气的存在而异。细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参与的，称为氧化型，氧化型细菌在无氧环境中不能分解葡萄糖。细菌在分解葡萄糖的过程中，可以进行无氧降解的，称为发酵型，发酵型细菌在有氧或无氧的环境中都能分解葡萄糖。不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。利
9、用此实验可以区分细菌的代谢类型。主要用于肠杆菌科细菌与非发酵菌的鉴别，前者均为发酵型，而后者通常为氧化型或产碱型。back,氨基酸脱羧酶试验：具有氨基酸脱羧酶的细菌，可分解氨基酸，使其脱掉羧基，生成胺和二氧化碳，称为脱羧反应；并使培养基变碱，可用指示剂显示出来。最常用的氨基酸有三种，L-赖氨酸脱羧形成尸胺，L-鸟氨酸脱羧形成腐胺，L-精氨酸脱羧形成精胺。本实验主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。back,（吲哚）：有些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚，与对甲基氨基苯甲醛结合，生成红色化合物玫瑰吲哚。主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。back,注意事项1、标本采集时要用无菌尿杯收集，条件允许时可采集二次晨尿或尿三杯的中尿进行细菌培养。2、标本接种等操作时要注意无菌操作。3、制片采取标本时要选取优势菌落进行涂片，涂片时要适量挑取细菌，涂开并使其均匀分布在载坡片上。4、染色时要正确掌握染色的时间和染液的顺序，洗脱时要根据涂片厚薄灵活掌握，并要尽量淋洗干净，以免复染效果不佳。5、镜检时要等染片晾干后再在显微镜下观察，以免油镜观察用的香柏油会溶解标本。6、生化试验时参照SOP文件进行操作。,质量保证1、检验前质量保证 检验申请 标本的采集与运送2、检验中质量保证 人员 试剂 培养基 设备 检验过程3、检验后质量保证 检验结果的审评和报告 检验后标本的处置,谢 谢！,
