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1、嵌合抗原受体-T细胞免疫治疗中流式细胞术动态监测调节性r淋巴细胞水平及其临床意义嵌合抗原受体(ChimeriCantigenreceptor,CAR)-T细胞免疫治疗是将人体T细胞经过基因工程手段体外修饰改造后，回输患者体内，用于治疗疾病。近几年通过优化改良，CAR-T细胞免疫治疗在血液肿瘤治疗上取得了突破性的进展,许多复发和难治性的急性白血病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤及浆细胞白血病患者重新获得完全缓解，是一种非常有前景的，能够精准、快速、高效，且有可能治愈癌症的新型精准靶向肿瘤免疫治疗方法1,2,3o调节性T淋巴细胞(reguIatoryTIymphocytes,Treg)以转录因子Fo
2、XP3的表达为特征，具有维持免疫耐受和预防炎症性疾病的功能4oTreg的过继治疗已被证明可以防止同种异体移植物的排斥反应并预防移植物抗宿主病5,6o这些临床前研究支持Treg作为一种极具前景的潜在治疗剂，可抑制免疫介导的不良炎症反应并促进移植和自身免疫性疾病中的免疫耐受4o有研究认为Treg细胞在肿瘤免疫中以免疫抑制作用为主7,8,实体瘤组织中大量的Treg浸润，可能也是CAR-T细胞免疫治疗在实体肿瘤中不能达到预期疗效的原因之一9o有研究指出，清除Treg有助于提高过继免疫治疗中CD8+T细胞的抗肿瘤功能10o大量T淋巴细胞功能亚群与CAR-T细胞免疫治疗疗效的相关性研究表明，记忆性T淋巴细
3、胞的存在及高占比是维持CAR-T细胞动力学持续性的关键因素，是CAR-T细胞免疫治疗预后良好的相关因素之一，而T细胞亚群中CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、NK细胞等比例与CAR-T细胞免疫治疗等疗效相关性并不明显11,但是关于Treg在CAR-T细胞免疫治疗过程中的变化以及与治疗的相关性研究未见明确报道。FOXP3是公认的Treg标记12,但是作为核内因子，在流式应用中需要经过复杂的破核膜染色操作才能被检出，且不能用于活细胞分选，具有一定局限性。近年来发现CD3CD4+CD25CD1271ow/-作为很好的胞膜指标可以帮助定量检测Treg13,14o本研究通过回顾研究接受输注CD19C
4、D22CAR-T细胞免疫治疗的复发/难治性B细胞恶性肿瘤患者资料，分析患者回输CAR-T细胞前后多色流式细胞术动态检测的外周血CD3+CD4+CD25CD1271ow-Treg水平,旨在探讨Treg与临床治疗反应，患者预后的相关性。对象与方法一、对象1 .对象：收集2019年7月至2021年5月华中科技大学同济医学院附属同济医院参与临床研究接受输注CDl9/CD22CAR-T细胞治疗复发/难治性B细胞恶性肿瘤患者82例，对其中23例有Treg动态检测结果的患者进行统计学分析。其中女性8例，男性15例，中位年龄49岁(35,59)o该临床研究为开放标签、单中心和单臂临床研究，研究方案经华中科技大
5、学同济医学院附属同济医院机构审查委员会批准，并在中国临床试验注册中心注册。根据赫尔辛基宣言，每位受试者都签署了书面知情同意书。研究对象经标准的氟达拉滨加环磷酰胺方案清淋预处理化疗后第4天序贯回输CD22和CD19CAR-T细胞进行免疫治疗。根据2014年1.Ilgano修订版的淋巴瘤疗效评价标准15对接受CD19CD22CAR-T细胞序贯输注治疗的患者进行疗效评价，回输后每个月进行一次疗效评价，半年后每2个月一次疗效评价，按随访截止期前，多次疗效评价中的最佳疗效对纳入研究的23例患者进行分组，研究对象在临床试验完成阶段最佳疗效达完全缓解(completeremission,CR)8例,部分缓解
6、(partiaIremission,PR)7例，疾病进展或无效(noresponse,NR)8例。2 .对照组：收集2020年至2021年来自华中科技大学同济医学院附属同济医院未接受CD19CD22CAR-T细胞输注的B细胞淋巴瘤患者16名。二、方法1 .仪器与试剂：安捷伦生物有限公司的Novocyte-D3000流式细胞仪及原装配套质控微球，清洗液，冲洗液，鞘液。单克隆检测抗体及试剂购自美国BDBioscience公司,Biolegend公司及ThermoFisher公司。2 .样本采集：依据临床试验方案，淋巴细胞亚群检测采样时间点为患者回输CAR-T前048h及回输后4、7、10、14、2
7、1、30、60、90d（窗口期12d）o使用乙二胺四乙酸二钾抗凝管采集患者清晨空腹状态下静脉全血样本24ml,并充分混匀，24h内转运至实验室，用于检测外周血淋巴细胞亚群及Treg细胞。3 .白细胞计数及流式样本检测：外周血样本采用日本希森美康血液分析仪（血细胞分析仪-XN系列）进行白细胞计数，取适量全血样本（约2X106个白细胞）至流式管，依次加入荧光素标记的抗人单克隆抗体CD45V500c.CD3FITC.CD16+56PE,CD4PercP,CD8APC-Cy7.CD19PE-Cy7.CD25APC.CD127BV421,避光孵育15min后使用BD溶血素裂解红细胞IOmin,1%牛血清
8、白蛋白溶液洗涤3遍后，300I磷酸盐缓冲液重悬，放入Novocyte-DSOOO流式细胞仪自动上样器，上机检测。4 .Treg的设门策略及数据分析：研究中使用多色流式检测患者外周血Treg细胞群，设门策略见图1,通过设门分析依次计算CD3+CD4+CD25+CD127dim-群体占CD4+T淋巴细胞，淋巴细胞及全部白细胞的比例。根据外周血白细胞计数，双平台法计算Treg细胞绝对数。TT/Allevents.T/AllGvents/POZlym/singletsoIds3oCD4-CD*65.03%WCD4*CD8*0.15%,喙CD4-CD8-4.47%-CD4CD8-30.35%CD4Per
9、CP-HTZAllevonts/PO/IymZsinglGts/CD3*-kSo-QCH,2二 HOL z583 QCD3+86.16%CD3FITC-HOOCoOOo- 0 3ooTZAIIovents/POlymsinglesCD3*CD3*CD4*CD3*CD4*30.44%T/Allevents/PO/IymZsingIets/CD3+图1免疫治疗后调节性T淋巴细胞（Treg）检测设门策略1A为前项散射光（FSe）/侧向散射光（SSC）二维散点图中去除死细胞及细胞碎片；IB为FSC-A/FSC-H散点图中设门去除黏连体；IC为CD45/SSC二维散点图中设门淋巴细胞群（IyrTI）;I
10、D为再次去除黏连体；IE为设门CD3+T淋巴细胞；1F为设门CD4+及CD8+群体；1G为设门分析CD3+CD4+细胞群；IH为设门分析CD25+CD127dim-Treg群体;图片上方显示逻辑设门5 .CAR-T拷贝数检测、铁蛋白检测及血清I1.-6水平检测：采用数字定量PCR方法检测患者外周血白细胞中CAR-T拷贝数水平，采用免疫比浊法检测外周血清中铁蛋白水平，化学发光的方法检测外周血清中I1.-6表达水平。三、统计学分析数据使用Prism8Vision8.3.1及SPSS22.0进行统计学分析。对于连续型变量，2组之间的差异性比较，若服从正态分布且方差齐则采用StUdent-t检验来进行
11、，否则用曼-惠特尼U检验。采用Cox-Stuart趋势存在性检验分析Treg水平在CAR-T回输后的变化趋势。通过方差分析比较不同疗效组别的患者Treg水平在不同时间段内是否存在差异。所有检验均为双尾，P0.05为差异有统计学意义。结果一、患者临床特征纳入恶性B细胞肿瘤患者23例，其中弥漫大B细胞淋巴瘤（D1.BC1.）18例，伯基特淋巴瘤（BUrkitt）2例，套细胞淋巴瘤（MC1.）2例，其他类型1例。52.1%的患者（12例）在入组前IPl评分大于2分。13%的患者（3例）疾病AnnabOr分期为Ill期，87.0%的患者（20例）Annabor分期为IV期。在接受CD19CD22CAR
12、-T细胞免疫治疗前，所有患者的中位治疗线数为3线，其中有患者最多经历了5线治疗，8例患者（34.7%）经历过自体或者异体的骨髓造血干细胞移植。对照组纳入同期未接受CAR-T细胞免疫治疗的恶性B细胞淋巴瘤患者16例，均为多线治疗后患者，均未在化疗后骨髓抑制期。其中男性9名，女性7名，中位年龄52（40,56）岁。二、Treg占比及绝对数的动态变化接受CD19CD22CAR-T细胞序贯输注的B细胞恶性肿瘤患者在清淋预处理后，回输前时间段的外周血TregCD4+T及Treg/1.ym均值明显高于未进行预处理化疗的对照组（P0.001）,而Treg#均值明显低于对照组（P0.001）,Treg/WBC
13、均值在回输前与对照组差异无统计学意义（P=0.265）（表1）。表1CAR-T细胞回输前与对照组的Treg占比及绝对数（了土s）指标()TregCD4(%)Treg/1.ym(%)Treg/WBC(%)Treg*(l)yjsa16733电611.910.900.350.2913.669.891320.427.9613.617.130.200.411811.52殖5.8936.531.1394.2610,0010.0010.265Treg/WBC及Treg#水平在CAR-T细胞回输前后不同时间段内均值水平见图2o经趋势性检验分析，TregCD4+T与Treg/1.ym在回输后随时间延长均有降低趋
14、势（P0.001）,Treg/WBC在回输后有升高趋势（P=0.01）,Treg#趋势检验差异无统计学意义(el.x8wl（P=O.911）o8060注：、.、.为毒群值图2Treg占比及绝对数在CAR-T细胞回输前后不同时间段均值水平（2A2D分别为23例患者在CAR-T细胞回输前，回输后115d,1630d以及31d以后时间段内TregCD4+T.Treg/1.ym.Treg/WBC.Treg#的水平,回输前时间段为回输CAR-T细胞前048h,同一患者在同一时间段内如果多次检测，则取均值作为该时间段Treg水平)三、Treg水平与CAR-T细胞免疫治疗疗效及安全性(一)调节性T细胞占比及
15、绝对数与CAR-T细胞免疫治疗最佳疗效的分析结果显示回输前时间段的TregCD4+T,Treg/1.ym.Treg/WBC水平在不同最佳疗效的患者组间差异有统计学意义(P0.001,P0.001,P0.05)(图3),进一步组间方差分析显示，最佳疗效为CR组患者回输前TregCD4+T(12.871.93)%、Treg/1.ym(6.352.84)%、Treg/WBC(0.050.05)%均值均明显低于PR组(29.685.49)%(P0.01),(21.852.10)%(P0.01),0.500.69(P0.05);回输CAR-T细胞后不同时间段内，不同疗效组别间Treg的水平差异均无统计学
16、意义。(二)Treg高水平组和低水平组患者的临床指标比较将研究对象CAR-T细胞回输后15d内TregCD4+T.Treg/1.ym.Treg/WBC及Treg#均值按照中位数各分为2组，高于中位数的为Treg高水平组，其余为Treg低水平组，比较每2组之间CAR-T拷贝数峰值、铁蛋白峰值、I1.-6峰值之间差异是否存在统计学意义。结果显示，CAR-T拷贝数峰值在TregCD4+T均值低水平组高于TregCD4+T均值高水平组(PTreg/WBC及Treg#动态变化。因临床试验方案设计时淋巴细胞亚群检测未设预处理前基线的采样时间点，故本研究纳入16例同期未接受CD19CD22CAR-T细胞输注
17、的B细胞淋巴瘤患者作为基线对照组。统计学分析发现研究对象在清淋预处理化疗后，CAR-T细胞回输前048h的TregCD4+T,Treg/1.ym水平明显高于对照组，但Treg绝对计数却明显低于对照组。通常外周血白细胞中各亚群的占比和绝对数是呈正相关的，为何Treg占比和绝对数在CAR-T细胞治疗中呈现相反的变化趋势？且该变化发生在CAR-T细胞输注之前？在血液肿瘤和实体肿瘤的研究中均有报道I1.-2是刺激肿瘤患者Treg增殖的重要细胞因子之一16,17o虽然有报道清淋预处理会增加I1.-2等细胞因子的释放18,但更合理的解释是Treg表达高水平醛脱氢酶，相对其他类型T淋巴细胞而言对清淋预处理方
18、案中的环磷酰胺更具有耐药性19,多项研究证实移植后大剂量环磷酰胺是预防异基因血液或骨髓移植后移植物抗宿主病的有效策略20,21,22,其中环磷酰胺能够清除效应性T淋巴细胞，而使调节性T细胞的优先恢复是其中一个重要原因。虽然Treg表现出对环磷酰胺更具有耐药性，但因预处理化疗对淋巴细胞整体的清除，故Treg绝对数在回输前显著低于对照组。因此在CAR-T细胞治疗中，受预处理化疗的影响，Treg的占比和绝对数出现了相反的变化趋势。而随着回输后CAR-T细胞的激活和扩增，CD8+效应性T淋巴细胞占比增高，导致CD4+CD25+CD127low-Treg细胞在淋巴细胞群体中占比逐渐降低，可以解释研究对象
19、在回输CAR-T细胞后，随着时间延长，外周血Treg/CD4+T、Treg/1.ym呈现下降趋势。CAR-T拷贝数反映CAR-T细胞在体内扩增的动力学，在Treg水平与CAR-T细胞免疫治疗反应的相关性研究中，CD19CD22CAR-T细胞回输后15d内TregCD4+T均值较低的患者，CAR-T拷贝数峰值更高，反映在回输早期CAR-T细胞扩增阶段，TregCD4+T越低，CAR-T细胞相对扩增得越好，理论上CAR-T细胞免疫治疗的疗效应该更佳。但本研究发现回输后不同时间段内Treg/CD4+T、Treg/1.ym占比以及Treg绝对数与预后并无相关性，原因可能有多个方面：（1）本研究分组例数
20、偏少，统计学差异不明显。（2）影响患者最佳疗效的因素很多，某一时间段的Treg水平或许不能作为影响疗效的单一影响因素。（3）本研究中使用流式细胞术检测Treg时，未添加识别CAR-T细胞的特异性抗体，无法区分来自于患者自身T淋巴细胞和扩增的CAR-T细胞中的CD3+CD4+CD25+CD127dim-Treg群体。因Treg能够抑制同种同型或同种异型CD4+CD25-和CD8+T细胞的活化、增殖4,故Treg对T细胞亚群的调节作用很可能与对CAR-T细胞淋巴亚群的调节作用没有差异。有研究指出，高剂量外源性I1.-2给药调节体内T细胞扩增的同时也介导人体调节性T细胞的扩增，从而影响了I1.-2治
21、疗的客观效果16,反过来，Treg细胞可以通过I1.-2实现扩增，但I1.-2同时也可以激活其他T细胞，从而抵消了调节性T细胞的保护作用。因此Treg的扩增与效应性CAR-T细胞激活和扩增之间的平衡可能最终决定了CAR-T细胞免疫治疗的疗效。在今后的研究中，使用特异性抗体标记CAR-T细胞，研究Treg细分类亚群和效应性CAR-T细胞之间的动态平衡关系，或许能为干预Treg以提高CAR-T细胞免疫治疗效果提供新的研究方向回输前15689111215 1630 31和理论依据。60rOO 4 2-CR-PRNR210-1111-回输前I5689111215163031回输前I5689111215
22、163031小图3Treg占比及绝对数在最佳疗效为CR、PR及NR的3组患者中随时间变化3A3D分别为TregCD4T、Treg/1.ym、Treg/WBC及Treg#在最佳疗效为CR、PR、NR3组患者回输后不同时间段的均值变化；a为回输前TregCD4+T.Treg/1.ym均值在3组患者组间存在统计学差异，P0.001;b为回输前Treg/WBC均值在3组患者组间存在统计学差异，P0.05综上所述，在CAR-T细胞免疫治疗过程中，预处理清淋使得外周血Treg占比相对升高，Treg在回输前的占比水平，与患者最佳疗效相关，回输后早期TregCD4+T低水平有利于CAR-T细胞的扩增。利用多色流式细胞术对Treg比例进行动态监测，对免疫治疗最佳疗效以及治疗反应的预测均有一定的临床意义。
