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1、实验步骤-参考205 Covalent Coupling-羧基修饰微球1、1ml微球（100mg/ml）在10ml激活缓冲液清洗2次。2、 第二次清洗后，微球重悬于10ml激活缓冲液，确保微球悬浮（辅助手段：涡流、声波降解、滚动），此时微球悬液的浓度为10mg/ml。3、 混合时添加100mg WSC（添加WSC可能会引起凝结成块，一般不大引起关注，应当通过孵化与生物分子解决）。4、 室温（18-25）下连续搅拌15min。5、 耦合缓冲液洗2次，重悬于5ml耦合缓冲液，如第二步，尽可能确保颗粒悬浮。6、 在5ml耦合缓冲液溶解蛋白（1-10X过量单层），结合微球悬浮和蛋白解决方案。7、 室温
2、下连续搅拌2-4h。8、 清洗 重悬于10ml淬灭溶液，轻轻混合30min，清洗，重悬于贮存缓冲液进行保存（理想的贮存浓度通常是10mg/ml）。9、 4保存。激活缓冲液-MES 或 DIW -羧基乳胶微球pH?耦合缓冲液-MES/DIW贮存缓冲液是什么？贮存缓冲液和清洗微球的缓冲液应保持一致。实验方法：共价结合-生成NHS中间活化酯二步法Water-soluble sulfo-N-hydroxysuccinimide can be added to increase coupling efficiency. The active ester intermediate formed by th
3、e N-hydroxy compound will replace the o-acylisourea intermediate formed by the WSC (unstable), is more stable to hydrolysis, and yet still highly reactive toward amines on the protein to be coupled. 此方法中，在EDC存在下，NHS通过与微球上的羧基反应形成中间活化酯。活化酯比EDC更稳定，不易水解。NHS / Sulfo-NHS可提高偶联效率。实验步骤u Bead activation1、 A方案
4、：每ml反应混合物加入下列各物：a 0.1mL 10x的Activation Buffer（10x的MES buffer通常用0.5M），其pH值为6.0-6.5；Buffer的组成根据蛋白种类的不同而改变，常用Buffer有醋酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、MES缓冲液。蛋白在等电点附近更易于吸附到微球上，因为在等电点附近，蛋白表面会有更多的疏水位点暴露出来。在这种情况下，抗体也更紧密，因此需要更多的抗体用于标记到微球上。然而，最终Buffer的选择，需要考虑最终抗体微球复合物的生物活性，因此，几个不同浓度的抗体和不同pH的反应Buffer应该进行优化选择。起始实验，反应Buffer的
5、离子强度应该在2550mM。b 0.1mL 10%的微球（100mg/ml），胶乳微球最终浓度为1%（w/v,10mg/ml）；c 0.23mL的50mg/mL的NHS的去离子水溶液；11.5mgd 一定体积 19.2mg/mL（100mM）的EDC的去离子水溶液。 EDC的用量，根据微球表面羧基浓度来计算。根据计算所需量，每mol的羧基应该再多加23mol的EDC。但是，根据功能性检测结果，还需要进一步的优化。e 用去离子水（DIW）最后定容为1.0mL；1、 B方案：每ml反应混合物加入下列各物：a、0.1mL 10%的微球（100mg/ml），胶乳微球最终浓度为1%（w/v,10mg/m
6、l）； 在1ml Activation Buffer（一般可用0.5M MES缓冲溶液）清洗2次。 微球置于干净的离心管（离心10000rpm5min）Tip头小心弃上清 第二次清洗后，微球重悬于一定体积 Activation Buffer，确保微球悬浮。 重悬辅助手段：涡流、声波降解、滚动等，此处将离心管在超声波下声浴60s。b、0.23mL的50mg/mL的NHS的去离子水溶液；11.5mgc、一定体积 19.2mg/mL（100mM）的EDC的去离子水溶液；d、Activation Buffe最后定容为1.0mL。2、 在室温（18-25）搅拌反应15-30分钟 Or 漩涡混匀，室温下，
7、在旋转混合器或轻微涡流或振荡器上放置2小时。此步骤，微球的凝集经常能观察到！因为接下来的步骤中，EDC会将相邻两个微球上的抗体连接起来，从而引起微球凝集或者中和微球表面的羧基或者两者情况都发生。调节pH到6.5或超过6.5，优化共价反应，对微球的分散有帮助。如果反应结束后微球凝集现象仍然发生，用新鲜的buffer清洗除去多余的EDC和游离的蛋白，一般会使得凝集颗粒再分散。如果在最终的产品中凝集依然发生，尝试稀释微球，一开始可以稀释到原来的50%浓度。如果稀释后凝集依然发生，可以尝试在所有Buffer中加入Tween20或Tergitol NP9等非离子型表面活性剂。这些表面活性剂不会干扰颗粒的
8、活性或共价结合，但是需要注意的是，要确保在这种表面活性剂存在下微球共价结合的抗体的稳定。3、 离心 10000 rpm5min，小心弃去上清。u Coupling the capture molecule to the activated beads4、 Coupling Buffer清洗 用MES缓冲液或DIW洗涤胶乳微球悬浮物两次；目的：除去未反应的NHS和EDAC移除未结合的化合物或蛋白，如果颗粒直径大于0.2um，可以通过离心的方法，微球可以重新悬浮，然后搅拌，接着温和的超声分散。离心力不宜过大，这样会导致微球不易分散。也可以用超滤或透析来纯化。当用超滤时，滤膜孔径应该足够大，使得游离
9、的蛋白能自由的通过滤膜。用于清洗微球的buffer应该和storage buffer一样。用于清洗的buffer的任何缓冲液成分及pH的改变，都会引起蛋白的脱落。5、 重新将胶乳微球在Coupling Buffer中悬浮，使其浓度为1%（w/v）；6、 同时，用Coupling Buffer稀释结合蛋白（1-10x过量单层）。buffer一般为pH79，50-100mM，最终的浓度为1mg/mL；7、 稀释完微球后，立即加入1mL的蛋白溶液（胶乳微球、蛋白质和缓冲溶液的浓度分别为0.5%（w/v）、0.5mg/mL、25-50mM）；蛋白溶液应该在快速的搅拌下，快速加入到微球悬液中。小体积的话
10、，可以进行涡旋混合。当大体积时，应该在烧瓶或烧杯里搅拌剧烈些，蛋白溶液快速加入到漩涡中间。8、 将混合物置于水平振荡器，室温轻震2小时；9、 按1mL反应混合液加入2.5L/1L乙醇胺混合，搅拌反应10-30分钟； Quenching Solution-乙醇胺，可以和加入蛋白反应后多余的羧基位基团反应。10、清洗 ，storage buffer清洗两次。（Note 3/4）除去未结合的蛋白质和乙醇胺。11、重悬于适宜浓度的storage buffer（通常是10mg/ml）。12、4保存。缓冲液 Activation Buffer: MES Coupling Buffer:MES or DIW
11、 Storage Buffer:DIW or PBS？The buffer should not contain certain compounds that will interfere or compete with the reaction or ligand. For example, phosphate and acetate buffers can reduce the reactivity of carbodiimides, and are thus not recommended for use as activation buffers when coupling to CO
12、OH-modified microspheres. A popular alternative in this instance is MES. Also, buffers containing free amines, such as Tris or glycine, should be avoided when working with amine reactive chemistries.Blockers Blocking agents are often coated on beads (via adsorption) following the coupling reaction.
13、These compounds are used to minimize nonspecific interactions between the coated bead and non-target molecules in the sample.Blockers are often added to the storage buffer in varying amounts, standard concentrations being anywhere from 0.05% to 0.1% (w/v).技术说明1微球总表面积与其粒径成反比，抗体的具体用量需要根据使用微球的大小做相应改变；
14、单位质量的微球表面积（m2/g） ： A/M = 6/PD 其中 D= 微球粒径（m） P = 微球密度 (聚苯乙烯 1.05g/ml) 例如：0.8m的聚苯乙烯微球，A/M = 6/1.050.8 = 7.14 m2/g 1.6m 的聚苯乙烯微球，A/M = 6/1.051.6 = 3.57 m2/g 2虽然疏水性吸附与缓冲液 pH值无关，但反应缓冲液的 pH值对被吸附蛋白质的构象有较大影响，进而影响其吸附效率。在等电点 pH值条件下，更多的蛋白质疏水性吸附点暴露出来，利于其与微球作用； 3绝大部分的蛋白质很快被吸附，延长蛋白质与微球混合时间有助于蛋白质正确定位。聚苯乙烯乳胶微球的性质（1） 折射率 Refractive Index 589nm下 1.59（2） 密度 1.05g/cm3 （3） 玻璃转化温度 Glass Transition 95
