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1、第十六章抗生素类药物分析,第一节 概述,一、抗生素的定义及特点,低化学纯度同系物多、异构体多、降解物多,活性组分的变异性生产过程中条件的变化,不稳定性不稳定性结构,是指“生物在其生命活动中产生的，能在低微浓度下有选择地抑制或影响它种生物机能的化学物质的总称”,抗生素的分类,内酰胺类抗生素四环素类抗生素氨基糖苷类抗生素大环内酯类抗生素多烯大环类抗生素制菌霉素、两性霉素多肽类抗生素放线菌素、多黏菌素酰胺醇类抗生素氯霉素抗肿瘤类抗生素其他抗生素,二、抗生素类药物的分类按化学结构分,三、抗生素类药物的细菌耐药性,三、抗生素类药物的细菌耐药性,1、耐药性的种类固有耐药性：天然耐药性，由细菌染色体基因决定
2、获得性耐药性：,2、耐药的机制（1）产生灭活酶，使抗菌药失活 如-内酰胺酶（2）抗菌药物作用靶位改变（3）降低细菌外膜通透性（4）影响主动流出系统,四、抗生素药物的质量分析,鉴别试验,1、官能团的显色反应特殊基团的反应2、光谱法特征吸收3、色谱法保留行为4、生物学方法抗菌能力,检查,1、影响产品稳定性的检查项目水份、酸碱度等2、控制有机和无机杂质的检查项目3、与临床安全性密切相关的检查项目异常毒性、热原等4、其他检查项目其他共存组分,含量或效价测定,1、微生物检定法比浊法管碟琼脂扩散法抑菌圈,Potency:是指每ml或每mg中含有某种抗生素有效成分的多少 U/mg,是以抗生素对微生物的杀伤或
3、抑制程度为指标来判断效价的一种方法,方法,灵敏度高、需用量少适用范围广纯品、不纯品、已知的和新的可一次测定同类型抗生素的总效价无需分离纯化与临床的应用要求一致操作繁琐、费时费力误差较大,是结构复杂和多组分抗生素效价测定的首先方法,优点,含量或效价测定,1、微生物检定法,缺点,2、物理化学法 HPLC LC-MS UV 容量法准确可靠、专属性高、操作简单、省时、样品用量少,1、对结构已知或提纯的抗生素2、需要标准品对照,仪器分析方法,含量或效价测定,第二节 -内酰胺类抗生素,-内酰胺类抗生素,6-氨基青霉烷酸（6-APA）；青霉素类；,7-氨基头孢菌烷酸（7-ACA）；头孢菌素类；,一、结构及分
4、类,氢化噻嗪环,氢化噻唑环,青霉素,（青霉素钾、钠）,氨苄西林（氨苄青霉素）,阿莫西林（羟氨苄青霉素）,普鲁卡因青霉素,头孢氨苄,头孢羟氨苄, 理化性质,1、酸性与溶解性2、旋光性3、紫外吸收特性4、不稳定性,酸性,一、结构特点与性质,与碱金属(Na+、K+)成盐,（一）羧基,易溶于水,与有机碱(普鲁卡因)成盐,难溶于水,普鲁卡因青霉素,（二）手性C,头孢菌素类 C6 C7,青霉素类 C3 C5 C6,旋光性,（三）共轭体系,青霉素类 母核无明显UV 多数有苯环取代基,UV,（四）内酰胺环的不稳定性,水溶液 不稳定,干燥纯净 稳定,不稳定性因素,四元环张力大,酰胺键易水解,含水量 纯度,（四）
5、内酰胺环,与含水量和纯度密切相关,青霉素的降解途径,青霉素的降解产物,青霉噻唑酸青霉素酶青霉酸强酸性环境青霉烯酸弱酸性环境青霉醛强酸性-加热青霉胺强酸性-加热/青霉素酶-重金属,降解产物,二、鉴别反应,（一）显色反应,1、异羟肟酸铁反应,2. 茚三酮反应,-氨基,蓝紫色,3. 双缩脲反应,似肽键,紫,4. 与重氮苯磺酸反应,橙黄色,重氮苯磺酸,-,-,5,6,OH,H,C,（偶合）,酚羟基,1. K+、Na+的火焰反应,（二）各种盐的反应,2. 沉淀反应（青霉素盐）,遇酸,在过量HCl或有机溶剂中溶解,白,青霉素,青霉素钠,青霉素钾,+,H+,3. 重氮化 - 偶合反应,重氮化-偶合反应,芳伯
6、氨基,样品、分解产物,Cu2+,2、,IR法,3180cm-1N-H,内酰胺 C=O,1780cm-1,3470cm-1O-H,1690cm-1仲酰胺C=O,1250cm-1C-O,以阿莫西林为例,对照品对照法,三、杂质检查,药物 检查项目 检查方法 头孢他啶 聚合物 HPLC法 头孢曲松钠 头孢哌酮钠 头孢噻肟钠 头孢呋辛酯 有关物质和异构体 HPLC法 头孢氨苄 有关物质 反相TLC法 青霉素钾（钠） 吸收度 紫外分光光度法,1.头孢他啶聚合物的测定 分子排阻色谱法 固定相：葡聚糖凝胶G-10 流动相A：3.5%硫酸铵的0.01mol/L磷酸盐缓冲液 流动相B：0.01%十二烷基硫酸钠 对
7、照品溶液：头孢他啶对照品 100g/ml,1）系统适用性试验：理论塔板数和拖尾因子用1mg/ml蓝色葡聚糖2000、流动相A测定；重复性用对照品溶液、流动相B测定。 N不低于900，拖尾因子0.751.5，峰面积的RSD应小于5.0%2）测定方法 进样供试液，用流动相A；进样对照液，用流动相B。以外标法计算，含头孢他啶聚合物以头孢他啶计不得超过0.3%。,2.头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查 固定相：ODS 流动相：0.2mol/L磷酸二氢铵-甲醇（62:38） 1）头孢呋辛酯3-异构体的制备：头孢呋辛酯对 照品+流动相 头孢呋辛酯2-异构体。2）系统适用性试验：各异构体之间的R1.5，以
8、头孢呋辛酯A异构体计算n1500。,3）异构体： 相对保留时间 1-被测物 2-标准物异构体 相对保留时间 判断B异构体 0.85 供试液谱图中A异构体的峰面积A异构体 1.0 与A、B异构体峰面积和之比应 为0.480.55。,异构体A,异构体B,头孢呋辛,3.头孢氨苄中有关物质的检查-反相TLC法 固定相：活化后的硅胶G板置5%（V/V）正十四 烷的正己烷溶液中，展至顶部，凉干 展开剂：0.1mol/L枸橼酸-0.2mol/L磷酸氢二 钠-丙酮（120：80：3） 供试液：本品 50mg/ml 对照液（1）：本品 0.5 mg/ml 对照液（2）：-苯甘氨酸 0.5 mg/ml 对照液（3
9、）：7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸 0.5 mg/ml,结果判断：供试液如显杂质斑点，与对照液（2）（3）位置相同上所的斑点比较，其颜色不得更深；如显其他杂质斑 点，与对照液（1）所显的主斑点比较，其颜色不得更深。,4.青霉素钠（钾）的吸收度检查： 供试液 1.80mg/ml， 结果判断：A280不得大于0.10,（一）高效液相色谱法原理：利用青霉素类抗生素在一定条件下在反相硅胶上的保留行为的不同而实现高效分离，并与标准品相对照，而对其进行定量的一种方法。优化色谱分析条件（1）Column -CN ODS C18 C8 -Ben（2）mobile phase/flow rate（3）column
10、temperature （4）detection wavelength（5）workstation sample preparation,四、含量测定-容量法和仪器分析法,实验注意事项（1）色谱峰要达到较好的分离基线分离(base separation)（2）需要标准品对照，用外标法定量（3）可同时测定多个组分的含量（4）需要排除制剂中辅料等杂质对测定的干扰,（二）生物样本中-内酰胺类抗生素的分析,血浆尿样唾液胆汁,生物样本,色谱柱：Hypersil ODS C18 (200 mm4.6 mm, I.D. 5m)样品制备：取血浆200L，加入内标5L，再加入HCLO4，窝旋提取,Interna
11、l standard IS,第三节 氨基糖苷类抗生素,第三节 氨基糖苷类抗生素,链霉素 双氢链霉素新霉素 卡那霉素庆大霉素 巴龙霉素,链霉胍 + 链霉糖 + N-甲基-L-葡萄糖胺,链霉素：,链霉胍,链霉糖,N-甲基-L-葡萄糖胺,D-葡萄糖胺+脱氧链霉胺+D-核糖+巴龙霉糖,巴龙胺,巴龙二糖胺,绛红糖胺 + 脱氧链霉胺 + 加洛糖胺,绛红糖胺,紫素胺,2-脱氧链霉胺,加洛糖胺,N-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺,庆大霉素C1 R=H R1、R2=CH3 庆大霉素C2 R=R2=H R1=CH3 庆大霉素C1a R、R1、R2=H 庆大霉素C2a R=CH3 R1= R2=H 庆大霉素C2b
12、R=R1=H R2=CH3,庆大霉素C复合物,多与硫酸成盐,碱性,（一）,链霉素 pH57.5庆大霉素 pH212,羟基胺, -氨基酸结构,（二）Molisch反应 具有五碳糖或六碳糖的氨基糖苷类抗生素经酸水解后，在盐酸作用下脱水生成糠醛或羟甲基糠醛，加入 萘酚（红紫色）或蒽酮（蓝紫色）,红紫色, 萘酚,蓝紫色,蒽酮,（三）N-甲基葡萄糖胺反应（Elson-Morgan反应）,水解产生的N-甲基葡萄糖胺在碱性溶液中与乙酰丙酮合成吡咯衍生物，再与对二甲氨基苯甲醛的酸性醇溶液反应，生成樱桃红色缩合物。,樱桃,樱桃,（四）麦芽酚反应链霉素的特征反应 链霉素水解得到的链霉糖经分子重排使环扩大形成六元环
13、，然后消除N-甲基葡萄糖胺，再消除链霉胍，生成-甲基-羟基-吡喃酮（麦芽酚），该化合物与Fe3+在弱酸性溶液中形成红紫色配位化合物。,紫红,麦芽酚,（五）坂口反应链霉胍的特有反应链霉素的水解产物链霉胍与NaBrO2反应得产物1；8-羟基喹啉也和NaBrO2反应得产物2。产物1和产物2再相互作用生成橙红色化合物。,（八）色谱法,（1）TLC法：硫酸庆大霉素的鉴别 点样：供试液：展开、凉干、碘蒸气中显色 对照液 判断：供试液与对照液所显斑点的颜色与位 置应一致。 点样：供试液 对照液：硫酸链霉素标准品,判定法：供试液中主斑点的位置、颜色、大小应与对照液 相同。,（2）HPLC法：硫酸庆大霉素的鉴别
14、 比较供试液与对照液各组分的保留时间。,（八）色谱法,三、 有关物质检查及组分分析（一）链霉素中链霉素B的检查TLC法硅胶G板（使用前需活化）、展开剂 丙酮-冰乙酸-甲醇（50: 25: 25）、0.2二羟萘的乙醇20硫酸混合液（二）庆大霉素中组分C的检查衍生化后HPLC色谱柱、流动相、检测波长、衍生化条件的摸索 组分C的毒副作用和耐药性与庆大霉素有差异，导致产品的效价和临床疗效,+,+,4,10.4,.,pH,吲哚衍生物,巯基醋酸,邻苯二醛,氨基,max = 330nm,衍生化原理,1.,（二）庆大霉素中组分C的检查衍生化后HPLC,1-烷基硫代-2-烷基异吲哚衍生物,RPHPLC,规定 C
15、1 2550% C1a 1540% C2a +C2 2050%,峰面积归一化法,微生物检定法 各国药典主要采用,HPLC法 常用于体内药分 析,第四节 四环素类抗生素,第四节 四环素类抗生素,Tetracyclines TC,1、酸碱两性C4（二甲氨基）、C10（酚羟基） 二甲胺基弱碱性 酚羟基、烯醇型羟基弱酸性 （1）与酸、碱均能成盐 （2） 强酸或强碱中溶解度会增加,（二）性质,2、旋光性含有手性中心（一般为左旋）3、紫外吸收特性具有共轭双键体系 4、紫外灯照射下产生荧光，降解产物也具有荧光 盐酸土霉素 经酸性降解后，在紫外光下呈绿色荧光； 盐酸金霉素 经碱降解后，在紫外光下呈蓝色荧光；
16、盐酸四环素 经碱降解后，呈黄色荧光。 可区别不同的四环素类抗生素。,（二）性质,5、不稳定性对各种外界条件，包括氧化剂、酸、碱，易形成差向、脱水和异四环素，颜色加深,（二）性质,（1）差向异构化,弱酸性环境,ETC,差向四环素,a、酸性下降解,（2）降解反应,强酸性环境,ATC,脱水四环素,b、碱性下降解,（2）降解反应,盐酸土霉素的鉴别,EDTA 克服痕量金属造成的 拖尾现象,比较保留时间,三、,特殊杂质检查, 4-差向四环素（ETC） 脱水四环素（ATC） 差向脱水四环素（EATC） 盐酸金霉素（CTC）,HPLC法（2010版）,盐酸四环素,四环素有关物质TLC图,4,0.5,0.5,2
17、,nm,max,355,268,l,、,盐酸四环素,杂质吸收度,取供试品配成每10mg/ml的溶液至4cm的吸收池中，在530nm处测定，其吸收度不得超过0.12。,应严格控制温度和时间,HPLC法,盐酸四环素的测定 系统适用性试验：盐酸四环素、有关 物质及ATC峰间的 分离度均应符合要 求。 定量方法：外标法以峰面积计。,第五节 抗生素类药物中高分子 杂质的检查,第五节 抗生素类药物中高分子 杂质的检查,检查原因：抗生素所致速发型过敏反应主要与药物中存在的高分子杂质有关。1.高分子杂质 分子量大于药物本身的杂质总称。,蛋白、多肽、多糖或抗生素与蛋白、多肽、多糖的结合物。主要来自于发酵工艺。致
18、敏，如青霉噻唑蛋白、青霉噻唑多肽。 药物的自身聚合物，来自于生产、贮存过程。可引发过敏。,外源性杂质,内源性杂质,2、基本结构与特点对青霉素而言,青霉噻唑多肽外源性的（24003500Da）青霉素聚合物内源性的（聚合度） 母核参与的聚合反应 侧链参与的聚合反应,分类,（1）生产过程中的任何蛋白或碎片都可带入产品中，易与药物形成多肽类杂质（2）形成的聚合物也可发生不同程度的降解（3）异构体之间可以相互聚合L-L、D-D、L-D（4）高分子杂质与生产工艺密切相关,特点,3、高分子杂质的控制方法,（1）高效液相色谱法（2）凝胶色谱自身对照外标法 Sephadex G-10（3）离子交换色谱,凝胶色谱
19、法：利用凝胶的分子筛作用，让药物分子自由的进入到凝胶颗粒内部，而高分子杂质被排阻的原理进行的。故此大分子则先流出色谱柱，小分子后出峰而得以分离。,高分子杂质的分析方法,（1）蓝色葡聚糖在高分子分离中的 N2500/m，拖尾因子0.751.5（2）峰面积的RSD5,色谱适用性条件,HPLC系统简单测定系统,分析方法,练习与思考,A型题,1. 具有6-APA的药物是A. 青霉素钠 B. 硫酸庆大霉素C. 盐酸土霉素 D. 盐酸四环素 E. 头孢克洛,练习与思考,A型题,2. 具有-内酰胺环结构的药物是A. 阿司匹林 B. 奎宁C. 四环素 D. 庆大霉素 E. 阿莫西林,练习与思考,A型题,3.
20、硫酸链霉素、硫酸庆大霉素的鉴别方法是A.三氯化铁反应 B. 硫色素反应 C. 茚三酮反应 D.与碱性酒石酸铜试液反应 E. 双缩脲反应,练习与思考,A型题,4. 在弱酸性（pH 2.0-6.0）溶液中可发生差向异构化的药物是A. 四环素 B. 土霉素 C. 青霉素 D. 多西环素 E. 美他环素,B型题,A.焰色反应 B.硫色素反应 C.硝酸反应 D. 三氯化锑反应 E. 麦芽酚和坂口反应 1.青霉素钠 2. 硫酸链霉素 3. 维生素B1 4. 维生素A,A,E,B,D,5. 能用于链霉素鉴别的有AN-甲基葡萄糖胺反应 B. 麦牙酚反应 C. 坂口反应D. 硫色素反应 E. 茚三酮反应,简答题：1、简述四环素类药物的不稳定性。2、简述氨基糖苷类药物的结构特点与鉴别反应。,
