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1、基本要求,一、掌握定量分析方法验证的效能指标。 二、熟悉定量分析样品的前处理方法。 三、了解定量分析样品的前处理方法的 进展及在药物分析中的应用。,含量测定： 药物的含量测定系指运用化学、物理化学或生物学的方法测定药物中主要有效成分的含量。,第一节 容量分析法,（一）容量分析法的特点： 常用于测定高含量或中含量组分，原料药含量测定首选 比较准确（相对误差0.2%）； 操作简单、快速；仪器普通易得；,（二）有关计算 1.滴定度（T）： 每1ml规定浓度的滴定液相当于被测物质的质量(mg) 2.滴定度的计算 aA（待测物） + bB（滴定液） cC + dD a b T/M 1m,T = ma/b
2、M,m：滴定液浓度 (mol/L)M：被测物分子量,3.百分含量的计算 （1）直接滴定法设至终点时，消耗滴定液体积为V ml则药物实测质量为VT,浓度校正因子,W：供试品取样量,（2）剩余滴定法（回滴定法、返滴定法） 药物 + A（定、过量） 剩余的 A + B （回滴）V 空白试验V0,光谱光谱分析法分光光度法分类 紫外-可见分光光度法 红外分光光度法 原子吸收分光光度法 荧光分光光度法 火焰光度法,第二节 分光光度法,二、光谱分析法 （一）紫外-可见分光光度法 吸收光谱范围：紫外：200400nm 可见：400760nm 灵敏度高，可达10-4g/ml -10-7g/ml 1. 特点 准确
3、度高，RSD（%）为2% -5% 仪器价格低廉，操作简单，易普及，应用广范 2. 朗伯-比耳定律 A = ECL 吸收系数： 摩尔吸收系数 研究分子结构 百分吸收系数 含量测定,3.仪器的校正和检定 波长的校正：汞灯中的几根较强的谱线或用仪器自身 所带的氘灯的特定谱线为参照进行校正 吸收度准确性的检定：重铬酸钾的硫酸溶液，规定波 长处测定，应符合规定 杂散光的检查：一定浓度的碘化钠和亚硝酸钠溶液， 规定波长处测定透光率，应符合规定,4. 对溶剂的要求: 含杂原子的有机溶剂通常具有很强的末端吸收 它们的使用范围均不能小于截止使用波长 石英吸收池、空气为空白 (nm) 溶剂+吸收池A 220240
4、 0.40 241250 0.20 251300 0.10 300以上 0.05,5. 测定方法 要求供试品溶液的A应在0.3 0.7 1）对照品比较法：A供A对C供C对原料药：制剂：,2）吸收系数法：,注意： 应100 应注意仪器的校正和检定： 作为计算浓度的因数进行定量的方法，不是任何情况下都适用的，特别时单色光不纯的情况下，A会随仪器不同而变化，误差较大 但若认定一台仪器，固定其工作状态和测定条件，则C和A间的关系在多数情况下仍符合LambertBeer定律,3）计算分光光度法： 方法有多种，具体按每种药物规定的方法进行。如：VA的三点校正法,4）比色法 加入显色剂后，按照对照品比较法测
5、定 影响显色因素很多，故需注意平行操作 空白溶剂：溶剂+显色剂，同法处理,（二）荧光分析法 灵敏度高，可达10-10g/ml 10-12g/ml 在低浓度进行测定，防止自熄灭作用 1. 特点 用基准溶液代替对照液校正仪器灵敏度 制备荧光衍生物，可提高灵敏度和选择性 干扰因素多，需做空白实验 样品用量少，操作简单，应用范围较广,2.含量测定 原理：当激发光强度、波长、所用溶剂及温度等条件固定时，物质在一定浓度范围内，其荧光强度R与该物质浓度C成正比 方法：对照品比较法 计算：,第三节 色谱法 根据混合物中各组分的色谱行为差异，先行分离后再在线或离线对各组分逐一进行分析的方法，是分离分析混合物的最
6、有力手段。 按分离原理：吸附；分配；离子交换；空间排阻 分类 按分离方法：PC；TLC；柱色谱；GC；HPLC,特点：高灵敏度、 高效能、高速度、应用广泛,（一）HPLC法 1. 对仪器一般要求 固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改变 其他均可适当改变 色谱图20分钟内记录完毕 2. 系统适用性试验 色谱柱的理论板数：n = 5.54(tR /Wh/2)2 分离度：R = 2（tR1 tR2)/(W1 + W2); 应大于1.5 重复性：对照液连续进样5次，峰面积RSD2.0 拖尾因子：T = W0.05h/2d1 应在0.95 1.05,液质联用仪,质谱检测器,流动相：对于以C18为
7、固定相的反相色谱系统，常用甲醇-水，间或加以乙腈、缓冲液等为流动相，有机溶剂比例通常不低于5,四元泵,自动进样器,色谱柱,填充剂常用：十八烷基硅烷键合硅胶,检测器,测定方法1)内标法加校正因子测定供试品中主成分含量,峰面积 含量,对照液（R）： AR CR,内标液（S）： AS CS,供试液（X）： AX CX,f= ,AS/CS,AR /CR,f= ,AS / CS,Ax /Cx,Cx=f ,Ax,AS / CS,2)外标法测定供试品中主成分含量,对照液（R）： AR CR,供试液（X）： AX CX,要求：进样量准确、操作条件稳定,CX CR,AX AR,CX,CR AX,AR,（二）GC
8、法1. 对GC仪器一般要求 载 气：氮气 色谱柱：填充柱或毛细管柱 填充柱：内径24mm，长110m，内装吸附剂 高分子多孔小球或涂渍固定液的载体 毛细管柱：内径0.20.5mm，长10100m，一般为空 心柱，内壁或载体经涂渍或交联固定液,检测器：氢火焰离子化检测器色谱图：30分钟内记录完毕,2. 色谱适用性实验：同HPLC 3. 测定法：同HPLC,第四节 药品分析方法验证 目的：证明采用的方法适合于相应检测要求。 起草药品质量标准 生产工艺变更 制剂组分改变 原分析方法修订,验证内容：准确度、精密度、专属性、检测限、定量限、线性、范围和耐用性,均需对分析方法进行验证,一、准确度（accu
9、racy）：测量值与真实值接近的程度表 示: 回收率测定方法： 回收试验 加样回收试验,含量测定方法的准确度 1. 原料药：可用已知纯度对照品或供试品进行测定；或与已知准确度的另一方法测定的结果进行比较 2. 制剂：考察其他组分和辅料对回收率的影响 用含已知量被测物的制剂各组分混合物（包括制剂辅料）进行测定，回收率计算同原料药 向制剂中加入已知量的被测物进行测定 与已知准确度的另一方法测定的结果进行比较具体做法： 测定高、中、低三个浓度，n=3, 共9个数据来评价回收率；用UV和HPLC法时，一般回收率可达98%102%；容量法可达99.7%100.3%,二、精密度（precision ）：,
10、定 义: 同一样品多次测量值之间相互接近的程度表 示：偏差，标准偏差,相对标准偏差 1. 偏差(deviation ,d) d = 测得值-平均值=Xi-X2. 标准偏差（standard deviation,SD或S） S =(Xi X)2/(n-1)1/23. 相对标准偏差(relative standard deviation,RSD) RSD=标准偏差/平均值100%=S/X 100%,重复性: 同一实验室,同一人多次测定的精密度中间精密度: 同一实验室，不同人，不同仪器测定的精密度重现性: 不同实验室，不同人测定的精密度数据要求 均应报告标准偏差、相对标准偏差和可信限,三、专属性（s
11、pecificity）:,指在其他成分(如杂质、降解产物、辅料等)可能存在下，采用的方法能准确测定出被测物的特性 （鉴别、杂质检查、含量测定方法，均应考察其专属性） 1.鉴别反应 应能与其它共存的物质或相似化合物区分，不含被测组分的样品均应呈现负反应,2.含量测定和杂质测定 色谱法和其他分离法，应附代表性的图谱，以说明专属性。 图中注明各组分位置，色谱法中分离度应符合要求。 在能获得杂质的情况下，可加到试样中，考察对结果的干扰。 在杂质和降解物不能获得的情况下，可用以验证方法和药典方法进行对照；也可用对试样加速破坏的方法，比较两种方法。,四、检测限（ limit of detection， L
12、OD) 是指试样中被测物能被检测出的最低浓度或量，是限度检验指标。它无需测定，只要指出高于或低于该规定的浓度或量即可。1.目视法 用含已知浓度被测物的试样进行分析，目视确定能被可靠地检测出的被测物的最低浓度或量，常用于显色鉴别法，TLC 2.当用GC和HPLC法时，一般以S/N2或3时的相应浓度来确定检测限。,五、定量限（ 1imit of quantitation， LOQ) 是指样品中被测物能被定量测定的最低量，其测定结果应具一定准确度和精密度。 杂质和降解产物进行定量测定时，要求LOQ。 常用信噪比法确定定量限。 一般以S/N=10时相应的浓度进行测定。,六、线性（linearity ）
13、 是指在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度或量直接呈正比关系的程度。 回归方程的相关系数（r）越接近1，表明线性越好 可用一贮备液经精密稀释，或分别精密称样，制备一系列（至少5份）供试液进行测定，以响应值对浓度作图，建立回归方程，求出r 如UV：制备一个标准系列，浓度点n =5 A=0.3-0.7 建立回归方程C = aA + b r 0.9999,线性的偏离,七、范围 （range） 是指达到一定精密度、准确度和线性、测试方法适用的高低限度或量的区间。,如原料药和制剂含量测定：应为测试浓度的80%120% 制剂含量均匀度检查：应为测试浓度的70%- 130%。 溶出度或释放度中的溶出量
14、测定：应为限度的20%。,八、耐用性（robustness） 是指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度。典型的变动因素有： 被测溶液的稳定性、样品提取次数、时间等。HPLC变动因素有： 流动相组成与pH，色谱柱，柱温，流速等。GC变动因素有： 色谱柱，固定相，担体、柱温、进样口和检测器温度等。,检验项目和验证内容：, 已有重现性验证，不需验证中间精密度 如一种方法不够专属，可用其他分析方法予以补充 视具体情况予以验证,第五节 定量分析样品的前处理方法 一、概述 1.结构特征与分析方法之间的关系 含卤素有机药物 R-X （F，Cl, Br, I ） 卤素与芳环相连 Ar-X 结合牢
15、固 卤素与脂肪链相连 R-X 结合较不牢固 含金属有机药物 含金属有机药物 R-O-Me，有机酸或酚的金属盐/配位化合物； 结合不牢固，可直接测定 有机金属药物 R-Me ，结合牢固，适当处理后测定,不经有机破坏的分析方法2. 药物分析中常用的分析方法 经有机破坏的分析方法,二、不经有机破坏的分析方法（一）直接测定法 例如：富马酸亚铁的含量测定,终点： 邻二氮菲(+Fe3+),溶于热稀矿酸,指示剂:邻二氮菲,(+Fe2+),红色,淡蓝色,Fe3+,Fe2+,Ce4+,（二）经水解后测定法 1. 碱水解后测定法 适用于X与脂肪链相连的卤代烷烃 例如：三氯叔丁醇的含量测定 CCl3-C(CH3)2
16、-OH + 4NaOH (CH3)2CO +3NaCl + HCOONa +2H2O NaCl + AgNO3 AgCl + NaNO3 AgNO3 + NH4SCN AgSCN + NH4NO3 2. 酸水解后测定法 例如：硬脂酸镁的含量测定 Mg(C17H35COO)2 + H2SO4 MgSO4 + 2C17H35COOH H2SO4 + 2NaOH Na2SO4 + 2H2O,三氯叔丁醇,（三）经还原分解后测定法 适用于Ar-I的药物 例如：泛影酸的含量测定,指示剂：曙红钠终点：黄红,三、经有机破坏的分析方法 金属原子、卤素等与C结合牢固者，必须有机破坏 常用的有机破坏的方法有,（一）
17、干法破坏 适用于含卤素、S、P等有机药物分析的前处理，也用于某些药物中硒及砷盐的检查。 1. 高温炽灼法 加无水Na2CO3、硝酸镁、氢氧化钙或ZnO以助灰化,2.氧瓶燃烧法,1） 仪器装置 500ml, 1000ml, 2000ml, 磨口、硬质 玻璃锥形瓶 2）称样 固体样；液体样要求 3） 燃烧分解操作法 4） 吸收液的选择 用于X、S、Se等的鉴别、检查、 含量测定时多数是H2O或H2O-NaOH；少数为 H2O-NaOH-H2O2,应用示例：碘苯酯的测定,思考与练习,A型题,1相对标准偏差表示的应是A准确度 B回收率 C精密度 D纯净度 E限度,2表示两变量指标A与C之间线性相关程度常用A相关规律 B比例常数 C相关常数 D相关系数 E精密度,14A空白试验 B对照试验 C回收试验 D鉴别试验 E检测试验1以同量的溶剂替代供试品同法进行测定试验2在供试液中加入已知量的标准物或已知量的被测物后，同法进行测定试验3用已知量的纯物质作为试样，同法进行测定试验4取少许水杨酸，加水溶解，加三氯化铁试液，显紫堇色,A,C,D,B,B型题,X型题,1药物分析方法的效能指标有 A检测限 B耐用性 C准确度 D专属性 E代表性2对药物中杂质进行检查时，要求所用的检查方法应具有 A耐用性 B专属性 C检测限 D准确度 E线性与范围,
