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1、目录,基本原理,1,影响转染实验的因素,转染方法,将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞的技术。,细胞转染,研究内容：研究和控制真核细胞基因功能应 用：基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生物学试验,常规转染技术,瞬时转染,外源 DNA 既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在。尽管线性 DNA 比超螺旋 DNA 转入量低但整合率高。外源 DNA 整合到染色体中概率很小，大约 1/104 转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素 B 磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定转染的同源
2、细胞系。,稳定转染,外源 DNA/RNA 不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。一般来说，超螺旋质粒 DNA 转染效率较高，在转染后 24-72 小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果， 常常用到一些报告系统如荧光蛋白， 半乳糖苷酶等来帮助检测。,脂质体介导转染,脂质体转染的原理基于电荷吸引原理，先形成脂质体-DNA复合物，散布在细胞周围，然后通过细胞的内吞作用，将目的基因导入细胞内。,1. promega公司Promega转染试剂产品适合于人HeLa，Hep G2，293，K562，Jurkat；猴CO
3、S-7，CV-1；小鼠NIH3T3；仓鼠BHK，CHO；大鼠PC12；昆虫S19等等细胞系的RNAi转染。2. Invitrogen公司Lipofetamine2000，适合于Hela，BHK，HEK，COS-7，PC12，NIH3T3等各种常用细胞系的RNAi转染。3. 转染FAQs：,转染试剂的选择,脂质体复合物与贴壁细胞的接触机会比悬浮细胞高出很多倍，所以，脂质体转染时悬浮细胞的转染效率要明显低于贴壁细胞。悬浮细胞是用的电穿孔法。,质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA，是进行DNA重组的常用载体。将细菌质粒转化到大肠杆菌中，然后从大肠杆菌中收获大量质粒的过程。,将质粒DNA导入细菌的过程
4、,1、质粒的转化,感受态细菌细胞在CaCl2低渗溶液中膨胀为球状（感受态细菌的制备，略）。质粒DNA与CaCl2形成抗DNase羟基-磷酸钙复合物黏附于细菌表面，经42短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物。在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。被转化的细菌中，外源基因得到表达。,BL21(DE3)一般用于外源基因的原核表达，DH5a，TG1和HB2151一般用于重组质粒的克隆和扩增,TG1长得慢，菌落较小，转化效率高，用于普通的克隆测序，BL21(DE3)长的快，菌落较大，转化效率低点，主要用于原核表达。,细菌铺板：加入抗生素（终浓度是50ug/ml-100ug/ml）挑选
5、菌落：从LB培养基上挑选菌落备用细菌培养：37摄氏度培养箱中以180rpm摇动1214h，使大肠杆菌繁殖碱裂解抽提：采用细胞裂解的方式，从含目标质粒的大肠杆菌菌液中将质粒提取出来,2、质粒的提取扩增,质粒的转化具体方法省略NOTE:不同的感受态细菌转化效率不同，选择合适的E.coli1ng的cccDNA就可使50ul的感受态细胞饱和，DNA量过多会降低转化效率。 转化时为提高转化效率，质粒加入E.coli培养1h后可离心弃上清后用剩余的菌液涂布。,在质粒提取过程中，由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能使质粒DNA链发生断裂。所以，多数 质粒粗提取物中含有三种构型的质粒：,共价闭合环状DNA（
6、超螺旋 ）： 质粒的两条链没有断裂；开环DNA： 质粒的一条链断裂；松弛的环状分子；线形DNA： 质粒的两条链均断裂；线性分子,Q1：原先测序鉴定没有问题的细菌，37摇菌后发现质粒大小或序列出现异常?,这种情况出现的几率较小，常出现在较大质粒或比较特殊的序列中。解决办法：降低培养温度，在2025下培养，或室温培养可明显减少发生概率。使用一些特殊菌株，如Sure菌株，它缺失了一些重组酶，如rec类等，使得质粒复制更加稳定。质粒抽提有一个酶切不完全的原因就是溶液中的NaOH浓度过高造成的,常见问题及解决方案,Q2：未提出质粒或质粒得率较低，如何解决?,大肠杆菌老化，细菌发生溶菌，可减少培养时间或者
7、试试平板培养， 质粒拷贝数低，质粒抽提过程很大程度上是受细菌生长情况决定的，刚活化的菌比负80保存菌种所培养出来的菌液状态好，保存久的菌株可能会造成质粒浓度低，质粒丢失等不明原因。 菌体中无质粒，质粒丢失。每次接种时应接种单菌落。另外，检查抗生素使用浓度是否正确。判断生长的菌液是否正常，可以用肉眼观察，在光线明亮处摇荡新鲜培养液，如果菌液呈漂絮状，情况很好。如果呈泥水状，即看不到絮状，则可能提不出好的质粒，或者没有质粒。碱裂解不充分，菌液不宜生长太浓，摇床速度不宜过高。吸附柱过载：,质粒未全部溶解(尤其质粒较大时) ：洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。乙醇残留：漂洗液洗涤后应离心尽量去
8、除残留液体，再加入洗脱缓冲液。洗脱液加入位置不正确：洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率。洗脱液不合适：DNA只在低盐溶液中才能被洗脱，如洗脱缓冲液或水。洗脱效率还取决于pH值，最大洗脱效率在pH7.0-8.5间。当用水洗脱时确保其pH值在此范围内，如果pH过低可能导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至60后使用，有利于提高洗脱效率。洗脱体积太小：随着洗脱体积的增大回收率增高，但产品浓度降低。洗脱时间过短：洗脱时间对回收率也会有一定影响。洗脱时放置1min可达到较好的效果。,转染方法,转染前细胞培养,推荐的DNA:Lipo2000=1:0.5
9、-1:5（ug：ul）siRNA:Lipo2000=1:0.01-1:0.1（pmol：ul）,转染前一天铺板：5.0-8.0104细胞接种在24孔板上，0.5ml正常培养基。24h后的细胞融合达到70%-90%的密度。转染：（1）50ul无血清培养基（Opti-MEM）+20pmol siRNA（或0.8ugDNA），柔和混匀，室温孵育5min（2） 50ul无血清培养基+1ul lipo2000（DNA+2ul lipo2000）柔和混匀，室温孵育5min。（3）将DNA加入Lipo2000中，轻柔混匀，室温孵育20min4.将24孔板中的正常培养基换为无血清的培养基（Opti-MEM）1
10、.9ml。5.将100ulsiRNA/Lipo2000（DNA/Lipo2000）复合物混匀逐滴加入孔中，轻轻摇匀。6.4-6h后，换培养基（全培），48-72小时监测转染水平。7. 转染效率： 绿色荧光蛋白看荧光 mRNA水平，48h后收样品，做PCR 蛋白水平，72h后收蛋白，做WB。,转染前一天铺板：5.0-8.0104细胞接种在24孔板上，0.5ml正常培养基。24h后的细胞融合达到70%-90%的密度。转染：（1）50ul无血清培养基（Opti-MEM）+20pmol siRNA（或0.8ugDNA），柔和混匀，室温孵育5min（2） 50ul无血清培养基+1ul lipo2000（
11、DNA+2ul lipo2000）柔和混匀，室温孵育5min。（3）将DNA加入Lipo2000中，轻柔混匀，室温孵育20min4.将24孔板中的正常培养基换为无血清的培养基（Opti-MEM）1.9ml。5.将100ulsiRNA/Lipo2000（DNA/Lipo2000）复合物混匀逐滴加入孔中，轻轻摇匀。6.4-6h后，换培养基（全培），48-72小时监测转染水平。7. 加相应的抗生素筛选，一般是转染48小时后加入抗生素。挑出单后就可以用维持浓度，一般是筛选浓度的1/2,1确定抗生素作用的最佳浓度： 不同的 细胞株 对各种抗生素有不同的敏感性,因此在筛选前要做预试验,确定抗生素对所选择细
12、胞的最低作用浓度.提前 24 小时在 96 孔板或 24 孔板中接种细胞 8 孔,接种量以第二天长成 25%单层为宜,置 CO2 孵箱中 37培养过夜.将培养液换成含抗生素的培养基, 抗生素浓度按梯度递增0,（50, 100, 200, 400, 600, 800 和1000 g/ml）.培养 10-14 天以绝大部分（90%） 细胞死亡 浓度为准, 筛选稳定表达克隆时可比该浓度适当提高一个级别,维持时使用筛选浓度的一半.2转染 48-72 小时后按 1: 10 的比例将转染细胞在 6 孔板中传代,换为含预试验中 确定的抗生素浓度的选择培养基.在6 孔板内可见单个细胞,继续培养可见单个 细胞分
13、裂 繁殖形成单个抗性集落.,转染细胞的稳定筛选,3. 挑选单克隆.滤纸片法：用消毒的 5x5mm 滤纸片浸过胰酶,将滤纸片贴在 单细胞 集落上 10-15 秒,取出粘附有细胞的滤纸片放于 24 孔板中继续加压培养. 细胞在 24 孔板中长满后转入 25cm2 培养瓶中,长满后再转入 75cm2 培养瓶中培养.有限稀释法：将细胞消化下来后做连续的 10 倍稀释（10-2-10-10）,将每一稀释度的细胞滴加到 96孔板中培养,7- 10天后,选择单个克隆生长的孔再一次进行克隆.4.ELISA或 Westernblot检测单克隆细胞中外源蛋白的表达情况由于不同克隆的 表达水平存在差异因此可同时挑选
14、多个克隆选择表达量最高的克隆传代并保种.,一、概述反转录病毒是RNA病毒，但有反转录酶，可使RNA转录为DNA，再整合到宿主细胞基因组。在逆转录酶的作用下首先将RNA转变为cDNA，再在DNA复制、转录、翻译等蛋白酶作用下扩增的一类病毒。它有三个基因：gag-编码病毒的核心蛋白；pol-编码逆转录酶；env-编码病毒的被膜糖蛋白。,二、逆转录病毒载体优点：(1) 转染范围广，可以感染各种细胞类型，如淋巴细胞或肝细胞、肌细胞等; (2) 转入的外源基因可完全整合(3) 对细胞感染率高，基因转移率在10%-100% (4) 感染细胞不产生病变，可建立细胞系长期持续表达外源基因,逆转录病毒通常分两种
15、：简单的（有时又称为致癌病毒或-逆转录病毒，如鼠白血病病毒）和复杂的（如慢病毒）。这些亚型间主要的差异在于复杂的逆转录病毒存在一些附属基因和调控基因，而简单的则没有。,当重组病毒载体导入包装细胞后，缺陷病毒载体和包装细胞的互补作用共同完成病毒装配,该病毒颗粒可感染其他宿主细胞，此时目的基因进入该细胞并整合到细胞基因组中，导致插入序列在宿主细胞中表达，产生目的蛋白。宿主细胞不能像包装细胞那样为缺失结构基因的逆转录病毒提供结构蛋白，因而在宿主细胞内不会产生新的感染性病毒颗粒,保证了该载体在生物制品领域的生物安全性问题。,三、 逆转录病毒载体的包装原理,逆转录病毒载体系统共由两部分组成：,缺陷病毒本
16、身,包装细胞系,提供病毒载体包装成病毒粒子所需的结构蛋白,去除了正常的蛋白编码序列而保留了复制和包装信号，通过分子克隆技术将目的基因插入此载体上,转染前一天，取对数生长的HEK293T细胞5104个/孔种于24孔板中，500lDMEM+10%FBS培养基/孔，设立空白组及p-BABE-EGFE-野生型及突变型质粒组，置于37、5%CO2培养箱中培养过夜，待细胞生长至80 90%融合时，准备转染。取0.5gp-BABE-EGFR野生型及突变型质粒+0.45gp-BABE-gag+0.05g p-BABE-VSV质粒分别稀释于50l无双抗无血清的DMEM培养基中，轻柔混匀，室温放置5分钟。 取2.
17、5L LipofectamineTM 2000稀释于50l无双抗无血清DMEM培养基中，轻柔混匀，室温下静置5 分钟。将转染试剂和质粒DNA 稀释液轻柔混合均匀，室温静置20分钟。用无血清无双抗的DMEM培养基洗细胞2-3次，并换上400l新鲜的无血清无双抗的DMEM培养基。 将质粒和LipofectamineTM2000混合物100l逐滴加入孔中，来回轻柔摇晃细胞培养板，使混合物均匀覆盖细胞。 46h后（可镜下观察细胞形态确定转染时间），去掉转染试剂，用DMEM完全培养基洗两遍，加入500l DMEM完全培养基，将细胞板置于37 、5% CO2 培养箱中培养。培养48h后，1000rpm，4
18、，离心5min，收集48h病毒上清，并换上500L新鲜的10%FBS DMEM培养基，继续培养24h，1000rpm，4，离心5min，收集72h病毒，收集的病毒可以直接用于感染，也可冻于-80用于后续感染实验。,逆转录病毒载体的包装,（1）种板：在感染前1218h，取对数生长的NIH 3T3 细胞，调整细胞浓度，以5104/孔种于24孔板中，置于37 、5% CO2 培养箱中培养。（2）第一次感染：取0.5ml 48h病毒上清+0.5ml 10%FBS DMEM培养基+4g/ml polybrene，加入NIH 3T3细胞中，置于37 、5% CO2 培养箱中感染16h。 （3）第二次感染：
19、去除上述培养基，并向NIH 3T3 细胞中加入0.5ml 72h病毒上清+0.5ml 10%DMEM培养基+4g/ml polybrene ，置于37 、5% CO2 培养箱进行第二次感染，感染24h后，加入嘌呤霉素进行筛选。,2、逆转录病毒感染NIH 3T3细胞,第二次感染后，加入8g/ml嘌呤霉素进行筛选，每3天换一液，待长出阳性克隆，抗生素减半维持，继续筛选14天，挑取单克隆，扩大培养，冻存细胞。,3、筛选稳定表达p-BABE-EGFR野生型及突变型质粒的NIH 3T3细胞株,逆转录病毒可能会整合到人的细胞中。所以进行病毒操作时必须在生物安全柜中进行，带口罩，废液密闭回收用84灭活，枪头
20、、离心管等也要灭活。,血清,血清会影响复合物的形成，降低转染效率,阳离子脂质体和DNA的最佳量在使用血清时会有所不同，因此如果你想在转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。大部分细胞可以在无血清培养基中几个小时内保持健康。对于对血清缺乏比较敏感的细胞，可以使用OPTI-MEM培养基，一种营养丰富的无血清培养基，或者在转染培养基中使用血清。对于对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞，建议使用LIPOFECTAMINE 2000。,影响转染实验的因素,培养基中的抗生素,抗生素，比如青霉素和链霉素，是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入
21、细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率低。,细胞维护和培养的演变,一般低的细胞代数（50）能确保基因型不变。转染前细胞最好经过1-2次传代，以保证细胞生长旺盛，容易转染。注意，贴壁细胞生长到几乎汇片时就要赶快进行下一次传代，千万不要使细胞保持融合超过24小时，因为一旦长满了，细胞们就“故步自封”不思转染啦。活力充沛的年轻细胞更容易接受外来的新鲜事物。,细胞铺板密度,一般转染时，贴壁细胞密度为70%-90%，悬浮细胞密度为2106-4106细胞/ml时效果较好。确保转染时细胞没有长满或处于静止期。铺板细胞数目的增加可以增加转染活性和细胞产量。,DNA 质量,DNA 质量对转染效率影响非常大。 一
22、般的转染技术 （如脂质体等） 基于电荷吸引原理，如果 DNA 不纯， 如带少量的盐离子， 蛋白， 代谢物污染都会显著影响转染复合物的有效形成及转染的进行。,Q1：转染效率低,（1）没有使用优化的阳离子脂质体试剂。,选择针对您的细胞类型转染效率可能最高的阳离子脂质体试剂。,（2）没有使用优化条件。,优化阳离子脂质体试剂和DNA的量。,（3）DNA-阳离子脂质体试剂复合物在存在血清条件下形成。,在复合体形成时不要使用血清。,（4）存在抑制剂。,不要使用抗生素，EDTA，柠檬酸盐，磷酸盐，硫酸软骨素，透明质酸，硫酸葡聚糖或其他硫酸蛋白多糖。,（5）不恰当的细胞密度。,细胞密度在转染时融合度为70%9
23、0%。,（7）阳离子脂质体试剂冻结。,不要使用冻结的或储存温度低于4的阳离子脂质体试剂。,（8）转染分析的问题。,转染分析中加入阳性对照。,（9）质粒纯化的问题。,请核对是否使用转染级的质粒纯化试剂盒。通常转染级的质粒纯化试剂盒使用DEAE树脂而非硅树脂，并且最好是用重力流动（过滤）的方法而不是离心技术，因为树脂带来的污染会导致较高的内毒素。另一种方法（可用于任何级别的纯化试剂盒），是在最后一步从树脂柱上洗脱质粒后，将溶液置于55的水浴上保温5分钟。最后小心地从上至下吸取2/3的溶液（不要碰到底部）使用。这是减少树脂的交叉污染的方法。,Q2：细胞死亡率高。,（1）DNA量太高。,作一个剂量-反
24、应曲线以确定最佳的DNA量。,（2）阳离子脂质体试剂量太高。,作一个剂量-反应曲线以确定最佳的阳离子脂质体试剂的量。,（3）在转染过程中使用抗菌素。,在转染过程中不要使用氯霉素，青霉素或链霉素，因为阳离子脂质体试剂使细胞更敏感。,（4）细胞太少。,调整细胞数量。,（5）无血清条件细胞活性降低。,使用OPTI-MEM培养基。降低或省去在无血清培养基中清洗的次数。,（6）阳离子脂质体试剂氧化了。,不要过分搅动或振荡阳离子脂质体试剂；这可能会形成阳离子脂质体试剂的过氧化物。,（7）对于稳定转染，筛选抗生素加入的太快。,在加入筛选性抗生素前至少预留48小时使细胞表达抗性基因。,Q3：阳离子脂质体试剂-DNA复合物沉淀。,在显微静下可以在细胞上观察到小的颗粒状颗粒沉淀。这是正常的。此沉淀是否存在并不表明转染效率的高低。,（1）存在过剩的EDTA。,（2）DNA或阳离子脂质体试剂浓度过高。,确保阳离子脂质体试剂和DNA的浓度不要超过复合物形成的建议量,使用DNA水溶液，如果是在TE中，使用浓度0.3mM的EDTA溶液稀释DNA。,Q4： 转染重复性不好。,（1） 转染时的融合度波动。,在不同的转染时报持所有的转染参数恒定，如融合度，传代次数和生长时相等。,（2）在培养中细胞发生变化,如果可能，使用来源于经选择转染效率较高亚系的细胞。如果可能，融化新鲜细胞。,
