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1、第四章微生物反应器操作,主要内容 1、微生物反应器操作基础 2、分批操作 3、流加操作 4、连续操作,4.1 微生物反应器操作基础,微生物培养过程根据是否要求供氧，分为厌氧和好氧培养 。,好氧培养可采用以下几种方法：（1）液体表面培养（如使用浅盘）；（2）通风固态发酵；（3）通氧深层培养。,深层培养,培养方式分类：分批式操作（batch operation）反复分批式操作（repeated batch operation）流加式操作（fed-batch operation）反复流加式操作（repeated fed-batch operation）连续式操作（continuous operati
2、on),4.2 各种反应器操作类型,是指基质一次性加入反应器内，在适宜条件下将微生物菌种接入，反应完成后将全部反应物料取出的操作方式。,分批式操作,反复分批式操作是指分批操作完成后，不全部取出反应物料，剩余部分重新加入一定量的基质，再按照分批式操作方式，反复进行。其培养过程中基质体积变化曲线如图4-1c所示 。,反复分批式操作,流加式操作 是指先将一定量基质加入反应器内，在适宜条件下将微生物菌种接入反应器中，反应开始，反应过程中将特定的限制性基质按照一定要求加入到反应器内，以控制限制性基质保持一定，当反应终止时取出反应物料的操作方式 。酵母、淀粉酶、某些氨基酸和抗生素等采用这种方式进行生产。,
3、反复流加式操作,反复流加式操作是指流加操作完成后，不全部取出反应物料，剩余部分重新加入一定量的基质，再按照流加操作方式进行，反复进行。其培养过程中基质体积变化曲线如图4-1d所示。,连续式操作是指在分批式操作进行到一定阶段，一方面将基质连续不断地加入反应器内，另一方面又把反应物料连续不断的取出，使反应条件（如反应液体积等）不随时间变化的操作方式。活性污泥法处理废水、固定化微生物反应等多采用连续式操作。连续培养过程中基质体积变化曲线如图4-1e 所示。,连续式操作,培养过程中基质体积变化,反应器操作特点,4.2.1 生长曲线,分批培养中微生物的生长曲线如图4-2。随培养的进行，基质浓度下降，菌体
4、量增加，产物量相应增加。分批式培养过程中，微生物的生长可分为：1、迟缓期（lag phase)；2、对数生长期（lagarithmic growth phase）；3、减速期（fransient phase）；4、静止期（stationary phase）； 5、衰退期（decline phase）5个阶段。,分批式培养中微生物的生长曲线,4.2.2 状态方程式,分批式培养过程的状态方程式（环境过程的状态方程式）可表示为：基质：dS/dt=-X菌体：dX/dt=X产物：dP/dt=X氧：CO2：,当t=0时,上式中， F为惰性气体流速， V为反应液总容积， Pall为气体总压力， (Po2)o
5、ut为排气中氧的分压， (Po2)in为进气体中氧的分压， (Pco2)in为进气体中C02的分压， (Pco2)out为排气中CO2的分压。,一般微生物的最适温度、最适pH的范围较窄。例如，Calam等人研究了温度对产黄青霉（Penicillum chrysogenum）生长速率和青霉素生成速率的影响，发现最适生长温度为30，进行呼吸的最适温度为21.728.6，产物青霉素的最适生成温度为24.7。生产中一般采用定值控制。在这样的条件下，可以认为分批培养过程中的动态特性取决于基质与微生物浓度（接种量）及微生物反应的诸比速率的初始值，因此，支配分批式培养统的主要因素是基质与微生物的浓度的初始值
6、。,分批式微生物反应过程分析中，需观察X，S和P等随时间的变化情况。由于不可能研究所有反应液成分随时间的变化，因此应选择与产物P关系最为密切的底物S作为观察的对象。必要时，可观察两种基质浓度的变化。好氧反应中，溶解氧浓度（DO）随时间的变化也是很重要的参数。,分批培养时微生物细胞的生长与产物形成的动力学,培养基中的营养物质被微生物细胞所利用,生成细胞：细胞得率系数,生成代谢产物：产物得率系数,消耗一克营养物质生成的细胞的克数或生成的产物的克数,工业上，一段时间的平均值，获得为表观得率系数,4.2.3 反复分批操作 反复分批操作系统（图4-3）中培养液体积为V，培养液取出率为，滤液取出率为，由于
7、V一定，所以培养液加入量为(+ )V=F)。为确保菌体初始浓度一定，有必要将流出液中部分含菌体的培养液取出，此时菌体量的衡算式为：,反复分批操作示意图,控制产物 浓度,控制菌体浓度,反复分批培养时的计算目标,一次分批结束后，进行下一批分批发酵，设定重新开始分批发酵时的初始菌体浓度为Xi，初始产物浓度为Pi,，为此需计算： 要取出多少培养液？取出多少滤液？补充多少新鲜培养基？新鲜培养基的底物浓度是多少(配制培养基的要求)？,由上式可知 产物浓度的衡算为由上式，滤液取出率为,产物的生产能力 由上式可知，为提高产物生产能力，可采取提高或减少tRB。,RB: repeated batch,P82 例题
8、5-3,以葡萄糖为限制性基质，进行酿酒酵母的反复分批培养。培养液V=1000L，细胞初始浓度Xi=3.0g/L，初始产物浓度Pi=1.3g/L,最终细胞浓度与产物浓度分别为Xf=15g/L，Pi=26g/L。试计算初始基质浓度Si;新鲜培养基供给量F及流加基质浓度S0；培养液与滤液分离取出率各为多少？已知Yp/s=0.35;Yx/s=0.1。=1-Xi/Xf=1-3.0/15=0.8=（1-）-Pi/Pf=0.8-1.3/26=0.15若培养终止时基质浓度Sf=0,求初始基质浓度SiVSi=(Pf-Pi)V/YP/S+(Xf-Xi)V/YX/S即：基质需要量=产物量生成所需基质消耗量+细胞增加
9、量所需基质消耗量所以Si=(26-1.3)/0.35+(15-3)/0.1=191(g/L),再次分批培养基开始，新培养基加入量为F=（+）V=（0.8+0.15）1000=950（L）基质流加浓度S0为S0=Si/(+)=191/(0.8+0.15)=201(g/L),4.3 流加操作,流加操作的优点是能够任意控制反应液中基质浓度。 流加操作的要点是控制基质浓度，因此，其核心问题是流加什么和怎么流加。在工程上特别要注意后者。 从流加方式看，流加操作可分为无反馈控制流加操作与反馈控制流加操作。前者包括定流量流加、指数流加和反馈控制流加操作等。后者分间接控制、直接控制、定值控制和程序控制等流加操
10、作。,杯式补料系统,生产车间计算机控制室,流加培养操作,应用举例,消除快速利用碳源后，造成的阻遏效应，维持罐内良好的需氧发酵条件。避免培养基中某些成分的毒害作用。,生产酵母培养基中含有麦芽汁过多，开始导致细胞的过速增长，同时细胞对氧气的需求大于设备提供的能力，是培养系统成为厌氧条件，是酵母产生乙醇，导致抑制细胞的生长，成为阻遏效应。同理，面包酵母如果添加葡萄糖超过某一值时，也会产生此效应。,青霉菌发酵生产青霉素，要求精确的控制葡萄糖的补入速率。生长期是葡萄糖的含量适宜。而在生产期控制补料速率，使青霉素的合成速率达到高值。另一方面，产物前提物的添加，有利于产量的提高，担当此物质对细胞的生长有毒害
11、作用使，应采用缓慢的加料方式，如苯乙酸钠。,补料分批发酵的特点有： 1）可以减弱底物和代谢产物的抑制。微生物的生长会受到高浓度底物和逐步过量产生的代谢产物的抑制，若将初始底物浓度降低，就会限制菌体密度和产物浓度的提高。但采用间歇补料通过不断的流加限制性底物就可克服该缺点。可以避免葡萄糖效应对微生物生长和产物积累的影响。流加补料还可稀释降低代谢产物的浓度，减轻其抑制生长作用。 2）增加次级代谢产物的产量。次级代谢产物的合成常常在生长平衡期才开始合成，与稳定期的细胞密度和延续时间密切相关。但间歇发酵的平衡期比较短，因营养物质已大量消耗可同化量很少很快就进入衰亡期。通过补料可延长平衡期增加次级代谢产
12、物的产量。,3） 可以提高发酵的细胞密度。补料发酵时不断地向发酵罐补偿限制性底物，微生物始终能获得充分的营养，菌体密度就可以增加，合理改进发酵工艺细胞密度可以达到10以上干细胞，大大提高产率。 4）可以恒定培养条件。发酵过程中的培养环境会随着代谢作用的进行而变化，如培养基的pH值，这时可流加氨水或通氨来恒定pH值还补充氮源。,流加操作时，特定基质加入到反应器后，反应液体积就会发生变化，这时、和的可定义如下： 式中，V为反应液体积，F是体积流量，Sin是流加液中的基质浓度，FSin为基质的质量流量。,4.3.1 无反馈控制的流加操作 采用这种操作方式时，基质的流加按预先设置好的条件进行。因此，表
13、达系统的数学模型是否正确成为反应成败的关键。最简单的微生物的生长速率为,作为流加基质的平衡式，有,反应液体积变化的方程式为,式中，Kvap为单位时间里由于通气，随排出气体而失去的水分。如果流加的基质能够迅速并完全为菌体所消耗，并且维持代谢为零时，可得到最大的菌体浓度Xmax。由于基质流加量与基质消耗量相等，可认为，这样由流加基质的平衡式有,对于所供给基质的浓度，菌体浓度近似一定，即dX/dt=0时。由上式，可认为（D稀释率）。,一、定流量流加操作 定流量流加操作是指基质的流加速度保持一定的流加操作。此时dV/dt=F为定值。由菌体的恒算式,可知，时间t时的菌体浓度为,这种流加方式的最大特点是微
14、生物进行线型生长（linear growth），即 式中KL是线性生长速率常数。一般，在线性生长阶段，基质浓度相当低。,二、指数流加操作 通过采用随时间呈指数性变化的方式流加基质，维持微生物菌体的对数生长的操作方法称为指数流加操作。此时，以满足等于定值为基础，流加基质，由Monod方程可获得S=常数。此时，由于dX/dt=0，结合前述的拟稳定状态条件，有如下方程式,基于上式，菌体量为,流量为,从以上结果可知，采用这种方式操作，不仅能保证微生物呈指数生长，而且能保持基质浓度一定。流加基质浓度Sin与反应器内反应液最终体积、最终菌体量Xf和菌体收率YX/S有如下关系：,拟稳定状态下初始流加速度F0
15、可由（4-24）给出。,微生物每次培养都可能有微妙的变化，因此，无反馈控制的流加操作适用范围很窄。,例题5-4,流加基质为葡萄糖，培养大肠杆菌。流加培养开始时的V0=1.0L，Sin=80g/L，F=0.2L/h，反应方程式可以用Monod方程来表示，其中=0.2 h-1，Ks=1.0g/L,Yx/s=0.6g/g(以细胞/葡萄糖计)。流加培养2h后，求：(1)此时的培养液体积V;(2)拟稳定状态下反应器中的葡萄糖浓度；(3)培养完成时反应器中的细胞浓度。,例题5-5,青霉菌流加培养中，为确保比生长速率=0.2h-1, 按照指数方式流加葡萄糖。Sin=0.3kg/m3。细胞的生长可以用Mono
16、d方程表达， =0.30h-1，Ks=0.1kg/m3。流加开始时培养液体积V0=0.005m3,细胞浓度为X0=0.1kg/m3，细胞得率Yx/s=0.3kg/kg(以细胞/葡萄糖计)。求流加培养至20h时反应器内的基质浓度和培养液体积，流加开始与20h时的流加速度。,4.3.2 有反馈控制的流加操作,阴沟肠杆菌定流量流加培养,甘油为基质进行阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）定流量流加培养的实验结果与计算机模拟结果如前图。图中（a）是甘油水溶液为流加基质的结果，如图4-4所示的那样，菌体浓度一定（XV以直线方式增加）。图中（b）甘油直接为流加基质，与甘油水溶液的不同，流加
17、的基质全部被消耗，反应液的体积V一定，菌体浓度X按照直线方式增加。此时，确保了高浓度培养的成功。,4.4连续式操作,连续操作有两大类型，即CSTR（continuous stirred tank reactor）型和CPFR(continuous plug flow tulular reactor）型。 根据达成稳定状态的方法不同，CSTR型连续操作，大致可分为三种。一是恒化器法（chemostat），二是恒浊器法（turbidstat），第三是营养物恒定法（nutristat）。,恒化器法是指在连续培养过程中，基质流加速度恒定，以调节微生物细胞的生长速率与恒定流量相适应的方法。 恒浊器法是指
18、预先规定细胞浓度，通过基质流量控制，以适应细胞的既定浓度的方法。营养物恒定法是指通过流加一定成分，使培养基中的营养成分恒定的方法。实际应用中多采用恒化器法 。,单级CSTR培养系统,4.4.1 恒化器法连续操作,连续发酵的优点：1、高效2、产品质量较稳定3、节约了大量动力、人力、水和蒸汽，且使水、气、电的负荷均衡合理。缺点：1、菌种易退化2、易污染杂菌3、营养物的利用率一般低于单批增大。,1、单级连续培养操作 上图所示的单级CSTR培养系统中，流入液中仅一种成分为微生物生长的限制性因子，其他成分在不发生抑制的条件下充分存在。反应过程中，菌体、限制性基质及产物的物料衡算式为 变化量=流入量+生成
19、量-流出量 由于流入液中菌体与产物的浓度为零，因此，上述衡算式写成数学表达式为,式中， F为反应液流入与流出速度L/h， V为反应器内反应液的体积L， Sin为流入液中限制性底物的浓度mol/L， S为反应器内和流出液中限制性底物浓度mol/L， 其余符号同前。,以上式子两边同除以V，则,式中，D称为稀释率(dilution rate）,根据菌体得率和的定义式，以及Monod方程， 可改写成,稳定状态下，dX/dt=dS/dt=dP/dt=0，此时的菌体浓度、基质浓度和代谢产物浓度可分别表示为,事实上D是有一定限制的，就是要保证，即,微生物反应一般是在 条件下进行的，所以由上式，可以认为 当D
20、值接近 时， ，实际上X为零，此时 转变为 此时称为冲出（wash out）点， 称为冲出基质浓度。也就是微生物的生长速度低于反应液流加速度时，反应液中微生物将全部被排出。当然，这已无连续操作的意义，但这一过程可用来确定此条件时微生物的 。,另外，给出稳定状态下菌体生长速率和产物生成速率，即,所以获得最高产物产率时的稀释率为,此时，最高代谢产物浓度为,从上述推导中，连续培养的稳定条件为,假设细胞生长符合monod方程，于是：,所以，连续培养只要控制D，即改变培养基的供给量F，就可以控制在任意可调水平，而是微生物的特性参数，在分批培养过程中，是一个无法控制的参数，而在连续培养过程中，通过控制操作
21、状态参数D来调控，因而称此类反应器为外控式的微生物反应器,最高产率时的菌体浓度为,面包酵母的连续培养中，最大产率的 确定是一个优化问题。事实上，最大生产能力是在接近最大稀释率时达到的，其可能与基质的利用率存在矛盾。经验表明， 时，基质利用率仍可能大于95%。,连续培养为目的微生物选择了有利的生长环境，提高了竞争的优势，有利于减少杂菌污染的机会。另外，连续培养过程中的菌种变异问题也是不可轻视的。DNA的复制是一种复杂而精确的过程，虽然出现差错的概率仅1/106，但因每ml反应液中往往有109个细胞，所以变异问题显得很重要。当然，在这一数量中，多数突变是不重要的。有人研究了工程菌株连续培养的理论问
22、题，多数情况下，只要保持一定的选择压力，工程菌株一样可以稳定。,3、多级连续培养多级连续培养系统是一具有n个串联反应器的连续反应系统。底物流经这一系统的流量为F，由物料衡算可得出菌体X、产物P及限制性基质S的衡算式。这些方程式成立的基本条件是，限制性基质由n-1号反应器流入n号反应器中立即与n号反应器内的反应物料充分混合均匀。其有关衡算式为,稳定状态下，以上三式左边为零。因此，有,从以上式子可以分析得出，从第二级开始，菌体的比生长速率不再与稀释率相等。另外，有关具有反馈的多级连续培养操作方程可采用前面所述方法推导出来。,2、具有反馈的单级连续培养 有时为了增加反应器内的菌体浓度，或者在某种条件
23、下提高发酵产物的产率，对于单级连续培养可以采取将反应器排出液中的部分微生物重新返回反应器中。图4-9表示具有反馈的单级连续培养系统，图中g为微生物的浓缩系数（1），r为再循反应液的比例（返回的反应液与供给的新鲜反应液的体积比）。稳定状态时，菌体的物料衡算式为,整理得,由此求得稀释率为,在这种情况下，D为“外部”稀释率，对于反应器本身，还要用一个“内部”稀释率D的概念，它等于D加上rD，,反馈过程中，必须满足g1,r0这样,因此函数值,大于，即,由于的绝对值必须小于1，因此，r和g在一定范围内是互相依存的，不能任意选定。 具有反馈的单级或多级连续培养中，稳态下的稀释率都高于比生长速率。这与常规单
24、级连续培养（保持）不同。前者流入反应器的培养液体积要相对多一些。这一方法在生物法废水处理过程之一的活性污泥法中普遍采用，因为其有利于提高除污能力。,理论上，反馈操作使菌体产率增大，但实际运用并不尽然。反应液中菌体的浓度取决于收率和底物消耗的数量，即 因此，无其它限制因子时，微生物菌体浓度在一定范围内受底物浓度的制约。如果采用控制底物浓度的方法来控制菌体浓度，可使无反馈反应系统中的菌体浓度达到反馈条件时的菌体浓度的同样数值，此时，反馈对于提高菌体产率并不显示优越性。相反，由于分离后反应液中菌体浓度降低，对菌体生产（如面包酵母生产）反而不利。,对于具有反馈的单级系统来讲，还要考虑排出反应液中菌体的
25、浓度。菌体分离装置处的菌体恒算式为,所以， 即菌体产率等于比生长速率与的乘积。由于具有反馈时的大于无反馈时的，因此，反馈使反应器的产率增加了倍。,所以，从菌体分离装置处流出的菌体浓度为,固定化细胞连续培养细胞固定化就是通过包埋法、微胶囊化、吸附法等手段，将微生物细胞限制在载体的内部或表面。固定化细胞培养与游离细胞培养相比，有以下一些优势：固定化可提供较高的细胞密度；固定化减少了细胞的流失，使细胞可以反复利用；固定化可以提供对细胞有利的微环境；可以保护某些细胞免受剪切损伤； 简化了下游的细胞分离步骤。,固定化载体常常易碎，且固定的细胞容易脱落等原因的存在，固定化细胞培养器中的剪切力也不宜过高，一
26、般采用填充柱、流动床或气升式反应器。机械搅拌式反应器只适用于载体牢固、不易脱落的固定化细胞。通常是将固定化细胞装在反应器内，一端流入培养基，另一端放出发酵液，而固定化微生物细胞始终停留在反应器内。,其他培养方法1、双菌或者多菌培养 现代发酵工业以纯种发酵为主，而传统的固态白酒和酱油的发酵都是多菌培养发酵的结果。在自然界微生物之间的共生与互生关系也是双菌与多菌共同生存的常例，这种关系反映了微生物存在着代谢”接力棒”的依赖状态，能相互改善生存条件。,双菌发酵：维生素C的二步法采用欧文氏菌和棒状杆菌进行串联发酵，先将厂葡萄糖转化成2，5-二酮基葡萄糖酸再进一步转化产牛2-酮某古龙酸。以山梨醇作为发酵
27、的主要原料，利用生黑葡萄糖酸杆菌或弱氧醋酸杆菌先进行第 一步发酵，所生成的 山梨糖80加热几分钟后再加入灭菌的辅料（玉米浆，尿素及无机盐等），开始第二步的混合菌株发酵。当作为伴生菌的芽孢杆菌开始形成芽孢时，产酸菌株开始产酸。,淀粉-酒精的双菌发酵用固定化的混合菌种将淀粉原料转化成乙醇。用海藻酸钠包埋黑曲霉和运动发酵单胞菌，形成固定化细胞小球。黑曲霉好氧，故长在小球表层，运动发酵单胞菌厌氧，生长在小球中间。当淀粉液流过固定化细胞反应器时，表层的黑曲霉将淀粉分解成葡萄糖并进入小球内层，运动发酵单胞菌随即将葡萄糖转化成乙醇。,许多发酵是纯菌株无法实现的只有混合菌株才能完成所以采用混菌培养有可能获得新
28、型的或优质的发酵产品，有时比单菌培养更快、更有效更简便当然混菌培养的反应机制较复杂。,2 生物反应与分离耦合技术 间歇微生物反应中菌体生长转移到静止期的一个原因是有毒物质的积累。这种有毒物质往往是代谢产物（目的代谢产物或非目的代谢产物）。因此，为了能保持菌体有较高生长速率和得到较大的菌体或某一产物的产率，有必要在微生物反应的同时，不断地把这些有毒物质分离出去。这就是同时进行分离和反应的间隙操作，又称耦合操作。近年来这方面的研究工作十分活跃，出现了许多具有分离功能的新型生物反应器和生物反应操作工艺。,以补料分批培养进行面包酵母的单细胞蛋白生产。已知细胞生长符合Monod方程， =0.4 h-1 , Ks=0.15g/L,Yx/s=0.58g/g.葡萄糖溶液按指数流加方式进行，开始流加葡萄糖时培养液的细胞浓度为1g/L，过程完成时培养液中葡萄糖浓度为0.25g/L，加料中葡萄,
