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1、,第九章,酶活力及其动力学常数的测定,酶是具有催化活性的蛋白质 酶学研究是现代分子生物学不可缺少的内容。,酶学研究的意义表现在,研究酶结构和功能的关系， 分析酶的改变和疾病的关系 研究酶在发育及分化中的作用， 酶标已成为现代分子生物学研究常用的工具 由于酶是其基因表达的产物 对酶工业的指导作用,第一节 基本概念,一、酶活力指酶的催化活性。一般用国际单位表示。第五届国际生化会议推荐：在一定条件(温度和pH)下，1分钟转化lmol底物所需的酶量为一个酶单位(1U),二、酶的比活力指每毫克蛋白中含有的酶活力单位数，用IU(U)/mg表示。酶的比活力是酶浓度和酶质量的衡量标准 三、酶的转换常数 分子活
2、性：每摩尔酶分子、每分钟转换底物的摩尔数催化中心活性：每摩尔活性亚基或催化中心每分钟转换底物的摩尔数,四、KmKm是酶活性部位的一半被底物占据或酶反应达到最大反应速度一半时所需要的底物浓度，是一定温度下酶的特征常数，又称米氏常数。同一酶的不同底物有不同的Km。 1/Km表示酶底亲和常数， 1/Km愈大，则亲和力愈大,五、V及Vm V是反应速度。指单位时间内 (如1分钟) 每毫克酶蛋白转换底物的mol数Vm表示在一定酶浓度和反应条件下的最大反应速度，是底物浓度足够大时，酶反应速度趋向的极限值,影响因素包括有酶浓度、底物浓度、pH、温度、抑制剂、激活剂等。, 研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定
3、。,第二节 酶活力的测定方法,一、底物浓度对反应速度的影响,单底物、单产物反应酶促反应速度一般在规定的反应条件下，用单位时间内底物的消耗量和产物的生成量来表示反应速度取其初速度，即底物的消耗量很小（一般在5以内）时的反应速度底物浓度远远大于酶浓度,研究前提,在其他因素不变的情况下，底物浓度对反应速度的影响呈矩形双曲线关系。,当底物浓度较低时,反应速度与底物浓度成正比；反应为一级反应。,目 录,随着底物浓度的增高,反应速度不再成正比例加速；反应为混合级反应。,目 录,当底物浓度高达一定程度,反应速度不再增加，达最大速度；反应为零级反应,目 录,（一）米曼氏方程式,中间产物,酶促反应模式中间产物学
4、说,1913年Michaelis和Menten提出反应速度与底物浓度关系的数学方程式，即米曼氏方程式，简称米氏方程式(Michaelis equation)。,S：底物浓度V：不同S时的反应速度Vmax：最大反应速度(maximum velocity) m：米氏常数(Michaelis constant),（二）Km与Vmax的意义,Km值 Km等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。 意义：a) Km是酶的特征性常数之一；b) Km可近似表示酶对底物的亲和力；c) 同一酶对于不同底物有不同的Km值。,Vmax定义：Vm是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度成正比。,（三）m值与ma
5、x值的测定,1. 双倒数作图法(double reciprocal plot)，又称为 林-贝氏(Lineweaver- Burk)作图法,二、酶浓度对反应速度的影响,当SE，酶可被底物饱和的情况下，反应速度与酶浓度成正比。关系式为：V = K3 E,双重影响温度升高，酶促反应速度升高；由于酶的本质是蛋白质，温度升高，可引起酶的变性，从而反应速度降低 。,三、温度对反应速度的影响,最适温度 (optimum temperature)：酶促反应速度最快时的环境温度。,* 低温的应用,四、 pH对反应速度的影响,最适pH (optimum pH)：酶催化活性最大时的环境pH。,二、酶活力的测定方法
6、,(一)总则 有可被检测且能反映酶反应进行程度的信号物底物对酶远远过量(通常底物浓度为Km的3l0倍)适宜的反应温度最适pH反应体系被测的酶量适当,(二)酶的测活方法 1静态法： 在一定条件下将酶和底物作用一定时间后终止反应，然后直接或间接地检测底物的减少(或产物的增加)量，从而计算出酶的活力,此法测活的关键步骤是反应多长时间后终止反应 为解决这一问题，首先应在较高酶浓度下启动反应(曲线3)，于不同的反应时间终止反应，然后作出产物浓度一时间曲线找出产物随时间线性增加的最长时间t。在正式测活中，选用低于此酶量的样品，反应到t。(或小于t。)时终止反应即可得到正确的酶活性,2半动态法于不同时间分别
7、从反应体系中取出一定量的样品，迅速置于反应终止液中，然后通过检测并计算反应后不同时间样品中的底物减少量 (或产物增加量)，从而计算出反应速度。,本实验中的时间点间隔根据实验确定。一般是酶活性高，时间间隔短；酶活性低，间隔可适当延长。选用的时间点一般以35点为宜,3动态法 该法连续监测酶反应进行的程度，同时记录不同时间点产物生成(或底物减少)量，然后计算出单位时间内产物的增加(或底物的减少)量即酶活力，再计算出其比活力。,4. 偶联酶法 许多反应的底物或产物不能直接被检测 两种方法解决：在反应终止后，加入一种新的物质，其可以和产物(或底物)反应，生成可被检测的物质(如有颜色的物质、荧光物质等)而
8、间接测出产物(底物)的改变量可将第一步酶反应的产物作为第二步酶反应的底物，通过第二步酶反应生成可检测的产物，通过检测第二步反应产物的变化计算出第一步底物(或产物)的改变量，从而计算出催化第一步反应的酶活力此法即为偶联法。,第三节 同工酶的测活,总的原则是：抑制或除去其余同工酶，保留被测酶，然后再测出目的同工酶的活性 一、热失活法二、特异性抑制剂法 加入特异性的抑制剂或变性剂，可抑制特定的同工酶,三、选择性底物法 不同的同工酶对某些底物的选择可能具有特异性 四、柱层析法 将同工酶一一分离测其活力 五、电泳法六、免疫法 抗体可以和特定的同工酶结合而抑制或沉淀该同工酶,第四节 Km及Vm的测定,测定酶的Km及Vm是酶动力学研究的重要内容 一、Lineweaver-Burk作图法的原理 米氏方程,将方程两边取倒数,如果固定酶和其中一个底物的量，在另一底物不同浓度下测活，得到酶反应速度，用双倒数作图，则很容易求出酶对该底物的Vm及Km。 选择使用底物时 1应选择V-S曲线中的线性部分对应的底物浓度。 2由于是双倒数作图，故选择S时，最好选用1S呈常数递增的数值， 3理论上分析，SKm时，测定Km及Vm最准确，,
