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1、第十一章 别构酶及其动力学,别构效应（allosteric effect）：寡聚酶（蛋白）上一个活性部位的改变通过构象变化影响到其它活性部位的效应别构酶（allosteric enzyme)：能产生别构效应的酶。除了有一个活性中心外，还有别构效应剂结合位别构效应剂（allosteric effector)：作用于酶活性中心外的某处，通过促使酶分子空间构象的改变而影响酶的催化。酶的别构效应可由底物结合引起，也可由别构效应剂结合引起的。,一 别构酶及其作用特性,(一)概述：别构效应是机体代谢的重要方式代谢调节的方式：迟缓调节:需时间长，几个小时。通过改变酶 分子的合成、降解、酶原转化来控 制细胞内
2、酶分子浓度。快速调节:时间短几秒或几分钟。对体内现有 的酶进行激活或抑制。调节酶:在体内代谢过程中起快速调节作用的酶 包括共价调节酶和别构酶,(二)别构酶作用特性-协同效应(cooperative effect)协同效应：一个配体与蛋白或酶结合后对另一配体结合的影响 1.分类：同种效应：一个分子的配体与蛋白或酶结合对后续同种 或同类配体结合的影响。异种效应：一个分子的配体与蛋白或酶结合对不同种或 不同类配体结合的影响。正协同效应：一分子的配体与蛋白或酶结合可促进下一分 子配体与蛋白和酶结合的效应。负协同效应：一分子的配体与蛋白或酶结合使其它配体的 结合力降低的效应。,例如:四亚基蛋白（酶）P+
3、L K1 PL1 K2 PL2 K3 PL3 K4 PL4 内在解离常数:K1=K2=K3=K4 无协同 K1 K2 K3 K4 正协同 K1 K2 K3 K4 负协同右图中:a 为无协同(双曲线)b 正协同效应(S形曲线)c 负协同效应(表观双曲线),a,b,c,2.协同效应实例:(1)正协同实例 ATCase（66）Asp+氨甲酰磷酸 氨甲酰-L-Asp+Pi(过量)ATP产生异种正协同效应：别构激活 CTP产生异种负协同效应：别构抑制,CTP,尿素和有机汞处理可选择性破坏酶的效应剂结合位脱敏作用：酶失去了原有的对效应剂的敏感性脱敏后的酶仍然保持催化底物的能力，但不再呈现S形动力学，说明：
4、,酶有两个结合位点 ATP和CTP两种效应剂 可能是结合在同一部位。ATC酶效应剂结合位的 存在对S型动力学是必要的,ATCase的别构效应表现为四级 结构的大幅度变动：,利用ATCase的二底物过渡态类似物：PALA（N-膦乙酰-L-Asp)的研究表明：ATCase的6个亚基的底物结合位都位于催化链之间的 界面上，活性中心相距2.2nm 结合PALA后的酶，催化三聚体彼此拉开1.2nm，同时 旋转10；并使分别位于催化链N-端与C-端的氨甲酰 磷酸结合位和Asp 结合位彼此靠近，成为高亲和状态 一个催化亚基的构象变化通过亚基界面之间的相互作 用，传递给另一个催化三聚体，并引起后者构象的转变,
5、(2)负协同效应：3-P-甘油醛脱氢酶：,3-P-甘油醛+NAD+Pi NADH+1,3-2P-甘油酸+H+半位反应性：该酶为四聚体，但4个活性部位中只 有2个起作用兔肌 3 P-甘油醛脱氢酶与NAD+结合的解离常数解离常数 透析平衡法 荧光测定法 K1 10-10M 110-8 M K2 10-9 M 910-8 M K3 310-7 M 410-6 M K4 2.610-5 M 3.610-5 M,(3)协同作用的生理意义：异种协同效应:代谢调节,可被代谢末端产物反馈抑制和中间产物的别构激活。例如：EMP的己糖激酶，受G-6-P的别构抑制；丙酮酸激酶受ATP、乙酰CoA的别构抑制，受F-1
6、,6-2P的激活。同种协同效应:正协同：提供一个反应速度对底物浓度变化的敏感区，且 敏感区可通过别构激活或别构抑制剂加以调整 负协同：提供反应速度对底物浓度变化的不敏感区，保证在 低底物浓度时保证反应正常进行，而 高浓度时反应平稳,二 别构酶的几个动力学概念：,(一)S 0.5：表观Km值，在别构酶反应中速度达 到最大反应速度一半时的底物浓度(二)K系统与V系统：别构效应剂类型：K型效应剂：只改变S 0.5，但Vm不变 V型效应剂：不改变S 0.5，只改变 Vm K-V型效应剂：S 0.5 和Vm都改变,K系统,V系统,三 别构动力学,(一)Hill模式:把研究血红蛋白动力学应用到别构动力学。
7、E+nS k1 ESn k2 E+P k-1 总的解离常数Ks=ESn E0=E+ESn ESn 饱和分数：Ys=酶所结合的底物分子数 酶上底物结合位点数 Ys=n ESn=Sn n E0 Ks+Sn,Hill方程:Log(Ys)=nLogS-LogKs 1-Ys Log(Ys)LogS 作图 1-Ys V=k2 ESn Vm=k2 E0 V/Vm=ESn/E0=Ys带入中得:Log(V)=nLogS LogKs Vm-V 作图直线的斜率为n（Hill系数）,当V=Vm2 时，S=S 0.5 带入中 则：LogS 0.5=LogKs，S 0.5=(Ks)1/n=Ks 利用Hill模式判断协同的
8、类型：饱和指数(Rs)或 协同指数(CI)Rs=酶位点90%饱和时底物的浓度 酶位点10%饱和时底物的浓度 90%饱和：V=0.9Vm，S0.9=(9Ks)1/n 10%饱和：V=0.1Vm，S0.1=(1/9 Ks)1/n Rs=S0.9=81 1/n S0.1,若n=1 则 Rs=81 无协同 若n1 则 Rs81 负协同,Hill模式的缺陷:假设n分子底物和酶的结合一步完成，过于理想化 Hill模式用于研究别构模式时，对四个亚基酶来 说n=4，但实际n=2.62.8之间。并且在负协同 时，要求 n1。所以Hill系数已不能代表酶所能结合底物的位点数。用Hill方程在一 定底物浓度范围内作
9、图是一直线，但在广泛底物浓度下作图时为折线。,(二)MWC模式：,Monod-Wyman-Changeux:于1965年提出，也称齐变模式1.模式要点:别构蛋白是一种寡聚体，由多个相同原体构成。原体是寡聚蛋白最小的功能单位，它们在别构蛋白中占有相等的地理位置。寡聚蛋白至少有一个对称轴。每个亚基对同一种配体只有一个结合位点。蛋白亚基可具有R型和T型两种构象。这两种构象在无底物和效应剂存在时处于平衡状态。蛋白亚基都只能取相同的构象，无杂合体。亚基齐步转变 亚基的构象可变，但蛋白分子的对称性不变。无论多少配体结合到酶上，配体与R态 和T态酶的内在解离常数都相等，分别以KR和KT表示。,2.MWC解释
10、底物的同种协同效应。以四聚体别构蛋白为例：平衡常数L=T R R KR1 RS KR2 RS2 KR3 RS3 KR4 RS4 T KT1 TS KT2 TS2 KT3 TS3 KT4 TS4 KR1=KR=R S RS=4 RS 4 RS KR KR2=2KR=RS S RS2=6RS 2 3 RS2 KR2 KR3=3KR=RS2S RS3=4RS 3 2 RS3 KR3 KR4=4KR=RS3 S RS4=RS 4 RS4 KR4,L,同理可求知：TS、TS2、TS3、TS4 Ys=RS+2RS2+3RS3+4RS4+TS+2TS2+3TS3+4TS4 4(R+RS+RS2+RS3+RS
11、4+T+TS+TS2+TS3+TS4)R S(1+S)3+T S(1+S)3=KR KR KT KT R(1+S)4+T(1+S)4 KR KT定义：L=T，C=KR,=S,C=S R KT KR KT Ys=V=(1+)3+L C(1+C)3 Vm(1+)4+L(1+C)4,若酶结合位点为n，则：Ys=(1+)n-1+L C(1+C)n-1(1+)n+L(1+C)n 讨论:若S只与R态结合，则 KT C=KR/KT=0 则 Ys=(1+)n-1(1+)n+L 假设：n=4，以V 作图，L 越大，S型越明显 可解释底物的同种正协同效应,C=0n=4,若酶只有一种形式:只有T态，R=0,L=T/
12、R Ys=VVm=C=S 1+C KT+S 只有R态，T=0,L=T/R=0 Ys=VVm=S 1+KR+S 若KR=KT,则 C=1:Ys=/（1+）=S KR+S 若n=1(只有一个结合位点)：Ys=S KR(1+L)+S 1+LC,3.MWC解释异种协同效应:R L T，设KRKT(S优先与R结合)激活剂A使酶处于R态；抑制剂I 使酶处于T态 以二亚基酶为例:T KI1 TI KI2 TI2 L R KA1 RA KA2 RA2 KA1=KA=AR RA=2 AR 2 RA KA KA2=2KA=RA A RA2=RA 2 RA2 KA2同理：TI=2 TI TI2=TI 2 KI KI
13、2,KI:,KA，KI:激活剂、抑制剂 与酶的内在解离常数,I L=T+TI+TI2=T(1+KI)2 R+RA+RA2 R(1+A)2 KA L=T,=I,=A，则：L=L(1+)2 R KI KA 1+若结合位点数为n：则 L=L(1+)n 1+有底物存在时:由于KR KT,C0 Ys=(1+)n-1=(1+)n-1 L+(1+)n L(1+)n+(1+)n 1+,讨论:若只有激活剂存在，I=0时,则=0:L=L(1+)n L 表明R浓度下降，处于不利于和底物结合的T态的酶比例增加别构抑制。缺限:要求酶的构象变化是齐步的 没有考虑到负协同效应,(三)KNF模式,Koshland-Nemet
14、hy-Filmer 于1966年提出1.模式要点:对聚合体酶来说，每个亚基可有R和T两种状 态，但在无底物和效应剂存在时只有T态。亚基的构象改变可由于且只能由于配基和底物的结合引起，构象的改变是序变过程，存在杂合体 酶构象的改变只影响相邻亚基的变化，使其他配基的亲和力增加或减小。,2 KNF模式与底物协同：,以二亚基酶为例，酶受到底物诱导可能的构象变化：定义平衡常数：,T态,R态,由T2 TR包含三步：,由TR R2也包含三步：,令：KTT=1,T2=1,或,S,酶活性中心底物的饱和分数：总TR+2 R2 Ys=2(T2+总TR+R2),TR+RT=总 TR=2Kt KSR KTR SR2=K
15、t KSR KRR S TR=Kt 2 KSR 2 KRR S 2 KTR,几率因子=排列方式数,=Kt KSR KTR S+Kt2 KSR2 KRR S 2 1+2Kt KSR KTR S+Kt 2 KSR 2 KRR S 2 Ys 对S作图是一条S形曲线,1 亚基转变2 亚基缔合方式3 底物与R 结合数量4 底物浓度项,若KRR=KTR=1，即亚基之间无相互作用，则：YS=Kt KSR KTR S+Kt 2 KSR 2 KRR S 2 1+2Kt KSR KTR S+Kt2 KSR2 KRR S2=Kt KSR S+Kt 2 KSR2 S 2（1+Kt KSR S）2=S 1/Kt KSR
16、+S 符合米氏动力学,对于四亚基酶，其亚基排布有三种：,T3R=2(KtKSR KTR+KtKSR KTR2)S,TR3=2 Kt3KSR3 S 3(KTR KRR2+KTR2 KRR),T2R2=Kt2KSR2 S 2(KTR2 KRR+2 KTR KRR+2 KTR3+KTR2),R4=Kt4KSR4 KRR3 S 4,四亚基酶饱和分数表达式：,T3R+2T2R2+3 TR3+4R4 Ys=4(T4+T3R+T2R2+TR3+R4),T3R=4KtKSR KTR3 S,T3R=4KtKSR KTR2 S,3 KNF模式与效应剂：,激活剂与酶结合后，不影响酶继续结合底物；而抑制剂结合到酶分子
17、上之后，使酶的构象发生改变，不再与底物结合解释异种协同效应以二亚基酶为例。激活剂与底物共存时：,A,+A,A,A,+A,S,S,S,S,A,SA,A,SA,+A,+,+A,+A,+A,SA,SA,+S,+S,+S,+S,+S,+S,+S,+S,2,2,2,2,2,2,抑制剂与底物共存：,RI=2Kt Kt KSR KIC KRC S I,先求出各种酶形式的浓度，然后带入饱和分数表达式,(四)EIG模式:也称为总模式（general scheme），是1967年由Eigen提出的。要点:酶无论是否结合配体，亚基的构象都能发生变化 在同种酶分子中不同的构象的杂合体都能依次与 底物结合,四 酶的记忆
18、与滞后现象,(一)酶的记忆现象：Rabin模式来解释:E+S K1 ES 慢 Ka E S K2 E+P K-1 K-a 酶本身有一个缓慢异构化过程。V S作图呈现S形若ESES异构化很快，酶应符合米氏动力学激活剂可以加快异构化速度，减小S形性质 抑制剂延缓异构化过程，增强S形性质,Richard 模式：,假定：单亚基酶在无底物存在时，也具有两种处于平衡状态的异构型：方形和圆形。两者都可与底物结合，但方形与底物的亲和力高于圆形。结合底物后的酶被诱导出现第三种构象：六角形，但后者必须恢复到方形之后方能放出产物和游离态的方形酶。,酶的记忆现象：酶在释放出产物之后，仍然能“记得”它在释放出产物前的有
19、利构象，而不再恢 复原有构象的现象。具有记忆现象的酶称为记忆酶。记忆酶并不是别构酶：记忆酶是单体酶而非别构酶 记忆酶分子构象的改变不是协同作用,+S,k-a,ka,S,P,P,+S,缓慢,(二)酶的滞后现象：酶的滞后现象：酶对配体应答延缓的现象 如兔肌肉中磷酸化酶，加入底物糖原后几分钟才有产物放出。所有具有记忆现象的酶都有滞后现象，但有滞后效应的酶不一定都是记忆酶。滞后半时间：以加入配体开始到反应恢复正常所需时间的一半。可用于衡量酶的滞后程度。,具有滞后现象的酶可以是单体酶，也可以是寡聚酶 其它具有滞后现象的酶：寡聚酶由于亚基的聚合或解聚作用缓慢 MWC或KNF模式中若T、R两种构象之间变构速 度缓慢 酶本身不稳定，但可被高浓度底物稳定。如：大肠杆菌的Thr脱氢酶 其它假象：与激活剂共存；有杂质等,小结：,别构酶是寡聚酶 别构酶分子中包含两个在空间上是分开的、不同的活 性部位：底物结合位和效应剂结合位 每个亚基可以结合一个以上的配体，效应剂和底物 配体与酶结合后，可在底物-底物、效应剂-底物、效 应剂-效应剂之间产生正或负协同效应 别构酶出现协同效应的基础，是由于酶空间构象的改 变别构效应 具有别构效应的酶，其V S曲线不符合米氏双曲线，呈S形(正协同）或表观双曲线形(负协同）别构效应的判断：作图法或协同系数(hill系数和协同指数),
