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1、第三章 培养基,培养基是植物组织培养的重要条件。,在离体培养条件下，不同种植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同，只有满足了它们各自的特殊要求，它们才能很好地生长。,因此，没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官，在建立一项新的培养系统时，首先必须找到一合适的培养基，培养才有可能成功。,3.1.1 根据对培养基组成物质的化学成分是否完全了解来区分，可以将培养基分为天然培养基、合成培养基和半合成培养基。,3.1 培养基的种类,）天然培养基 天然培养基是指利用来自于各种动、植物或微生物的原料配制而成的培养基，不能确切知道它的化学成分，稳定性常受原材料等
2、因素的影响。,）合成培养基 合成培养基是一类化学成分和数量完全知道的培养基，它是用已知化学成分的化学药品配制而成。这类培养基化学成分精确、重复性强。,）半合成培养基 在合成培养基中，加入某种或几种天然成分；或者在天然培养基中，加入一种或几种已知成分的化学药品即成半合成培养基。,3.1.2 根据培养基的物理状态来区分，可以分为固体培养基、液体培养基和半固体培养基。,）液体培养基 所配制的培养基是液态的，其中的成分基本上溶于水，没有明显的固形物，液体培养基营养成分分布均匀，已更换，但培养过程中易缺氧。,）固体培养基 在液体培养基中加入适量的凝固剂即成固体培养基。常用作凝固剂的物质有琼脂、明胶、硅胶
3、等，以琼脂最为常用。固体培养基操作方便。,）半固体培养基 如果把少量的凝固剂加入到液体培养基中，就制成了半固体培养基。有一定的流动性。以琼脂为例，它的用量在0.21%之间。,3.1.3 根据成分是否完全来分,1）基础培养基 只含有大量元素、微量元素和有机营养物的培养基称为基础培养基。,2）完全培养基 除基础培养基成分之外，还包含不同的植物生长调节物质以及有机添加物，称为完全培养基。,3.2.1.无机营养物无机营养物主要由大量元素和微量元素两部分组成。,大量元素中，氮源通常有硝态氮或铵态氮，但在培养基中用硝态氮的较多，也有将硝态氮和铵态氮混合使用的。,磷和硫则常用磷酸盐和硫酸盐来提供。,钾是培养
4、基中主要的阳离子，在近代的培养基中，其数量有逐渐提高的趋势。,而钙、钠、镁的需要则较少。培养基所需的钠和氯化物，由钙盐、磷酸盐或微量营养物提供。,3.2培养基成分,微量元素包括碘、锰、锌、钼、铜、钴和铁。,培养基中的铁离子，大多以螯合铁的形式存在，即FeSO4与Na2EDTA（螯合剂）的混合，或NaFeEDTA 。,3.2.2.有机营养成分,植物组织培养中的培养物不同于完整的植株，没有系统的物质合成等自养功能。为了使离体的培养物能正常生长发育和分化，培养基中除需添加无机盆外，还需添加碳源、维生素、氨基酸等有机成分。,(1)碳源 碳源物质包括糖类、醇类和有机酸，以糖类物质最为重要。,一般来说；蔗
5、糖是最好的碳源，它具有热易变的性质，经高压灭菌后，大部分可分解为D-葡萄糖、D-果糖，仅剩下部分的蔗糖，这更有利于吸收和利用。此外，也可以直接利用果糖、葡萄糖、麦芽糖、纤维二糖等。不同糖类对培养材料生长的影响不同，一般来说，以蔗糖作碳源时，离体培养的双子叶植物的根生长得更好。而以右旋糖（葡萄糖）作碳源时，单子叶植物的根生长得较好。根据培养目的的不同，蔗糖使用浓度一般在2-5。碳源除了在培养基中提供培养物所需的碳骨架和能源外，还可在一定程度上调节培养基的渗透压，一般在-1.54.1MPa。,(2）维生素 主要有维生素Bl（盐酸硫胺素）、维生素B6（盐酸毗哆醇）、维生素B5（烟酸）、维生素C（抗坏
6、血酸），有时还需添加维生素H（生物素）、维生素M（叶酸，有时也写作维生素Bc)、维生素B2（核黄素）等。,维生素B1对愈伤组织的产生和生活力有重要作用，维生素B6能促进根的生长，维生素B5与植物代谢和胚的发育有一定关系。,维生素用量一般为0.11.Og/L、维生素C用量一般为1100mg/L。培养基中高浓度维生素C的使用并不一定是植物生长需要，而是作为抗氧化剂以防止组织褐变。,(3)肌醇 又叫环己六醇，在糖类的相互转化中起重要作用，也是细胞壁的构建成分。肌醇参与碳水化合物、磷脂代谢及离子平衡等生理活动，具有促进活性物质发挥作用的效果，在培养基中加入1.0mg/L的肌醇就足以影响维生素Bl的效应
7、。适当使用肌醇，能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成，对组织和细胞的繁殖、分化及细胞壁的形成也有作用。使用浓度一般为50一l00mg/L。,(4)氨基酸 氨基酸是蛋白质的组成部分，也是一种很好的有机氮源，可直接被植物细胞吸收利用。植物组织培养中最常用的氨基酸是甘氨酸，其它如精氨酸、谷氮酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。有时也应用水解乳蛋白（LH)或水解酪蛋白（CH) ,它们是牛乳经酶法处理等加工的水解产物，是含有20种左右氨基酸的混合物，用量在101000mg/L之间。 氨基酸不是必须的，但可以改进培养效果。,(5)天然复合物: 为了促进某些愈伤组织和器官的生长，在培养基中
8、还常加人某种化学成分不明的天然营养混合物，如水解酪蛋白（CH)、水解乳蛋白（LH)、椰乳（CM)、玉米胚乳、麦芽浸出物（ME）和酵母浸出物(YE）等。其大多成分比较复杂，含氨基酸、激索、酶等一些复杂化合物，对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用，但对器官的分化作用不明显。由于其对一些难培养的植物材料有特殊作用，所以在一些试验中经常应用。注意：这些混合物，在样本间差异较大，影响试验的重复性，并且提取的生长促进成分的质和量会因组织的年龄和品种变化，只要可能，尽量不用。,椰乳 是椰子的液体胚乳，它是使用最多、效果较好的一种天然复合物，一般使用浓度在l0-20。在愈伤组织和细胞培养中椰乳具有促进外植
9、体生长的作用，在马铃薯茎尖和草每微茎尖培养中椰乳具有明显促进茎尖生长的作用。未经加热灭菌的椰乳对促进外植体的生长作用比加热灭菌的椰乳更为明显。,香蕉汁 用量为150 200gL，对pH值的缓冲作用大。主要在兰花的组织培养中应用，对外植体的分化有明显促进作用。,马铃薯汁 马铃薯去掉皮后加水煮30min，再经过滤，取其滤液使用，用量为150 200gL 。对pH缓冲作用也大，多用于壮苗的培养。,水解酪蛋白 为蛋白质的水解物，主要成分为氨基酸，常用浓度为100-200mg/L。水解酪黄白在酸或酶的作用下易分解，使用时应注意。,其它 酵母提取液，主要成分为氨基酸和维生素类；麦芽提取液、苹果和番茄的果汁
10、、黄瓜的果实、未熟玉米的胚乳等，近年来，也有利用樱桃汁，甚至人参、西洋参粉和蜂王浆等天然物质的报道。,3.2.3 生长调节物质,常用的生长调节物质大致包括以下三类：,1 ) 植物生长素类 如吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、吲哚-3-丁酸（IBA）、萘氧乙酸（NOA）、对氯苯氧乙酸（p-CPA）、三氯苯氧乙酸（2，4，5-T）。 IBA、NAA广泛用于生根，并与细胞分裂素互作促进茎芽的增值。 2，4-D、 2，4，5-T用于愈伤组织的诱导和生长。生长素一般溶于95酒精或0.1molL的NaOH中，后者的溶解效果更好。,细胞分裂素 苄氨基嘌呤（ BAP ）
11、、苄基腺嘌呤（6-BA）、异戊烯氨基嘌呤（2-ip）、玉米素（Zt）、激动素（Kt）等。 作用是促进细胞分裂、愈伤组织分化不定芽、枝条的增殖。 细胞分裂素一般溶于0.5或1molL的HCl或稀薄的NaOH中。,3)赤霉素 组织培养中使用的赤霉素只有一种，即GA3。 与生长素与细胞分裂素相比，赤霉素不常使用。 作用促进矮小植株茎节伸长、刺激不定胚正常发育成小植株。赤霉素易溶于冷水，最多每升水可溶解1000mg。但GA3溶于水后不稳定，容易分解，最好以95的酒精配成母液保存在冰箱中，,4）脱落酸 一般不用，但可促进个别物种的愈伤组织的生长。,3.2.4 其它成分,1）活性炭 作用因物种而不同。兰花
12、、胡萝卜、长春藤、和番茄刺激培养物的生长和分化，因吸附抑制物质或使培养基变暗。烟草、大豆、山茶花抑制生长，因吸附植物激素。 活性炭用量一般为0.53。 注意：高压灭菌之前加入活性炭会降低培养基的pH值，使琼脂不易凝固。,2）硝酸银 作用是促进愈伤组织器官发生或体细胞胚胎发生；对克服试管苗玻璃化及早衰和落叶等也有明显效果。 抑制乙烯活性，原理是竞争性的结合于细胞膜上的乙烯受体蛋白，不能减少乙烯的积累。使用浓度一般为110mgL，过滤灭菌。 注意：不能把培养物长期存在含AgNO3的培养基上，否则，会导致再生植株畸形。,3）抗生素作用是防止外植体内生菌造成的污染。青霉素、链霉素、土霉素、四环素、氯霉
13、素、利福平、卡那霉素、庆大霉素等。用量一般为520mgL注意：选择抗生素要有针对性； 联合用药； 抗生素有抑制生长发育的作用（浓度较高时）； 降低植株的抗病性。,3.2.5琼脂及其它固化剂琼脂40凝固，一般使用浓度0.71。注意：不可用于营养需要研究，因其含有Ca、Mg和微量元素。Gelrite100 左右融化， 3045凝固，pH值4和7之间凝胶强度变化不大。琼脂糖凝固温度比琼脂低，多用于原生质体培养。,3.2.6 pH不同外植体要求pH值不同。一般在灭菌之前将pH值调到5.06.0之间。pH6，培养基会变硬；pH5，琼脂不能很好的凝固。,培养基成分的浓度表示,一般以质量表示（mgL）国际植
14、物生理协会建议使用摩尔（mole）值:大量元素、有机物质浓度用mmol L.微量元素、激素、维生素等用mol L,3.3 培养基选择,培养基有许多种类，根据不同的植物和培养部位及不同的培养目的需要选用不同的培养基 培养基的产生最早是Sacks(1680)和Knop(1681)，他们对绿色植物的成分进行了分析研究，根据植物从土中主要是吸收无机盐营养，设计出了由无机盐组成的Sacks和Knop溶液，至今仍在作为基本的无机盐培养基得到广泛应用。以后根据不同目的进行改良产生了多种培养基，White培养基在40年代用得较多，现在还常用。而到60和70年代则大多采用MS等高浓度培养基，可以保证培养材料对营
15、养的需要，并能生长快、分化快，且由于浓度高，在配制、消毒过程中某些成分有些出入，也不致影响培养基的离子平衡。,培养基的名称，多数以发明人的名字来命名，如White培养基，Murashige和Skoog培养基（简称MS培养基），也有对某些成分进行改良称作改良培养基。目前国际上流行的培养基有几十种，常用的培养基及特点如下：,（1）MS培养基它是1962年由Murashige和Skoog为培养烟草细胞而设计的。特点是无机盐和离子浓度较高，为较稳定的平衡溶液。其养分的数量和比例较合适，可满足植物的营养和生理需要。它的硝酸盐含量较其他培养基为高，广泛地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养，效果良好。
16、有些培养基是由它演变而来的。,(2) 改良怀特培养基 是1943年由White为培养番茄根尖而设计的。1963年又作了改良，称作White改良培养基，提高了MgSO4的浓度和增加了硼素。其特点是无机盐数量较低，适于生根培养。,(3)N6 是1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的。其特点是成分较简单，KNO3和（NH4）2SO4含量高。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花药培养和其他组织培养。,（3）B5培养基是1968年由Gamborg等为培养大豆根细胞而设计的。其主要特点是含有较低的铵，这可能对不少培养物的生长有抑制作用。从实践得知有些植物在B5培养基上生长更适宜，如双子
17、叶植物特别是木本植物。,（5）KM-80培养基它是1974年为原生质体培养而设计的。其特点是有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素，广泛用于原生质融合的培养。,3.4 培养基的配制,3.4.1 母液的配制与保存 培养基含有几十种营养成分，为了避免每次配制培养基都要对这几十种成分进行称量，可将培养基中的各种成分，按原量的1020倍或100200倍分别称量，配成浓缩液，这种浓缩液叫做培养基母液。 其中大量元素倍数略低，一般为1020倍，微量元素和有机成分等一般为100200倍。 如制备MS培养基母液所需的各类物质的量见下表，以供参考。,注：以上各种营养成分的用量，除了母液为20倍浓缩液外，其余
18、的均为200倍浓缩液。,上述几种母液都要单独配成1L的贮备液。其中，母液、母液及母液的配制方法是：每种母液中的几种成分称量完毕后，分别用少量的蒸馏水彻底溶解，然后再将它们混溶，最后定容到1L。,母液的配制方法是：将称好的FeSO47H2O和Na2-EDTA2H2O分别放到450mL蒸馏水中，边加热边不断搅拌使它们溶解，然后将两种溶液混合，并将pH调至5.5，最后定容到1L，保存在棕色玻璃瓶中。,各种母液配完后，分别用玻璃瓶贮存，并且贴上标签，注明母液号、配制倍数、日期等，保存在冰箱的冷藏室中。,母液的配制及保存应注意以下几个方面： 1)药品称量应准确，尤其微量元素化合物应精确到0.0001克，
19、大量元素可精确到0.01克。 2)配制母液的浓度适当，一是浓度大长时间保存后易沉淀，二是浓度小，用量少，在配制培养基时易影响精确度。 3)母液贮藏不宜过长，一般几个月左右，要定期检查，如出现浑浊、沉淀及霉菌等现象，就不能使用。 4)母液应放在24的冰箱中保存。,3.4.2培养基的配制 根据培养基配方，算好母液吸取量，并按顺序吸取，然后加入蔗糖溶液，并加入蒸馏水定容，并用0.11mol/l的HCl或NaOH调整pH值，加入琼脂加热熔化，配制好的培养基要趁热分注，倒入三角瓶等培养器皿中，封口准备消毒。,吸取母液时应注意：,在使用提前配制的母液时，应在量取各种母液之前，轻轻摇动盛放母液的瓶子，如果发
20、现瓶中有沉淀、悬浮物或被微生物污染，应立即淘汰这种母液，重新进行配制；,用量筒或移液管量取培养基母液之前，必须用所量取的母液将量筒或移液管润洗2次；,量取母液时，最好将各种母液按将要量取的顺序写在纸上，量取1种，划掉1种，以免出错。,3.4.3培养基的消毒1）高温高压消毒2）过滤消毒 过滤消毒应在无菌室或超净工件台上进 行，以避免污染培养基。,3.5 生长调节物质在组织培养中的应用规律,温暖,春暖花开,妈妈的嘱托,蝴蝶的爱情,恭喜发财,纯洁的爱,第10届亚太兰花大会暨第20届中国兰花博览会(2010 年 3月10-24号）,其中，16000平方米展场中，最抢眼的要数获得特别金奖的两大展品：一株
21、名为素冠荷鼎的莲瓣兰和一盆名为龙袍的拱形大花蕙兰。素冠荷鼎以1500万元的估价，一时成为展会的焦点。为一睹芳容，人潮纷纷涌来，独立展台周边一时人满为患。为维护秩序，主办方特安排了10名保安守护着展台。该展品由云南大理荡山州兰园选送，主人孙智勇介绍，素冠荷鼎为莲瓣兰中的荷瓣矮种叶型草，有“小荷才露尖尖角”之韵，其将莲瓣、素心和叶型草三大特点集于一身，是该品种价格一直居高的缘由。另一个特别金奖由来自日本的亚太兰花大会基金会会长永田治彦选送，大花蕙兰龙袍为黄花红心，花朵排列整齐，小花数多。,莲瓣兰素冠荷鼎（第20届中国兰花博览会特别金奖）,“素冠荷鼎”已经连续五年折戟兰博会特等金奖,由四株连瓣兰苗木
22、组成的“素冠荷鼎”，市面上极其少见，属兰花种别中的“稀世珍宝”。,大花蕙兰龙袍（第10届亚太兰花大会特别金奖）,重庆市规模最大的一次兰花展24日落幕，不少兰友仍依依不舍，甚至留下了眼泪。随着兰博会谢幕，为防止境外外来生物入侵，此次来自境外日本、印尼等地的8000多株洋兰都不能再回到家乡。撤展后，这批洋兰将被集中进行烧毁。据了解，在此次兰博会上获得“洋兰特别金奖”、号称价值数百万元的一盆蝴蝶兰也在销毁名单中。,蝴蝶兰离体快繁优化体系,蝴蝶兰性喜高温多湿、通风半阴的环境，需要的光照度是全日照的40%，相对湿度为70%，适宜温度为15-30。花期多在秋季，春、夏季也有开花的品种。繁殖方法可用无菌播种
23、、组织培养和分株法进行繁殖。蝴蝶兰是标准的附生植物，栽培时根部要求透气良好。盆栽用盆的底部一般要有个透气排水孔，脚部也要开有相应的透气缺口。可用特制的素烧陶盆或塑料花盆，也可用编织盆。因蝴蝶兰是气生兰，栽培基质不能用土，而以应用苔藓、碎砖粒、老树皮、棕树皮和椰壳纤维等为宜。,蝴蝶兰是单茎性气生兰,植株上极少发育侧芽,比其他种类的兰花更难进行常规无性繁殖。蝴蝶兰的组织培养技术相对较为成熟,许多国家已将此技术用于蝴蝶兰组培种苗的工厂化生产。但国内蝴蝶兰的种苗快速繁殖仍然以无菌播种为主,导致种苗个体间存在较大差异,成品蝴蝶兰花卉整齐度较差,严重影响蝴蝶兰的观赏性和商品价值。,外植体处理： （1）选择
24、有花梗的无病虫害的健壮的蝴蝶兰为母株,于温室之中培养。在取材前78d停止浇水,喷施杀虫、杀菌剂1次,培养710d即可采用。 （2） 选取饱满、健壮、有腋芽的花梗,用剪刀从花梗基部切割,将切割的花梗用手术刀切成56cm的茎段,放入培养杯中带回实验室。 （3）先用自来水冲洗15min,之后用0.5%洗衣粉溶液浸泡10min,再用自来水冲洗干净。,（4）将花梗切段,切口距芽2边各1.5cm为宜。将切割好的花梗节段,用0.1%的升汞消毒10min,取出并放于无菌切割纸上,用锋利的刀片剥去苞片,再用0.1%的升汞消毒8min,最后用无菌水冲洗5次。 （5）在超净工作台上将花梗节段的2边各切去约0.51.
25、0cm,将节段基部向下斜插入诱导培养基中,每杯接种1个含芽节段,贴上标签。,培养条件 试验材料均在植物组培室中培养,培养温度(252),光照1012hr/d,光照强度16002000lx。,诱导培养基： H+6BA12.0mg/L+NAA0.4mg/L+IBA0.4mg/L+CM100mL/L+柠檬酸50mg/L,pH5.4,H为花宝1号3g/L。继代培养基： H+6-BA0.3mg/L+NAA0.2mg/L+CM100mL/L，此培养基成苗收获系数最大,是蝴蝶兰继代增殖和壮苗的理想培养基。,移栽、炼苗培养基： 1/2H+6-BA0.2mg/L+NAA0.2mg/L+CM100mL/L，在此培养基中培养60d左右,待长出假鳞茎后移入温室炼苗。开瓶前在室温炼苗34d,然后打开瓶盖炼苗23d,拔出洗净根部,用0.3%的多菌灵水溶液浸泡12min即可种植。,移栽基质：用洗净的水草作基质,水草含水量约70%,直径5cm的塑料杯中先垫1/3的塑料泡沫,再装满水草,松紧要适度。蝴蝶兰“红日”试管苗移植,浇水宜少量多次,浇湿苗及栽培基质表层即可,栽培环境需保持80%90%的空气湿度。试管苗经15d的精细管理后适应性大大增强,移栽成活率可达95%以上。,
