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1、实 验 一,微生物培养基的配制和灭菌及纯培养,一、微生物培养基的配制和灭菌（不做）,目的要求实验材料实验程序,1、目 的,了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程。了解几种灭菌方法，掌握干热灭菌法和加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。,2、材 料 和 器 皿,主要药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、营养琼脂等。仪器：高压蒸汽灭菌器、恒温干热灭菌箱、紫外线杀菌灯。其它：天平、药匙、电炉、1N HCl、1N NaOH、pH试纸、三角烧瓶、量筒、玻棒、试管、培养皿、吸管、牛皮纸、纱绳、硅胶塞、标签等。,3、方法和步骤,培养基的配制培养基和玻璃器材的灭菌方法,培养基的概念及种类培养基的配方、配制步骤,
2、（1）培养基的配制,培养基 是指由人工配制的、适合微生物生长繁殖或产生代谢产物用的混合营养料。,培养基的介绍,碳源、氮源、无机盐、能源、生长因子、水,营养物质的浓度要适宜营养物质之间的配比要适宜,培养基的pH值、渗透压、水活度和氧化还原电势等物理化学条件要适宜。,细菌：pH 7.08.0放线菌：pH 7.58.5酵母菌：pH 3.86.0霉菌：pH 4.05.8藻类：pH 6.07.0原生动物：pH 6.08.0,初始pH,通常培养条件：,培养基的种类,按照培养基的物理状态可分为 1.液体培养基：不加凝固剂的液体状态培养基。2.固体培养基：在液体培养基中加入2%左右的凝固剂的固体状态的培养基。
3、3.半固体培养基：在液体培养基中加入0.20.5%凝固剂而成的半固体状培养基。,琼脂是最优良的凝固剂，自1880年代开始用于配制微生物培养基以来，至今经久不衰。,实验室的常用培养基：细菌：牛肉膏蛋白胨培养基；放线菌：高氏1号合成培养基培养；酵母菌：麦芽汁培养基；霉菌：查氏合成培养基；,培养基的配制,配方、配料,加热溶解,调pH(略),过滤（略）,分装(倒平板不分装）,灭菌,包扎(试管放在烧杯),摆斜面、倒平板,贮存,牛肉膏蛋白胨培养基的配制,1、液体培养基2、固体培养基3、半固体培养基,牛肉膏蛋白胨固体培养基配方(P.78)：牛肉膏 0.3g 蛋白胨 1g 氯化钠 0.5g 琼脂 1.5g 水
4、 100mL pH 7.27.4 灭菌 121，20min,牛肉膏蛋白胨半固体培养基配方：琼脂 0.3g,牛肉膏蛋白胨液体培养基配方：琼脂 0g,牛肉膏蛋白胨营养琼脂：按照配方生产的牛肉膏蛋白胨培养基，属于固体培养基。今天固体培养基用营养琼脂。,液体培养基和半固体培养基按照上述配方称量。,配制步骤：P.78,任何一种培养基一经制成就应及时彻底灭菌，以备纯培养用。一般培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌。常用的灭菌的方法有：干热灭菌、高压蒸汽灭菌、常压蒸汽灭菌、常压间歇式灭菌超高温灭菌、过滤除菌、辐射灭菌、化学药品灭菌等方法。本实验培养基的灭菌常使用的是高压蒸汽灭菌，它是利用高温湿热空气使菌体蛋白质凝固
5、变性而达到灭菌的。P.90,（2）培养基和玻璃器材的灭菌方法,高压蒸气灭菌 一般培养基:121.3,15-30 min 含糖培养基:112.6,15-30 min,培养基的灭菌,器皿的灭菌：干热空气：160，2 小时无菌室的消毒：紫外光 化学药物熏蒸（苯酚；高锰酸钾+甲醛）,二、微生物的纯培养（微生物的培养特征）,1、实验目的,1）掌握常用的分离纯化微生物的基本操作技术：平板划线法；2）掌握微生物无菌操作技术；3）熟悉不同微生物在固体斜面、半固体和液体培养基上的生长特征。,2、实验原理,1）微生物在自然界中无处不在，尤其在土壤中存在极其丰富。但自然界中的微生物都以混杂状态存在。要研究某种微生物
6、的性质，首先要获得这种微生物的纯培养物。2）在固体平板、固体斜面、半固体和液体培养基上，不同的微生物有其固有的培养特征。这些培养特征可以作为微生物分类鉴定的指标。,今天接种的菌种：,枯草杆菌 芽孢杆菌属的一种。单个细胞0.70.823微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。,大肠杆菌 需氧及兼性厌氧。G短杆菌，周鞭毛，有动力，周身有菌毛。,变形杆菌 为革兰氏染色阴性、无芽胞、无荚膜、周身鞭毛、运动活泼、两端钝圆的小杆菌。兼性厌氧。有些种在普通固体培养基上菌落
7、呈迁徙生长。在自然界中存在极广，水、泥土、阴沟及各种腐败的动、植物中最多，也存在于健康人和动物的肠道中。它们是条件致病菌，在特殊情况下对人致病，如食物中毒、尿路感染、夏季腹泻或其他混合感染。,葡萄球菌 是一群革兰氏阳性球菌，因常堆聚成葡萄串状，故名。在液体培养基的幼期培养中，常常分散，细菌细胞单独存在。代表种有金黄色葡萄球菌（S-taphylococcusaureus）（黄色）、白色葡萄球菌（Salbus）（白色）、柠檬色葡萄球菌（Scitreus）（橙色）。葡萄球菌无鞭毛，不能运动。无芽胞，除少数菌株外一般不形成荚膜。在肉汤培养基中24小时后呈均匀混浊生长，在琼脂平板上形成圆形凸起，边缘整齐
8、，表面光滑，湿润，不透明的菌落。不同种的菌标产生不同的色素，如金黄色、白色、柠檬色。,3、实验操作,（1）接种每组每人固体平板、试管斜面、半固体、液体培养基各1个。每组1人接种枯草杆菌，1人接种大肠杆菌，1人接种变形杆菌，1人接种白色葡萄球菌。写上自己的班级、学号、菌名。,平板接种方法参阅p.129；斜面接种方法参阅p.8；液体接种方法参阅p.99；半固体接种参阅P.49。,（2）培养特征观察于37下培养24h后观察各种菌株在不同的培养基上的培养特征，比较它们培养特征之间的差异(实验报告上的重点内容)。平板培养特征的描述参阅p.18表2，斜面培养特征参阅P.9，液体培养特征的描述参阅P.100
9、，半固体培养特征的描述参阅P.49-50。明天中午12:30观察结果并记录。,思考题：某人将培养了5天的革兰氏阳性菌进行革兰氏染色，他很奇怪地发现在油镜下细菌显红色。这是怎么回事？张三将已知革兰氏阳性菌和另一株革兰氏阴性菌放在相邻位置进行革兰氏染色，不巧的是他忘记加碘液这一步。在油镜下观察他的玻片时，你认为他会看到什么？为什么？,实验分组（35班）第一组：王燕萍 赵晓云 孙小慧 胡周燕第二组：何丽庆 屠丽媛 周晓青 方凯莉 第三组：高梦滢 苏小鸥 谢旻昀 计玲燕第四组：陆思琪 赵阳 沈良云 王雪飞第五组：吴燕江 方佳琪 沈京京 朱迎春 第六组：王芳芳 蔡珊珊 杨莹洁 陆丽第七组：廖茹珍 王菲菲 谢枫丹 谢荷艳第八组：周赛赛 俞静 聂清清 楼邢颖第九组：何飞旋 潘勇军 蒋珂 胡健,实验分组（34班）第一组：叶莉莉 李玲叶 艳菲 徐旭霞第二组：戴丽萍 罗淑红 郦超群 刘芳第三组：张丽雯 吕鹏花 郭梦园 王旭娜第四组：陈谦 蒋颖颖 金佳蓓 陈玲第五组：曾美娟 宋蓓蓓 陈佩 仲晓红第六组：蓝晓敏 冯倩倩 陈晓琴 唐文静第七组：蔡安娜 陈蕾俊 严慧君 阮川芬 第八组：盛贝贝 丁泽军 周华杰 姚展 第九组：沈超杰 李波波 沈亭 徐晓第十组：吴春雷 陈能平 曹恩东 周凯,实 验 报 告下次上实验时交,
