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1、Exercise six,微生物培养基的配制和灭菌,制作者：黄海婵（）Tel:0571-88320921 or 0571-88320057,目的要求实验材料实验程序,实 验 内 容,目 的 要 求,1.明确培养基的配制原理和方法，掌握其配制的一般方法和步骤。2.了解几种灭菌方法，掌握干热灭菌法和加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。3.熟悉分离、培养微生物前的有关准备工作及操作方法。,实 验 材 料,药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、马铃薯、蔗糖；可溶性淀粉、K2HPO4、KNO3、MgSO47H2O、FeSO47H2O等。仪器：高压蒸汽灭菌器、恒温干热灭菌箱、细菌过滤器、紫外线杀菌灯。其它物品
2、：天平、牛角匙、电炉、1N HCl、1N NaOH、pH试纸、刻度搪瓷杯、量筒、漏斗、漏斗架、玻棒、带玻璃珠的三角瓶、带棉塞的无菌试管、无棉塞的空试管、培养皿、吸管、各种包装纸、牛皮纸、绳索、棉花、标签等。,实 验 程 序,培养基的配制微生物常用器皿的准备培养基和玻璃器材的灭菌方法,实 验 程 序1（培养基的配制）,培养基的种类培养基的配制方法和步骤培养基的配方及配制分组,实验程序11（培养基的种类）,据组成成分可分为:1.合成培养基：由各种纯化学物质按一定比例配制而成。2.半合成培养基：有一部分纯化学物质和另一部分天然物质配制而成。3.天然培养基：利用天然来源的有机物配制而成。从培养基的物理
3、状态可分为 1.液体培养基：不加凝固剂的液体状态培养基。2.固体培养基：在液体培养基中加入2%左右的凝固剂的固体状态的培养基或农副产品培养基。3.半固体培养基：在液体培养基中加入0.20.5%凝固剂而成的半固体状培养基。,实验程序11（培养基的种类）,常用凝固剂为琼脂（其次为明胶），又叫洋菜、冻粉。,实验程序12（培养基的配制方法和步骤）,称量：按照配方正确称取各种原料放于搪瓷杯中。溶化：在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解。调pH值：用1N NaOH或1N HCl调pH，用pH试纸对照。加琼脂溶化：加热过程中要不断搅拌，可适当补水。过滤分装：注意不要污染棉塞。包扎成捆，挂上标签（必须用
4、铅笔写），注明何种培养基。灭菌摆斜面检查：培养基灭菌后必须在370C下恒温培养24h，确定无菌生长，方可使用。,实验程序12（培养基的配制方法和步骤）,摆斜面,分装,实验程序12（培养基的配制方法和步骤）,包扎,实验程序12（培养基的配制方法和步骤）,灭菌,高压蒸汽灭菌法,干热灭菌法,紫外线杀菌法,祥看实验程序4中的具体内容,培养基的配制和灭菌过程中的注意事项,1.蛋白胨很易吸湿，在称取时动作要迅速。,3.在琼脂溶化过程中，应控制火力，以免培养基因沸腾而溢出容器。同时，需不断搅拌，以防琼脂糊底烧焦，配制培养基时，不可用铜或铁锅加热溶化，以免离子进入培养基中，影响细菌生长。,4.pH不要调过头，
5、以免回调而影响培养基内各离子的浓度。,5.分装过程中，注意不要使培养基沾在管（瓶）口上以免污染棉塞而引起污染。,2.称药品时严防药品混杂，一把牛交匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净，擦干，再称取另一药品。瓶盖也不要盖错。,6.在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸气的温度低于饱和蒸气的温度。,不能灭菌的物质：1.爆炸性物质硝化丙烷、硝化甘油、硝化纤维，含氮硅酯。三硝基苯、三硝基甲苯、苦味酸、和其它爆炸性含氮复合物。过醋酸、过氧化甲乙酮、过氧化苯甲酰和其它过氧化有机物。2.lgn
6、itable 物质金属锂、钾、钠、黄磷、氧化硫，和红磷。,培养基的配制和灭菌过程中的注意事项,实验程序21（培养基的配方及配制分组）,牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（用于分离和培养细菌，是一种天然培养基）配方如下（书中P50和P214）：牛肉膏 3g 蛋白胨 10g 氯化钠 5g 琼脂 1520g 自来水 1000mL pH 7.27.4 灭菌 121，20min,（第一组、第二组、第三组第四组配制牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，每组九瓶，牛皮纸上标注“牛”）（第五、六组配制牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养基各40支/小试管）,实 验 程 序22（培养基的配方及配制分组）,马铃薯（或豆芽汁）蔗糖（或葡萄糖）琼脂培养基
7、（用于分离和培养真菌之用，是一种半合成培养基），其配方如下（书中P215）：去皮马铃薯200g 蔗糖（或葡萄糖）20g 自来水 1000mL 琼脂 1520g pH 自然 灭菌：121，20min马铃薯须煮沸30min之后，要用纱布过滤。,（第七组配制，每组九瓶，标注“马”）,实验程序23（培养基的配方及配制分组）,淀粉琼脂培养基（高氏一号Gause1），用于分离和培养放线菌，是一种合成培养基。配方（书中P54和P214）如下：可溶性淀粉 20.0g KNO3 1.0g K2HPO4 0.5g MgSO4 7H2O 0.5g NaCl 0.5g FeSO4 7H2O 0.01g 琼脂 20g
8、自来水 1000mL 灭菌：121 20min 淀粉先用冷水调成糊状，倒入煮沸的水中。,（第八组配制，每组九瓶，标注“高”）,实验程序24（培养基的配方及配制分组）,伊红美兰培养基（EMB培养基）。配方如下（书中P220）：蛋白胨水琼脂培养基（即蛋白胨水培养基（P217）+2%琼脂）共九瓶 100ml 20%乳糖溶液（一瓶）50ml 2%伊红水溶液（一瓶）50ml 0.5%美蓝水溶液（一瓶）50ml,（第九组配制，标注“伊”）,121，灭菌20min,115 灭菌，20min,实验程序25（培养基的配方及配制分组）,牛肉膏蛋白胨培养基+2%葡萄糖，配方如下：牛肉膏 3g 蛋白胨 10g 氯化钠
9、 5g 葡萄糖 2g 琼脂 1520g 自来水 1000mL pH 7.27.4 灭菌 121，20min,（第十组配制，每组九瓶，标注“肉葡”）,实验程序26（培养基的配方及配制分组）,丙丁斜面培养基是一种合成培养基。配方如下：葡萄糖 4%进口胰蛋白胨 0.6%醋酸铵 0.3%酵母膏 0.2%牛肉膏 0.2%硫酸镁 0.02%硫酸亚铁 0.001%琼脂 2%灭菌：121，20min,（第十一组配制，每组40支斜面/小试管）,实验程序27（培养基的配方及配制分组）,乳糖蛋白胨培养液（“水的细菌水检查”）。配方如下（书中P220）：蛋白胨 10.0g 牛肉膏 3.0g 乳糖 5.0g NaCl
10、5.0g 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1ml 水 1000ml 灭菌：115 30min 在加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 之前，将其它物质混合溶解之后调pH至7.27.4。每只试管中加入5ml培养液，试管中必须放置倒置管,（第十二、十三组配制，每组40支大试管）,实验程序28（培养基的配方及配制分组）,三倍乳糖蛋白胨培养液（“水的细菌水检查”）。配方如下（书中P220）：蛋白胨 10.0g 3 牛肉膏 3.0g 3 乳糖 5.0g 3 NaCl 5.0g 3 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1ml 水 1000ml 灭菌：115 30min 在加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 之前，将其它物质混合溶解之后
11、调pH至7.27.4。每只试管中加入5ml培养液，试管中必须放置倒置管,（第十四、十五组配制，每组20支大试管）,实验程序29（培养基的配方及配制分组）,无菌水的制备 无菌水为下一次微生物分离实验中所需要的材料。100mL三角烧瓶（装有玻璃珠），装自来水45.0mL，试管中装9.0mL自来水，塞上棉塞，包扎、灭菌备用。三角烧瓶和试管须预先塞好棉塞，并经干热灭菌。,实验程序3（微生物常用器皿的准备和包扎）,清洗一些玻璃仪器：如三角烧瓶、试管、培养皿、吸管等。棉塞的制作包扎培养皿、涂棒和吸管等。,点击录像,实验程序4（培养基和玻璃器材的灭菌方法）,干热灭菌法：电热烘箱作为干热灭菌器加压蒸汽灭菌法
12、其步骤如下：1.加水：灭菌器内加入一定量的水，将用防水纸包扎好的物品放入其中。2.通电：接通电源，进行加热。3.排气：排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待排出大气后关闭排气阀；或关闭排气阀，待压力上升到0.5kg/cm2时再打开排气阀，待压力回复到0时再关闭排气阀。4.恒温灭菌：当压力达15bl/in2（即1.05kg/cm2）时，此时灭菌器内的温度为1210C，维持30min。对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物时，应适当降低压力，延长时间。5.结束：灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时，才能打开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品。,实验程序4（培养基和玻璃器材的灭菌方法）,实验
13、程序4（培养基和玻璃器材的灭菌方法）,间歇灭菌法：待灭菌的物品放在灭菌器或蒸笼里，每天蒸煮1次，每次煮沸1h，连续3d重复进行。在每两次蒸煮之间，将物品（指培养基）放在370C恒温条件下培养过夜，这样可以使每次蒸煮后未杀死残留的芽孢萌发成营养体，以便下次蒸煮时杀灭。过滤除菌法：不能用加热灭菌的液体物质（如维生素、血清），一般可用细菌过滤器进行除菌。（教师示范）,实验程序4（培养基和玻璃器材的灭菌方法）,实验程序4（培养基和玻璃器材的灭菌方法）,实验程序4（培养基和玻璃器材的灭菌方法）,紫外线灭菌法：一般30W灯管，9m3空间，距地面2m每次打开紫外线照射0.5h，就使室内空气灭菌。若照射紫外线
14、时先喷洒石炭酸等化学消毒剂，可增强灭菌效果。紫外线虽有较强的杀菌力，但穿透力弱，即使一薄层玻璃或水层就能将大部分紫外线滤除，因此只适用于空气及表面杀菌。化学药剂消毒灭菌：微生物实验室中常用的化学杀菌剂有升汞、甲醛、高锰酸钾、酒精、碘酒、龙胆紫、石炭酸、漂白粉、新洁尔灭、煤酚皂溶液，它们有的是杀菌剂，有的是抑菌剂，详见表64。,实验程序4（培养基和玻璃器材的灭菌方法）,返回,思考题,固体培养基加琼脂后加热溶化时要注意哪些问题？培养基中加琼脂的作用是什么？干热灭菌、高压蒸汽灭菌和间歇灭菌的场合有何不同？如何检查培养基灭菌是否彻底？,实 验 六,结 束,实验七 土壤的分离纯化（书实验二十四：P69）请同学们自带土壤,下周实验,
