高效液相色谱分析法 HPLCppt课件.ppt

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1、第八章 高效液相色谱分析法 High Performance Liquid Chromatograph,8.1 概述,Chromatography 利用当流动相带着混合组分在固定相间流动时，由于各组分在两相中有不同的吸附能力、溶解度或渗透性等特性，因而当两相作相对运动时，组分会在两相间进行反复多次分配，使原来微小的分配差异变大，移动速度不同，从而使混合组分得到分离,1. 发展历史,1906 Russian botanist Tsweet 经典液相色谱法 to separate the various plants pigments1941, Martin and Synge Liquid-li

2、quid partition chromatography1952，Martin and James Gas chromatography60年代 采用高压输液泵的高效液相色谱法70年代 采用电导检测器的离子交换色谱法80年代末 毛细管电泳分离法,Based upon the physical status of the mobile phase 流动相 Gas chromatography（气相色谱法）:Gas-solid chromatography (气-固色谱法) 固定相为固体吸附剂 Gas-liquid chromatography (气-液色谱法)固定相为涂在固体担体或毛细管内壁上

3、的液体 Liquid chromatography（液相色谱法）: Liquid-solid chromatography (液-固色谱法)固定相为固体吸附剂Liquid - liquid chromatography (液-液色谱法)固定相为涂在固体担体上的液体Superficial-fluid chromatography (超临界流体色谱法)Mobile phase is a substance at temperature and pressure above its critical point,2. Classification of Chromatographic methods

4、,液相色谱法分类,3.高效液相色谱法的特点,特点：分离效能高、选择性高、检测灵敏度高、分析速度快应用：高沸点、大分子量、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析,高效液相色谱法与经典液相色谱法比较,高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点在于：高速、高效、高灵敏度、高自动化,高效液相色谱法与气相色谱法比较,分析对象GC：只限于分析气体和沸点较低的化合物（占有机物总数的20）HPLC：可分析高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质（占有机物总数近80）流动相GC：流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力，即不产生相互作用力，仅起运载作用HPLC：流动相可选用不同极性的液体，选择余地大，它对组分可产生一定亲

5、和力，并参与固定相对组分作用的剧烈竞争。因此流动相对分离起很大作用操作温度GC：一般都在较高温度下进行HPLC：通常在室温条件下工作,4.高效液相色谱法的应用,适于高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质的分析在工业、科学研究，尤其是在生物学和医学等方面应用极为广泛。如氨基酸、蛋白质、核酸、烃、碳水化合物、药品、多糖、高聚物、农药、抗生素、胆固醇、金属有机物等分析右图是各种HPLC方法的应用范围及对象,分子量,HPLC的局限性,使用多种溶剂做流动相，成本高，污染大当使用梯度洗脱时，操作比GC的程序升温复杂缺少通用型的检测器不能替代毛细管GC去完成柱效高达10万块塔板以上的复杂体系的分离（如多沸程的

6、石油产品）不能替代中、低压色谱，在200kPa1MPa下去完成在高压下易分解、变形的具有生物活性的生化样品的分离,8.2 高效液相色谱仪,HPLC仪器包括： 高压输液装置 (Delivery system) 进样系统 (Injection system) 分离系统 (Separation system) 检测系统 (Detection system) (梯度淋洗、自动进样和数据处理装置),液相色谱仪,Waters HPLC,1. 流动相贮存与脱气,贮液罐一般由玻璃、不锈钢或氟塑料制成，容量为1到2 L，用来贮存足够数量、符合要求的流动相流动相输出端配0.45 m膜过滤器，防止颗粒物进入泵内流动

7、相脱气作用：防止在洗脱过程中，当流动相由色谱柱流入检测器时因压力降低而产生气泡消除溶解在流动相中的氧的影响氧会造成荧光猝灭还会使样品组分氧化或使固定相分解而导致柱分离性能改变,脱气方法：真空泵抽滤脱气：单一溶剂低溶性惰性气体导入替换:氦气 超声脱气在线真空脱气 （On-line degasser）实现流动相在进入高压泵前的连续在线脱气和过滤,2. 高压泵和梯度洗脱装置,(1) 高压输液泵压力：150350105 Pa作用：将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱系统 对输液泵的基本要求 能在高压下连续工作流量准确可调 0.1-10mL/min输出流量稳定耐腐蚀（耐酸不锈钢、PEEK聚醚醚酮）泵的死

8、体积小 （小于0.5mL ）,输液泵种类：恒压泵：可迅速获得高压，适于柱的匀浆填充。但输出流量随色谱系统阻力变化而变化，现已较少使用恒流型：溶剂流量恒定，与柱填充情况无关机械注射式恒流泵机械往复式恒流泵：每分钟往复25100次，脉动小,(2) 梯度洗脱装置,梯度洗脱(Gradient Elution or Solvent Programming): 在样品分离过程中，按一定程序连续改变流动相中的两种或两种以上溶剂的比例，以改变流动相的极性、离子强度和pH等，从而改变被测组分的相对保留值，提高分离效率，加快分离速度适用于组分分配比k相差很大的体系,梯度洗脱类型:线性梯度：在某一段时间内连续而均匀

9、增加流动相强度阶梯梯度：直接从某一低强度流动相改变为另一较高强度流动相根据溶液混合的方式可以将梯度洗脱分为高压梯度（内梯度） : 利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱可获得任意形式的梯度，易于实现自动化溶剂的可压缩性和溶剂混合时热力学体积变化可能影响流动相的组成低压梯度（外梯度）: 一台高压泵， 通过比例调节阀，将两种或多种不同极性的溶剂按一定比例抽入混合器中混合，然后由高压泵输送至色谱柱中,消除由于溶剂混合引起的热力学体积变化的影响可减小溶剂可压缩性的影响,3. 进样装置,进样要求：将样品定量的、瞬间注入到色谱柱头填料中心，形成集中的一个点（柱

10、塞式进样） 进样装置:1）隔膜注射进样：使用微量注射器进样 装置简单、死体积小。但进样量小且重现性差2）高压进样阀：目前最常用的为六通阀 由于进样量可由样品管控制，因此进样准确，重复性好3) 自动进样器,4. 色谱柱,对色谱柱的要求：内壁光滑的直型不锈钢柱，柱接头的死体积尽可能小柱长多为1030cm，内径为45mm尺寸排阻色谱柱常大于5mm，制备色谱柱内径更大 发展趋势是减小填料粒度以提高柱效柱外效应引起的峰形扩展不可忽视,柱的填充（Packing）：干法： 粒度 20 m湿法（匀浆法）： 粒度 20 m平衡密度法：使溶剂密度和填充颗粒密度相近，此时颗粒沉降速度趋于0常用的匀浆试剂有四氯乙烯、

11、四溴乙烷和二碘甲烷等填充方法：用流动相充满色谱柱及其延长管中，然后将匀浆液倒入匀浆填充器，在较高压力下迅速将其注入色谱柱内要求填充速度快(防凝聚、沉降或结块)、且无空气进入(影响填充均匀性),5. 液相色谱检测器,溶质性检测器 (Solute Property Detectors )：只检测色谱柱后流出液中组分的物理、化学性质的变化紫外检测器 (UV Absorbance Detector )荧光检测器 (Fluorescence Detector ) 总体检测器 (Bulk Property Detector ) ：检测从色谱柱流出的流动相和组分总体物理性质的变化示差折光检测器 (Diffe

12、rential Refractometric Detector )电导检测器 (Conductivity Detector ),5. 液相色谱检测器,a. 紫外检测器 检测原理：和UV-Vis方法一样 应用最广：HPLC分析中，约80%的物质可以在254 或280 nm处产生紫外吸收 采用微量吸收池，通常其光程为2-10 mm, 体积约为1-10 L 特点： 灵敏度高 线形范围大 波长可选，易于操作对流动相的流速和温度变化不敏感 可用于梯度洗脱,光电二极管阵列检测器,紫外检测器的重要进展 光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，可分别同时检测特定波长(180-600 nm),10 ms内完

13、成一次检测计算机快速处理三维立体谱图,快速扫描光电二极管阵列（PDA）检测所获得的三维色谱-光谱图,b. 示差折光检测器（differential refractive index detector）,原理：通过连续测定参比池和测量池中溶液的折射率之差，来测定样品的浓度特点：通用型检测器（除紫外检测器之外应用最多的检测器）对温度敏感、不能用于梯度洗脱灵敏度低（10-7g/mL ）,偏转式、反射式和干涉型三种干涉式折光指数检测器造价高用的较少,偏转式：利用两束相同角度的光照射溶剂相和样品+溶剂相，利用二者对光的折射率不同，其中一束（通常是通过样品+溶剂相）光因为发生偏转造成两束光的强度差发生变化

14、，将此差示信号放大并记录，该信号代表与样品的浓度呈正比流通池体积大（10 L ）可用于各种溶剂折射率的测定,反射式折光指数检测器通过测定经流动相折射后反射光的强度变化，来测定组分的含量流通池体积小（3 L ）用于不同溶剂折射率的测定时需更换流通池1.31-1.44和1.40-1.60,c. 荧光检测器（Fluorescence detector）,原理：许多有机化合物，特别是芳香族化合物、生化物质，被一定强度和波长的紫外光照射后，发射出较激发光波长要长的荧光 特点：高灵敏度、高选择性所需样品量很小 应用：多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等对部分不产生荧

15、光的物质，可先衍生化在测定,d）电导检测器原理：基于待测物在一些介质中电离后所产生的电导（电阻的倒数）变化来测量电离物质的含量电导检测器的构成： 由电导池、测量电导率所需的电子线路、变换灵敏度的装置和数字显示仪等几部分组成，电导池是其核心。响应受温度影响较大，因此需要将电导池置于恒温箱中不能用于梯度洗脱当pH7时，该检测器不够灵敏电导检测器主要用于离子色谱的检测,e) 蒸发激光散射检测器（Evaporative laser scattering detector, ELSD）,原理：基于溶质的光散射性质属通用型和质量型检测器消除了溶剂干扰和温度变化引起的基线飘移可用于梯度洗脱适合于无紫外吸收、

16、无电活性和不发荧光的样品的检测,f）安培检测器 由恒电位仪和一薄层反应池（体积为15L）组成 原理：利用待测物流入反应池时在工作电极表面发生氧化或还原反应，两电极间就有电流通过，此电流大小与待测物浓度成正比,采用安培检测器时，流动相必须含有电解质，且呈化学隋性最适于与反相色谱匹配。但此检测器只能检测有电活性的物质,8.3 主要分离类型与原理,8.3.1 液-固吸附色谱 liquid-solid adsorption chromatograph8.3.2 液-液分配色谱 liquid- liquid partition chromatograph8.3.3 离子交换色谱 ion-exchange

17、 chromatograph8.3.4 离子色谱 ion chromatograph8.3.5 离子对色谱 ion-pair chromatograph8.3.6 排阻色谱 size- exclusion chromatograph8.3.7 亲和色谱(AC) Affinity chromatograph,8.3.1 液-固吸附色谱liquid-solid adsorption chromatography,固定相：固体吸附剂，如硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等 结构类型：全多孔型和薄壳型 粒度：510 m流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸应用: 适用

18、于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾,应用：环境中有机氯农药残留量分析 固定相：薄壳型硅胶(37 50m) 流动相：正己烷 流 速：1.5 mL/min 色谱柱：50cm2.5mm(内径) 检测器：差示折光检测器,可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。,8.3.2 液-液分配色谱Liquid- liquid partition chromatography,固定相与流动相均为液体（互不相溶） 基本原理：根据各待测物在互不相溶的两溶液中的溶解度不同，因而具有不同的分配系数 流动相：为防止固定相的流失，流动相与固定液应尽量不

19、互溶，或者说二者的极性相差越大越好正相分配色谱：流动相极性小于固定相极性，极性小的先流出，适于极性组分分离）反相分配色谱：流动相极性大于固定相极性，极性大的先流出，适于非极性组分分离）固定相：机械涂渍固定相化学键合固定相,机械涂渍固定相：将固定液通过机械混合的方法涂渍到表面多孔型(0.5-1.5%涂布量)或全多孔型载体(5-10%涂布量)上形成的液液色谱固定相全多孔型担体: 由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体早期采用100m的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见现采用10m以下的小颗粒，化学键合制备柱填料 表面多孔型担体（薄壳型微珠担体） : 3040m的玻璃微球，表面附着一层厚度为

20、1 2m的多孔硅胶表面积小，柱容量底不足：固定液易流失分离稳定性及重现性差不适合梯度淋洗,化学键合固定相通过化学反应将不同的有机官能团键合在载体表面Si-O-R：对热不稳定、遇水、乙醇等强极性会水解，使酯链断裂，因此只适于以不含水或醇的流动相Si-R(或Si-N)：不水解，热稳定性比硅酸脂好。但所用的格氏反应不方便。使用水溶液作流动相时，其pH应在4-8之间Si-O-Si-R：不水解，热稳定性好，在pH2-8范围内对水稳定,Octadecylsilane(ODS):十八烷基硅烷化键合相,化学键合固定相的特点：传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲

21、击；耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定 选择性好，可键合不同官能团，提高选择性有利于梯度洗脱分离机理：双重分离机制，键合基团的覆盖率决定分离机理高覆盖率：分配为主低覆盖率：吸附为主,例：稠环芳烃的分析,稠环芳烃多为致癌物质,固定相：十八烷基硅烷化键合相 流动相：20%甲醇-水 100%甲醇 线性梯度淋洗，2%/min 流 速：1mL/min 柱 温：50 C 柱 压：70 104 Pa 检测器：紫外检测器,蛋白质的分析,8.3.3 离子交换色谱 ion-exchange chromatography,固定相：阴离子交换树脂或阳离子交换树脂离子交换树脂：苯乙烯和二乙烯苯交联聚合而成 固定离子基团可交换

22、离子基团阳离子：可交换离子基团带正电荷阴离子：可交换离子基团带负电荷 流动相：阴离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液,基本原理：基于离子交换树脂上的可交换离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子之间发生可逆交换，利用不同待测离子对固定相的亲和能力（或离子交换能力）的差别来分离 阳离子交换：RSO3H + M+ = RSO3 M + H + 阴离子交换：RNR4OH + X- = RNR4 X + OH-应用： 分离无机离子和有机酸、有机碱等可离解的物质 生物物质的分离（如氨基酸、核酸、蛋白质等）,离子交换分离机理,Temporal course,1）多孔型（

23、包括微孔型和大孔型）： 聚苯乙烯+二乙烯苯交联交换基团多交换容量大，稳定。但易溶胀，传质慢、柱效低、分析速度慢2）表面多孔型： 薄膜型=惰性核+树脂薄层(1-2m) 多孔型=惰性核+硅胶微球+树脂薄层 克服了多孔型离子交换树脂的不足，但交换容量低，柱子易超负荷,1. 离子交换色谱固定相,3）离子交换键合相：利用化学反应将离子交换基团键合到惰性载体表面载体可以是薄壳玻珠，也可以是多孔硅胶微粒。使用后者为载体，可得到性能稳定、耐压、高柱效的柱子,2. 流动相： 离子交换色谱流动相为盐类缓冲溶液(有一定pH和离子强度) ，通过改变以下条件来控制分配比k，改变交换剂的选择性，进而影响样品的分离。pH值

24、：影响酸或碱的离解平衡，控制组分离子形式所占的分数。 常用的有柠檬酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐和氨水等。离子强度I：对保留值的影响比pH更大。组分保留值受流动相中盐类总浓度控制。增加外加阴或阳离子将增加它们对R+或R-的竞争能力，使组分保留值减小。通过加入不同种类的盐，可影响柱的选择性，因为不同物质对交换剂的亲和能力不同。有机溶剂：外加有机溶剂通常减小组分的保留值。其极性越小，保留值越小。常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、乙腈和二氧杂环已烷等。配离子L：当大量L、组分X随流动相进入柱后，发生配位剂交换： RM-L+X RM-X+L该法用于分离各种氨基酸或碱类,例：分离阴离子,Column ： Ion

25、Pac AG12A / AS12AEluent ： 2.7mM Na2CO3 0.3mM NaHCO3Flow rate： 1.2mL/minDetection： Conductivity (ASRS Recycle mode),0,2,4,6,8,10,12,14,16,Retention time(min),0,8,mS,Column:IonPac CS12A, CG12AEluent :20 mM Methanesulfonic acidFlow rate:1.0 mL/minDetection:Conductivity （CSRS Recycle mode),例：分离阳离子,8.3.4

26、 离子色谱 Ion chromatography,1975 由H. Small 等首次提出, 用于测定氯离子和硫酸根分离原理：与离子交换色谱原理一样与离子交换色谱的区别：采用特制的、具有极低交换容量的离子交换树脂为柱填料采用抑制柱来消除淋洗液的高本底电导采用电导检测器离子色谱具有以下优点分析速度快 分离能力高分离混合阴离子的最有效方法耐腐蚀，仪器流路采用全塑件，玻璃柱,1.离子色谱装置类型,抑制型：抑制柱型、连续抑制型 分离柱中离子交换树脂的交换容量通常在0.010.05毫摩尔/克干树脂,非抑制型: 当进一步降低分离柱中树脂的交换容量(0.0070.07毫摩尔/克干树脂),使用低浓度、低电离度

27、的有机弱酸及弱酸盐作淋洗液，如苯甲酸、苯甲酸盐等。检测器可直接与分离柱相连，不需抑制柱,抑制器的作用:提高待测离子的电导率Na+, Cl- H+,Cl-降低背景电导 (淋洗液)Na+,HCO3- H2CO3Na+,OH- H2O,极限摩尔电导值,Total conductivity （ ） （ ）,（unit：S/m equivalent）,2. 抑制器类型,树脂填充的抑制柱：填充了带相反电荷离子交换树脂交换容量高、制备容易不能连续工作，抑制柱中的树脂需定期停机再生微膜抑制器自动再生连续抑制器,抑制柱上的交换反应,微膜抑制器结构,抑制器的工作原理 (阴离子),抑制器的工作原理 (阳离子),微膜

28、抑制器的优缺点,优点：可以连续再生交换容量高死体积小（50L以下） 缺点：基体物质和溶剂对膜可能带来损害工作曲线线性范围受离子交换膜的影响,新型连续自动再生柱抑制器,三根高容量、长寿命和易操作的微填充抑制柱。 一根在流路工作 一根用硫酸再生 一根用水冲洗,离子色谱的应用,例: 阴离子分析 双柱；薄壳型阴离子交换树脂分离柱(3250mm), 流动相：0.003molL-1 NaHCO3 / 0.0024 molL-1 Na2CO3，流量138 mL/hr 七种阴离子在20分钟内基本上得到完全分离，各组分含量在350 ppm,8.3.5 离子对色谱 ion pair chromatography,

29、原理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C-18柱)，含有对离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样离子X-进入流动相后，生成疏水性离子对Y+ X -后, 在两相间分配主要用于分离分子量大的阴、阳离子脂肪酸、阴离子和阳离子表面化活性剂、烷基和芳香磺酸盐等,反相离子对分离机理,Column : IonPac NS1、NG1 El

30、uent : 2 mM TBAOH, 24%48% CAN gradient in 10 min Flow rate : 1.0 mL/min Detection : Conductivity (suppressor type) （ASRS MPIC Mode） Regenerator : 10 mN H2SO4 1. Methanesulfonic acid 5.0 g/mL (ppm) 2. 1-Propanesulfonic acid 8.6 3. 1-Butanesulfonic acid 8.7 4. 1-Hexanesulfonic acid 8.8 5. 1-Heptanesul

31、fonic acid 8.9 6. 1-Octanesulfonic acid 8.9 7. 1-Decanesulfonic acid 9.1,反相离子对分离测定,8.3.6 体积排阻色谱size- exclusion chromatography,固定相：凝胶,具有一定大小孔隙分布软质凝胶:葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构水为流动相。适用于常压排阻分离半硬质凝胶: 苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶 非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂硬质凝胶: 多孔硅胶、多孔玻珠等 化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响小，可在较高流速下使用 原理：按分子尺寸大小分离

32、可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量分离,凝胶色谱柱的总体积VA为： VA Vg Vi V0Vg：填料骨架的体积Vi ：填料孔体积V0 ：填料颗粒之间的体积A:排阻极限B:渗透极限,凝胶色谱法的局限性：洗脱体积总是位于V0到Vi V0之间，因此凝胶色谱峰容量有限不能完全分离复杂的、多组分体系不能用于分子大小相似或分子量相差10以内的组分的分离,凝胶色谱法在聚合物研究中的应用,色谱柱：KF-80M(I.d.2cm, L 60cm)流动相：四氢呋喃 1ml/min柱前压：1.5 Mpa常温检测器：UVD 254 nm,8.3.7 亲和色谱 Affinity chromatograp

33、h,原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离,固定相：将具有生物活性的配位体以共价键结合到不溶性固体基质上制得生物活性配位体：常用的有酶（如底物及其类似物）、辅酶（如类固醇）、抗体（植物激素）、激素（如糖和多糖）、抗生素（核苷酸）等基质天然有机高聚物制成的凝胶，如琼脂糖、葡聚糖等合成有机聚合物形成的凝胶，如聚丙烯酰胺及其衍生物应用：主要用于蛋白质和生物活性物质的分离与制备,Lock and key structural complex“锁匙结构络合物”,8.4 液相色谱的流动相,液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂 流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状

34、况按流动相组成分：单组分和多组分按极性分：极性、弱极性、非极性按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗常用溶剂： 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间,流动相选择,在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。常用溶剂的极性顺序：水(最大) 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯

35、仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小),溶剂选择性分组,选择流动相时应注意的几个问题,（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。,（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。,（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。,（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。,8.5 影响分离的因素与操作条件的选择,1). 影响分离的因素与提高柱效的途径 在HPLC中, 分子扩散项B/U较小，可以忽略不计，即： H = A + C u 液

36、体的黏度比气体大一百倍，密度为气体的一千倍，故降低传质阻力是提高柱效主要途径（降低固定相粒度） 不可能通过增加柱温来改善传质。恒温 改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接的因素,流速大于0.5 cm/s时, Hu曲线是一段斜率不大的直线。降低流速，柱效提高不是很大。但在实际操作中，流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重要可选择参数。,3）.固定相及分离柱 气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。,2）.流速,2. 分离类型选择,8.6 制备型液相色谱 preparative liquid

37、chromatography,获得高纯物质（色谱纯）的有效方法 半制备柱（内径8mm，长度15 30cm），一次制备量.1mg；,1.色谱柱的柱容量（柱负荷） 对分析柱：不影响柱效时的最大进样量； 对制备柱：不影响收集物纯度时的最大进样量； 超载：进样量超过柱容量。柱效迅速下降，峰变宽。 超载可提高制备效率，以柱效下降一半或容量因子k降低10%为宜。,2. 液相制备色谱的方法收集组分时，通常有以下情况：（1）可获得良好分离，主峰 使用制备柱，超载提高效率（2）两主成分之间的小组分；超载，分离切分使待分离组分成为主成分（富集）后，再次分离制备3. 制备型液相色谱仪 结构与分析型一样，但泵流量大、进样量大、采用制备柱；柱后馏分收集器 制备柱：内径2050mm，柱长50cm,参考书,高效液相色谱方法及应用,于世林编著,化学工业出版社,2000离子色谱方法及应用,牟世芬、刘克纳编著,化学工业出版社,2000高效液相色谱法,邹汉法,张玉奎,卢佩章编著,科学出版社,1998,