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1、纳米药物载体入胞及转运 载体设计的机遇与挑战,Seminar II,学生：张德蒙,导师：,马小军 研究员,刘袖洞 教授,2012.12.13,主要内容,四 展望,一 背景介绍,二 纳米药物入胞,三 纳米药物胞内转运,一 背景介绍,1 纳米药物,尺寸：1-1000nm,组成：载体+药物,稳定性差,弥补裸药缺陷,靶向传递,穿透生理屏障,基因药物口服蛋白药物,环孢菌素A紫杉醇,难溶难渗,药物缓、控释,静脉给药,2 纳米药物传递系统,纳米药物传递系统：控制药物释放时间及位点,靶向传递,一 背景介绍,时间：载体稳定性及与载体与药物结合紧密程度,位点：载体胞外及胞内传递过程,缓控释,增强药效降低毒副作用,
2、入胞及胞内转运,穿透生理屏障,靶向传递的不同层次,弥补裸药缺陷,胞内释放,一 背景介绍,胞外传递,RES、血管、胞外基质,细胞传递,A.T. Florence, Journal of Controlled Release, 2012, 164, 115124,2 纳米药物传递系统,聚集、扩散、流体力学特性,细胞膜：内吞,胞内转运、释放,细胞内吞、转运机制研究不断完善，进步与争议并存,纳米药物内吞、转运研究滞后,二 纳米药物入胞,1 内吞机制,Ruth Duncan, Mol. Pharmaceutics 2012, 9, 23802402,清除细胞碎片、免疫监视细胞间/胞内细胞通讯、神经传递调
3、节细胞表面受体及转运蛋白密度重塑细胞外环境细胞信号转导master organizer,吞噬Cell eating,胞饮Cell drinking,纳米材料聚集体调理素作用后的纳米粒,1 内吞机制,(1) 吞噬,吞噬细胞(巨噬细胞、单核细胞、树突细胞)：血液清除纤维母细胞、内皮细胞,(200nm-m),细胞种类,作用对象,影响因素,细胞种类,纳米材料性质,Carreno-Gomez B., Duncan R., Int. J. Pharm. 1997, 148, 231240,Ruth Duncan, et al. Mol. Pharmaceutics 2012, 9, 23802402,Mi
4、litello, R. D. et al. Int. J. Pharm. 1997, 148, 231240,B16-F10吞噬壳聚糖微球,7.5m,纳米材料性质对胞吞的影响,尺寸与形状,表面性质,200nmm，非关键与接触状态有关，研究较少,1 内吞机制,(1) 吞噬,与调理素作用：亲疏水性、表面电荷,与细胞作用：表面电荷、亲疏水性,J.A. Champion, S. Mitragotri, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2006, 103, 49304934,Militello R. D., Colombo M. I., Curr. Mol. Med. 2011,
5、11, 197203,肺泡巨噬细胞与聚苯乙烯微球,电荷密度,调理素作用,疏水性,负电荷正电荷,表面带电材料胞吞效率高于中性；疏水亲水,网格蛋白介导内吞(CME),表面受体：LDLR、EGFR、TfR、 Lectins,配体修饰的纳米粒及病毒颗粒,非特异性的电荷、亲疏水性作用引发胞吞效率较受体依赖型低,1 内吞机制,(2) 胞饮,最基本胞吞方式研究最为透彻动力蛋白依赖,150nm,100nm,受体介导的CME,非受体介导的CME：液相胞吞,Ruth Duncan, et al. Mol. Pharmaceutics 2012, 9, 23802402,Herve Hillaireau, Patr
6、ick Couvreur. Cell. Mol. Life Sci. 2009, 66, 28732896,小窝蛋白排列瓶状膜结构，50-80nm膜区富含胆固醇和鞘磷脂上皮细胞含量最为丰富(10-20%)，平滑肌细胞、成纤维细胞含量同样丰富。CvME胞吞速度比CME慢得多配体介导：叶酸、白蛋白、胆固醇,巨胞饮,肌动蛋白驱动伸展的膜直接落回膜表面, 1m5m未发现配体-受体选择性参与纳米药物内化,小窝介导内吞(CvME),1 内吞机制,(2) 胞饮,Ruth Duncan, et al. Mol. Pharmaceutics 2012, 9, 23802402,Herve Hillaireau,
7、 Patrick Couvreur. Cell. Mol. Life Sci. 2009, 66, 28732896,纳米药物传递的影响研究仍处于很初级的阶段,其他内吞方式,1 内吞机制,(2) 胞饮,非网格蛋白/小窝蛋白依赖内吞方式,脂筏结构蛋白依赖的内吞,与小窝介导内吞机理类似，40-50nm,Clathrin-independent carrier/GPI-AP-enriched early endosomal compartment,Interleukin 2 receptor b pathway, or RhoA-dependent uptake,Ruth Duncan, et al
8、. Mol. Pharmaceutics 2012, 9, 23802402,Tore-Geir Iversen, et al. Nano Today , 2011, 6, 176185,肌动蛋白、微管蛋白,二 纳米药物入胞,2 内吞机制定量,M. Koivusalo, C. Welch, et al. J. Cell Biol. 2010, 188, 547563,L. Pelkmans, D. Puntener, et al. Science, 2002, 296, 535539,H.Y. Nam et al. Journal of Controlled Release 135 (2009
9、) 259267,判断纳米药物入胞的途径：胞吞抑制剂,内吞机制非独立,内吞转运有关的分子,包被蛋白、衔接子、分离蛋白，Rab GTP酶（60多种）,内吞转运依赖的细胞骨架,抑制剂非专一性,继续努力,二 纳米药物入胞,细胞方面,极性细胞：基底端与顶端胞吞机制不同,细胞种类：影响最大细胞状态：密度、细胞周期、代谢及胞外基质的变化,3 内吞过程影响因素,内吞相关物质种类繁多，信号转导通路复杂,Zauner W, Farrow NA, Haines AMR, J Control Release , 2001, 71,39-51,不同细胞、不同状态对不同粒径纳米粒胞吞结果,形状：研究处于初级阶段，影响因
10、素较多且难以区分,尺寸与形状,聚苯乙烯颗粒,胞饮 200nm 吞噬、巨胞饮,Stephanie E. A. Gratton, et al., Bioconjugate Chem., 2010, 21, 797-802,3 内吞过程影响因素,纳米载体方面,载体表面性质,与负电性细胞膜作用，荷正电粒子更易与细胞膜吸附并完成内吞电位1025mV，但并不绝对。,Harush-Frenkel O, Debotton N, Biochem Biophys Res Commun, 2007, 353, 26-32,Zhang LW, Monteiro-Riviere NA, Toxicological Sc
11、iences, 2009, 110, 138-155,E. Garcia-Garcia et al., CMLS, Cell. Mol. Life Sci. 2005, 62, 1400-1408,表面修饰PEG，增强胞吞 (受体作用，提高血液循环时间),3 内吞过程影响因素,表面电荷,亲疏水性：,靶向配基,Hee Dong Han, et al., Clin Cancer Res, 2010, 16, 3910-3922,小分子(叶酸)、蛋白(Tr)、CPP(RGD)靶向,配体密度不可控、肿瘤细胞异质性受体内化率低、受体表达下调,临床效果有限,3 内吞过程影响因素,纳米药物主动靶向,I.K.
12、 Kwon et al. Journal of Controlled Release , 2012, 164, 108114,D.B. Kirpotin, et al, Cancer Res, 2006, 66, 67326740,Cetuximab、trastuzumab、EC0489 、 EC0145 疗效改善源于EPR效应的被动靶向或局部给药,体外: 药物-细胞无障碍 药物高浓度 细胞受体表达稳定,体内：？,RES系统靶向：17%达到肝脏其他部位靶向：药物累积0.01%,HPMA copolymerdoxorubicingalactose 唾液酸糖蛋白受体,M. de Smet, et
13、al. J. Control.Release , 2011, 150102110,I.K. Kwon et al. Journal of Controlled Release , 2012, 164, 108114,RES(脾、肝、肺)捕获无动力，自由扩散血液中药物释放,主动靶向？,平面细胞与体内细胞受体表达差异？时间&密度受体饱和与循环时间差异？细胞外基质等细胞外环境变化？,3 内吞过程影响因素,纳米药物主动靶向,血液循环,PEG修饰：长循环？24h 仅剩10%,靶向修饰脂质体血液药物释放,细胞层紧密程度对药物扩散的影响,三 纳米药物胞内转运,转运过程由入胞方决定，胞吞物或经转运过程重新排出
14、胞外，或进入溶酶体消化降解,1 纳米药物胞内转运路径,Tore-Geir Iversen, et al. Nano Today , 2011, 6, 176185,P. Gonnord et al. Seminars in Cell & Developmental Biology , 2012, 23, 154-164,细胞器,特征,Marker,2 参与转运的主要细胞器,三 纳米药物胞内转运,Ruth Duncan, et al. Mol. Pharmaceutics 2012, 9, 23802402,P. Gonnord et al., Seminars in Cell & Develo
15、pmental Biology, 2012, 23, 154-164,三 纳米药物胞内转运,3 转运过程监测方法,Q. O. Garred, et al. Trafc 2, 2001, 2, 26-36,Stern ST, et al, Tox. Sci. 2008, 106, 140152,透射电镜,细胞器Marker荧光标记,形态学判断,细胞器位置及形态细胞间差异较大样品处理对形态的影响,分辨率限制：高分辨荧光成像技术内化标记物动态移动细胞器Marker非专一性,目标荧光与细胞器荧光融合,专一高效Marker验证,Au 溶菌酶,QD猪肾细胞,三 纳米药物胞内转运,4 转运过程的调控,了解纳
16、米药物转运机制，寻求实现最佳药效的的转运方式,内吞决定转运的例外,病原体(分支杆菌、沙门氏菌等) 扰乱转运,避免进入LYS降解降低免疫识别的可能性,内皮生长因子受体(EGFR)复合物泛素化,海参毒素、蓖麻毒素多途径内吞，转运过程相同,泛素化标记：降解通路去泛素化标记：循环通路,极性细胞入胞方式相同，转运路径不同,阐明转运过程变化机制，有助于纳米药物胞内定向传递,Sandvig, K., et al., FEBS Lett., 2010, 584, 26262634,分子量1000Da需通过内吞细胞穿透肽,4 转运过程的调控,纳米药物胞内定向传递,H响应载体、溶酶体酶降解载体,亲溶酶体传递：,细
17、胞质传递：,亲内体传递：,转胞吞作用,H6.5响应溶酶体融合前释放或阻断转运,极性细胞单向转运穿透血脑屏障等生理屏障,Ruth Duncan, et al. Mol. Pharmaceutics 2012, 9, 23802402,非生物降解性材料富集(PVP/PEG),产生空泡状态带电/生物响应聚合物或脂质体，可能引发溶酶体酶外泄量子点、稀土氧化物、富勒烯都被证明可导致细胞自噬铁氧化物材料外排机理研究最多,三 纳米药物胞内转运,5 纳米药物外排,膜转运过程连续统一，胞吞与外排紧密相连,胞内滞留时间影响药效,纳米药物本身对细胞正常代谢产生影响,外排速率与尺寸及降解性相关外排效率低于同条件内吞效
18、率,QD猪肾细胞,J.A. Fitzpatrick, et al., Nano Lett. , 2009, 9, 2736-2741,I. Oulie, J. Pharm. Biomed. Anal. 2002, 28, 323329.,纳米药物投入应用前首先明确其体内及胞内分布、代谢、外排过程,四 展望,药物载体设计标准化与个体化,不同药物需要作用位点位点不同，不同遗传背景病人敏感性不同，应根据药物及病人特点设计载体,药物靶向传递不可过度依赖体外实验，裸鼠模型缺陷,环境响应载体(pH、酶降解、氧化还原)，避免到达靶位前药物释放并实现细胞器靶向。,靶向纳米载体设计,PEG长循环修饰不可或缺,生物降解材料优先发展,谢谢！请各位专家批评指正！,
