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1、第 十 一 章,RNA的生物合成（转录）RNA Biosynthesis, Transcription,The Central Dogma,逆转录,复 制,转 录,翻 译,DNA,RNA,蛋白质,OVERVIEW,转录的概念；复制与转录的异同点；原核生物RNA聚合酶的组成结构特点；真核生物RNA聚合酶的种类及特点；原核生物及真核生物的启动子结构及特点；转录的基本过程；真核生物转录后的修饰.,复制和转录的相同点,均以DNA为模板均需要依赖DNA的聚合酶均以含三个磷酸的核苷酸为原料均是酶促的核苷酸聚合过程，多核苷酸为产物均遵从碱基配对规律,A-U；G-C,复制和转录的区别,参与转录的物质,原料:
2、NTP (ATP, UTP, GTP, CTP) 模板: DNA酶: 依赖DNA的RNA聚合酶(RNA polymerase)其他蛋白质因子,转录 (transcription) 生物体以DNA为模板合成RNA的过程 。,转录,DNA,模板和酶Templates and Enzymes,第一节,一、转录模板,DNA分子上转录出RNA的区段。 DNA双链中按碱基配对规律能指引转录生成RNA的一股单链，称为模板链(template strand)，也称作有意义链或Watson链。相对的另一股单链是编码链(coding strand)，也称为反义链或Crick链。,5GCAGTACATGTC 3,3
3、 c g t g a t g t a c a g 5,5GCAGUACAUGUC 3,NAla Val His Val C,编码链,模板链,mRNA,蛋白质,转录,翻译,53,35,模板链,编码链,编码链,模板链,结构基因,不对称转录(asymmetric transcription),在DNA分子双链上某一区段，一股链用作 模板指引转录，另一股链不转录 ；模板链并非永远在同一条单链上。,核心酶 (core enzyme),全酶 (holoenzyme),二、RNA聚合酶,原核生物的RNA聚合酶 RNA pol in PROK,各亚基的功能,RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合,2 真核生物的R
4、NA聚合酶,三、模板上酶的辨认、结合,原核生物一个转录区段可视为一个转录单位，称为操纵子(operon)，包括若干个结构基因及其上游(upstream)的调控序列。,RNA聚合酶结合模板DNA的部位，称为启动子(promoter)。,RNA聚合酶保护法,目 录,开始转录,T T G A C AA A C T G T,-35 区,(Pribnow box),T A T A A T Pu A T A T T A Py,-10 区,原核生物启动子保守序列,RNA-pol辨认位点(recognition site), 某一基因只以一条单链DNA 为模板进行转录（不对称转录）, 从启动子（promote
5、r）到终止子（terminator）称为 转录单位 （transcriptional unit）, 转录原点记为+1，其上游记为负值，下游记为正值,都含有两个保守的“一致序列”（consensus sequences）：,1 原核生物启动子(Promoter)的碱基组成,(1)TATAAT,是Pribnow和Schaller在1975年发现的。位于转录起点上游10nt。又称为-10 region或Pribnow box。,特点：AT丰富，易于解链。功能:与RNA polymerase紧密结合；形成开放启动复合体；使RNA polymerase定向转录。,(2)TTGACA,位于转录起点上游35
6、nt。又称为-35 region或Sextama box。与-10 region相隔16-19bp功能： RNA polymerase的亚基的识别位点；,转录开始的第一个碱基（+1）。原核生物中常为A或G，而且位置固定。,（1）TATA box（Goldberg-Hogness box）,作用：,选择正确的转录起始位点；影响转录效率（容易解旋）。,T85A97T93A85A63A83A50,2 真核生物启动子结构,（2） 上游元件（UPE）,包括CAAT box、GC box等。,能与转录因子CTF结合，控制起始活性。,GC box,一般位于-90bp左右。,被转录因子SP1识别，控制转录效率
7、。,CAAT box一般位于-75bp左右。,（3）远端控制区,常见的是增强子（enhancer）。,1981年Benerji、Rusconi小组和Chambom等发现的。又称为远端上游序列（far upstream sequence）。,作用特点a. 具有远距离效应（一般位于上游-200bp）b. 无方向性和位置性；c. 顺式调节（调节同一条DNA上的靶基因）；d. 无物种和基因特异性（但有组织特异性）。,结构基因,-GCGC-CAAT-TATA,真核生物启动子保守序列,转录过程The Process of Transcription,第二节,（一）转录起始,转录起始需解决两个问题：RNA聚
8、合酶必须准确地结合在转录模板的起始区域。DNA双链解开，使其中的一条链作为转录的模板。,一、原核生物的转录过程,（1）模板结合（template binding）：核心酶在因子的参与下与DNA形成非专一的、不稳定的复合物。,（2）起始识别：全酶与模板的启动子结合，形成封闭的酶-启动子二元复合物（closed binary complex）,核心酶,DNA,RNA pol全酶覆盖-55+20bp,转录起始过程,（4）酶移动到转录起点上，第一个NTP转录，因子释放，形成酶-启动子-NTP三元复合物（ternary complex）。,（3）全酶紧密结合在启动子的-10 region处，形成DNA局
9、部变形的启动子二元复合物（open binary complex）,-10bp序列熔解。,RNA pol覆盖-33 +20bp,在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应，形成转录起始复合物,5-pppG -OH + NTP 5-pppGpN - OH 3 + ppi,转录空泡(transcription bubble)：,RNA-pol （核心酶） DNA RNA,目 录,目 录,5,3,DNA,原核生物转录过程中的羽毛状现象,核糖体,RNA,RNA聚合酶,转录过程的电镜照片,依赖Rho ()因子的转录终止(弱终子)非依赖Rho因子的转录终止(强终子),（三）转录终止(termination),
10、指RNA聚合酶在DNA模板上停顿下来不再前进，转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来。原核生物DNA转录的终止处有特殊的序列和结构，称为终止子（terminator，T）,分类,需要蛋白因子（rho factor）的帮助，才能终止转录。又称为依赖型终止子（Rho-dependent terminator）。,（1）因子的性质,依赖RNA的ATPase活性，和解旋酶活性。,表明是与RNA结合。,（2）依赖型终止有两种类型,1. 依赖 Rho因子的转录终止, 依赖型终止序列,也形成茎环结构，但G-C含量少，易打开。3端没有寡聚A。,位于终止点上游，富含C，但缺乏G。,ACCUCAUAUCCGCAC
11、CUCCUCAAACGCUACCUCGACCA, 因子直接识别序列：,此区域缺失，将导致转录通读。,（3）终止方式,因子以6聚体形式结合在RNA上，沿着RNA合成的方向移动。,当RNA pol遇到不太稳定的终止序列茎环结构处，转录减慢。,因子追上RNA pol，（通过直接或间接作用）导致RNA-DNA分离。,2. 不依赖 Rho因子的转录终止,DNA模板上靠近终止处，有些特殊的碱基序列，转录出RNA后，RNA产物形成特殊的结构来终止转录。,1. 有回文序列,转录出的RNA可形成茎环结构（stem-loop structure），使转录物与模板之间配对的碱基数降低，整体上减弱了RNA 与DNA的
12、互作。,2. 茎的区域富含G-C,茎环不易解开。,3. 强终止子的3端约有6个A,由于茎环3段紧接一串A/U的配对，稳定性比较差，有利于转录物脱落而不利于转录延续。,强终止子的结构特点,5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU. 3,5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU. 3,RNA,5TTGCAGCCTGACAAATCAGGCTGATGGCTGGTGACTTTTTAGTCACCAGCCTTTTT. 3,DNA,5UUGCAGCCUGACAAA
13、UCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU. 3,茎环(stem-loop)/发夹(hairpin)结构,茎环结构使转录终止的机理,使RNA聚合酶变构，转录停顿； 使转录复合物趋于解离，RNA产物释放。,二、真核生物的转录过程,真核生物的转录过程与原核生物相似，但有几处不同：,真核生物有3种RNA polymerase（原核生物只有一种）；,真核生物有3种不同的启动子以及相关元件；,真核生物的转录有很多蛋白介入；,真核生物的转录物一般还需要加工（RNA processing）。,转录起始点,TATA盒,CAAT盒,GC盒,增强子,顺式作用元件(cis-a
14、cting element),1. 转录起始前的上游区段,AATAAA,切离加尾,转录终止点,修饰点,外显子,翻译起始点,内含子,OCT-1,OCT-1：ATTTGCAT八聚体,2. 转录因子,能直接、间接辨认和结合转录上游区段DNA的蛋白质，现已发现数百种，统称为反式作用因子(trans-acting factors)。,反式作用因子中，直接或间接结合RNA聚合酶的，则称为转录因子(transcriptional factors, TF)。,参与RNA-pol转录的TF,3. 转录起始前复合物(pre-initiation complex, PIC),真核生物RNA-pol不与DNA分子直接
15、结合，而需依靠众多的转录因子。,TFF,A,B,由RNA-Pol 催化转录的PIC,H,E,TBP,TAF,TFD-A-B-DNA复合物,TATA,A,B,TBP,TAF,TATA,H,E,PIC组装完成，TFH使CTD磷酸化,（二）转录延长,真核生物转录延长过程与原核生物大致相似，但因有核膜相隔，没有转录与翻译同步的现象。,RNA-pol前移处处都遇上核小体。,转录延长过程中可以观察到核小体移位和解聚现象。,RNA-Pol,RNA-Pol,RNA-Pol,核小体,转录延长中的核小体移位,转录方向,5-AAUAAA-,5 -AAUAAA-,核酸酶,-GUGUGUG,RNA-pol,AATAAA
16、 GTGTGTG,转录终止的修饰点(加尾识别序列),5,5,3,3,3加尾,AAAAAAA 3 mRNA,（三）转录终止transcription termination,基因的3端有终止信号；有涉及poly A加尾信号（AATAAA）；,真核生物的转录后修饰Post-transcriptional Modification,第三节,一、真核生物mRNA的转录后加工,1. 首、尾的修饰,5端形成 帽子结构(m7GpppGp ) 3端加上多聚腺苷酸尾巴(poly A tail),帽子结构capping structure,5 pppGp,帽子结构的生成,帽子的作用1. 免受核酸酶的分解2. 翻译
17、时易被识别,2. mRNA的剪接,1. hnRNA 和 snRNA,核内的初级mRNA称为杂化核RNA (hetero-nuclear RNA, hnRNA)snRNA (small nuclear RNA),剪切的目的: 去内元(intron),真核生物结构基因，由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质，这些基因称为断裂基因。,断裂基因(splite gene),编码区 A、B、C、D,外显子(exon)和内含子(intron),外显子在断裂基因及其初级转录产物上出现，并表达为成熟RNA的核酸序列。内含子隔断基因的线性表达
18、而在剪接过程中被除去的核酸序列。,鸡卵清蛋白基因,hnRNA,首、尾修饰,hnRNA剪接,成熟的mRNA,鸡卵清蛋白基因及其转录、转录后修饰,目 录,鸡卵清蛋白成熟mRNA与DNA杂交电镜图,DNA,mRNA,目 录,外显子真的都显吗?否。1. tRNA、rRNA基因理所当然不显；2. 一般基因前后两个外元不编码或部分编码氨基酸；锥虫反式拼接上去的外元就不编码任何氨基酸；3. 人干扰素基因没有内元；内元是真核生物的真质标记（Hall Marker）吗？否。原核生物T4噬菌体的1018个碱基就有内元。,内含子真的含而不露?否。酵母细胞色素氧化酶基因反式拼接的反式作用因子就是其内元的产物,内含子的
19、分类,根据基因的类型和剪接的方式，通常把内含子分为4类。,I：主要存在于线粒体、叶绿体及某些低等真核生物的 rRNA基因；II：也发现于线粒体、叶绿体，转录产物是mRNA； III：是常见的形成套索(lasso)结构后剪接，大多数mRNA基因有此类内含子； IV：是tRNA基因及其初级转录产物中的内含子，剪接过程需酶及ATP。,mRNA的剪接, 除去hnRNA中的内含子，将外显子连接。,snRNP与hnRNA结合成为并接体,目 录,pG-OH(ppG-OH, pppG-OH),剪接过程的二次转酯反应 (twice transesterification), RNA编辑作用说明，基因的编码序列经
20、过转录后加工，是可有多用途分化的，因此也称为分化加工(differential RNA processing)。,mRNA的编辑(mRNA editing),3、tRNA的转录后加工,tRNA前体,目 录,目 录,tRNA核苷酸转移酶、连接酶,ATP,ADP,目 录,碱基修饰,目 录,4、rRNA的转录后加工,四、核 酶,具有酶促活性的RNA称为核酶。,核酶(ribozyme),四膜虫rRNA内含子的二级结构,四膜虫rRNA的剪接采用自我剪接方式,5-端核苷酸序列,四膜虫RNA的自我剪接,最简单的核酶二级结构槌头状结构(hammerhead structure),底物部分,通常为60个核苷酸左
21、右同一分子上包括有催化部份和底物部份 催化部份和底物部份组成锤头结构,除rRNA外，tRNA、mRNA的加工也可采用自我剪接方式。,核酶研究的意义,核酶的发现，对中心法则作了重要补充；核酶的发现是对传统酶学的挑战；利用核酶的结构设计合成人工核酶 。,人工设计的核酶,粗线表示合成的核酸分子细线表示天然的核酸分子X 表示一致性序列箭头表示切断点,目 录,1.何谓转录(transcription),何为转录单元(transcription Unit).2.转录与复制的异同点.3.原核生物及真核生物启动子的特点.4.不依因子的终止子(-dependent terinator)的结构特点.5.何谓顺式作用元件(cis-acting elements),何为反式作用因子(trans-acting factor),并分别举例说明.6.真核生物转录后修饰有几种方式?7.什么是基因,什么是断裂基因（splitting gene）?断裂基因是真核生物的真质标记(hall marker)吗?8.何为核酶(ribozyme)?,思考题,9. 何为cDNA？它在体内是如何产生的？,
