食品微生物实验ppt课件.ppt

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1、食品微生物实验,实验一 培养基的配制、分装和灭菌,目录,实验目的,实验原理,实验器材,实验方法,思考题,注意事项,实验结果,实验目的,了解配制微生物培养基的原理和培养基的种类； 掌握配制培养基的一般方法和操作步骤； 懂得高压蒸汽灭菌的基本原理及使用注意事项；了解几种常用灭菌方法。,实验原理,培养基是按照微生物生长繁殖或积累代谢产物所需的各种营养物质，用人工方法配制而成的一种基质。它包括碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐和水六类营养要素。,根据据组成成分可分为:1. 合成培养基：由各种纯化学物质按一定比例配制而成。 2. 半合成培养基：有一部分纯化学物质和另一部分天然物质配制而成。3. 天然培养

2、基：利用天然来源的有机物配制而成。根据用途可分为:1. 基础培养基：能满足各种微生物的营养需求2. 加富培养基：加入某种微生物生长繁殖所需的营养物质，使其快速生长，便于分离3. 选择培养基：加入某种物质抑制其他微生物生长，使目标微生物得到富集，便于分离4. 鉴别培养基：用来检测微生物的某些代谢特性。,从培养基的物理状态可分为: 1. 液体培养基：不加凝固剂的液体状态培养基。 2. 固体培养基：在液体培养基中加入2%左右的凝固剂的固体状态的培养基或农副产品培养基。 3. 半固体培养基：在液体培养基中加入0.20.5%凝固剂而成的半固体状培养基。,实验原理,灭菌:是指应用物理或化学的方法，杀灭物体

3、表面和内部一切微生物营养体、芽孢和孢子。灭菌方法很多，可分为加热、过滤、照射和化学药品法等。,消毒：使用理化因素方法杀死物体表面绝大多数微生物的方法。,常用的灭菌法1、干热灭菌： 用火焰烧灼或电热干燥箱内高温热空气灭菌 适合于培养皿，试管，吸管等的灭菌。160-170，保持2h。2、湿热灭菌加压蒸汽灭菌法其步骤如下：1）灭菌器内加入一定量的水，将包扎好的物品放入其中。2）接通电源，进行加热3）排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待排出大气后关闭排气阀；或关闭排气阀，待压力上升到0.5kg/cm2时再打开排气阀，待压力回复到0时再关闭排气阀。4）当压力达1.05kg/cm2时，此时灭菌器内的温

4、度为121 ，维持30min。对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物时，应适当降低压力，延长时间。5）灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时，才能打开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品。,间歇灭菌法： 待灭菌的物品放在灭菌器或蒸笼里，每天蒸煮1次，每次煮沸1h，连续3d重复进行。在每两次蒸煮之间，将物品（指培养基）放在370C恒温条件下培养过夜，这样可以使每次蒸煮后未杀死残留的芽孢萌发成营养体，以便下次蒸煮时杀灭。过滤除菌法： 不能用加热灭菌的液体物质（如维生素、血清），一般可用细菌过滤器进行除菌。,紫外线灭菌法： 一般30W灯管，9m3空间，距地面2m每次打开紫外线照射0.5h，就使室内

5、空气灭菌。若照射紫外线时先喷洒石炭酸等化学消毒剂，可增强灭菌效果。紫外线虽有较强的杀菌力，但穿透力弱，即使一薄层玻璃或水层就能将大部分紫外线滤除，因此只适用于空气及表面杀菌。化学药剂消毒灭菌： 微生物实验室中常用的化学杀菌剂有升汞、甲醛、高锰酸钾、酒精、碘酒、龙胆紫、石炭酸、漂白粉、新洁尔灭、煤酚皂溶液，它们有的是杀菌剂，有的是抑菌剂。,1. 药品和试剂 牛肉膏、蛋白胨、NaCl、10 NaOH 溶液、10盐酸溶液。 2. 器材 天平、药匙、瓷缸、玻璃棒、电炉、 PH试纸、试管、三角瓶、分装漏斗、牛皮纸、棉花、线绳、干燥箱、高压锅。,实验器材,培养基的配制分离培养微生物常用器皿的准备培养基和玻

6、璃器材的灭菌,实验步骤,培养基的制备过程配方及配量-称取药品-加热溶解-调节pH -过滤-分装-加棉塞-包扎-灭菌-搁斜面-贮存,实验方法,1. 称量 按照培养基配方与配量分别称取各药品。取少量的水于烧杯中，将各培养基成分（琼脂除外）逐一加入水中待溶。,2. 溶解 在烧杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解。3. 调节pH值 用玻璃棒沾少许液体，测量pH值。用1mol/L氢氧化钠和1mol/L盐酸调节pH。4. 加琼脂溶化： 加热过程中要不断搅拌，可适当补水。,实验方法,5. 分装： 根据不同的需要，可将制好的培养基分装入试管内（用分装漏斗）或三角瓶内，管（瓶）口塞上棉塞。最后用牛皮纸将棉塞部分

7、包好。6. 包扎成捆，挂上标签（必须用铅笔写），注明何种培养基。7. 灭菌：高压蒸汽灭菌，121，20min8. 搁斜面：9. 贮存:培养基灭菌后必须在37 下恒温培养24h，确定无菌生长，方可使用。,实验方法,实验方法,注：灭菌后的培养基冷却至50-60后搁置斜面。 斜面的长度不超过试管总长的一半。,实验方法,实验方法,1、牛肉膏蛋白胨固体培养基2、察氏培养基（培养霉菌用）3、马铃薯葡萄糖琼脂培养基4、高氏1号培养基（培养各种放线菌用）,称取药品时严防药品混杂，一把牛角匙称一种药品； 蛋白胨极易吸湿，称取动作要迅速； 配制固体培养基时，先将其他药品加热溶解到快沸时， 再将称好的琼脂加入，继续

8、加热至琼脂完全熔化，要求 不断搅拌，以免糊底，并防止沸腾外溢； 分装量根据试管大小和实际需要而定，固体培养基装量 约为管高的1/5，液体培养基约为管高的1/4，三角瓶不 超过瓶体的1/2 ； 分装时不要将培养基沾在管（瓶）口上，以免引起污染。,注意事项,1. 思考牛肉膏蛋白胨培养基属于何种培养基？2. 为什么湿热灭菌比干热灭菌法更有效？,思考题,实验二 环境微生物的监测和菌落识别,1. 掌握各种微生物接种的基本操作技术；2. 初步了解周围环境中微生物的分布状况；3. 熟悉四大类微生物菌落的形态特征。,实验目的,在我们周围环境中存在着种类繁多、数量庞大的微生物，他们很小，人们用肉眼看不到，将他们

9、在适宜的温度下培养一段时间，可繁殖成一个个肉眼可见的细胞群体，此即为菌落。 接种是指在无菌操作条件下，将某种微生物的纯种移接到适合其生长繁殖的新鲜培养基中或生物体内的一种操作过程。实验室常用的接种方法有斜面接种、穿刺接种、三点接种和液体接种。,实验原理,实验器材,菌种 实验室环境微生物、大肠杆菌、酿酒酵母、放线菌及霉菌。2. 培养基 马铃薯固体培养基、牛肉膏蛋白胨固体培养基、高氏一号固体培养基3. 器皿 无菌培养皿、无菌棉签、火柴、超净工作台及恒温培养箱。,实验方法,1、融化培养基,1）沸水浴融化法：取装有无菌营养琼脂培养基的三角瓶一个，放在沸水浴中煮沸维持，待琼脂彻底融化（从水浴中取出，在不

10、摇动下对着透视光观察为均质无块状液态）后取出，室温下放置待冷却至50-60（以手握不觉得十分烫手）时倒平板。2）微波炉融化法：采用微波炉加热融化琼脂培养基，应根据加热功率大小及待融化培养基的量来决定所需时间。否则将导致水分蒸发过多、培养基剧烈沸腾使三角瓶口棉塞冲脱而溢出培养基或引起棉花塞燃烧等事故。3）压力锅融化法：当需融化的培养基量较多时，用压力锅融化较快速。方法是将待融化琼脂培养基放入锅内，采用100-105的锅压维持5-10min即可。4）冷却需注意：融化的琼脂培养基一般采用室温冷却，但在室温较低时切莫用冷水直冲瓶壁某处（会首先导致琼脂凝块现象）。若将融化的培养基直接放在冰凉而热传导很快

11、的瓷砖或不锈钢桌面上，也可因瓶底过冷而产生凝结现象。,实验方法,倒无菌平板：,1）持皿法倒无菌平板：培养基的倒入量为12-15ml。2）叠皿法倒无菌平板,冷凝方法：,一种是将平板一个个摊平在桌面上让其迅速冷凝，另一种方法是将几个平板叠放成一叠让其缓慢冷凝。前者冷凝较快，在室温较高时常采用。但缺点是有时在皿盖或凝结的培养基表面有冷凝水产生。而后者冷凝速度较慢，常在室温较低时应用，其优点是在缓慢冷凝中平板表面及盖内侧很少有冷凝水微滴形成。,实验方法,1. 斜面接种,2. 液体接种 由斜面菌接种到液体培养基（如试管或三角瓶等）中的方法。 将接种环送入液体培养基中时使环在液体与管壁接、触的地方轻轻磨擦

12、，使菌体分散，然后塞上棉塞，再轻轻摇动均匀，即可培养。如果菌种是培养在液体培养基中时，一般用移液管或滴管接种。,实验方法,3.穿刺接种 用接种针挑取菌种后，插入固体培养基内（不要刺到底部），再沿原路拔出，此法用于厌气性细菌接种、检查细菌的运动能力。 4.平板接种 将菌种接至培养皿的方法，平板接种的目的是观察菌落形态、分离纯化菌种，活菌计数以及在平板上进行各种试验时采用的一种接种方法，可分为下面几种：,实验方法,1) 斜面接平板 a. 划线法：见平板划线分离法。 b. 点种法：常用于观察霉菌和酵母细胞，轻点在平板的表面（根霉点一点，曲霉、酵母可点3-4点）。 2) 平板接斜面：一般是将经平板分散

13、培养得到的单菌落接种到斜面，以便作鉴定或扩大培养、保存之用。,实验方法,平板划线,实验方法,挑孢子： 将灭过菌的接种针在菌种管斜面上端冷却并湿润后，再用针尖挑少量孢子。当移出接种针前，须将针柄在管口轻轻碰几下，以抖落未粘牢的孢子。然后移出接种针，塞上棉塞，将菌种管插回试管。 点接： 左手将预先倒置在煤气灯旁的含培养基的皿底取出（皿底朝上，仍放在煤气灯旁），随之将培养基一面朝向火焰，并使皿底垂直于桌面，将沾有孢子的接种针尖垂直地点接于标记处，然后将皿底轻轻地放入皿盖中。最后将带菌的接种针烧红，以杀灭残留的孢子。,三点接种,实验方法,实验方法,环境微生物的检测,1） 空气 做实验室空气中微生物的检

14、测时，只要打开无菌平板的皿盖，让其在空气中暴露一段时间（5-10min），即让空气中含微生物的尘埃或微粒以沉降法自然接种到平板培养基的表面，然后将皿盖盖上即可。2） 桌面 在做实验桌面的微生物检测时，可用一枚无菌棉签，先在手持无菌平板的半侧润湿后划数条“Z”型的接种线，以此作为无菌棉签试验的无菌对照区域。然后仍用此棉签去擦抹桌面，再在平板的另半侧的表面作同样的划线接种。上述操作均应以无菌操作法进行，即在火焰旁的无菌操作区域内完成。,3）头发 移去无菌平板的皿盖，使自己的头发部位保持在平板培养基的上方，然后以手指拨动头发数次，再盖上皿盖，就可以粗略测知头发中所含带菌尘埃的多少及其含菌的种类等。4

15、）手指 可用未经清洗的手指先在无菌的平板培养基的左半侧作划线接种，并在皿底做好标记。然后用肥皂洗手，待手指冲洗干净后再在平板培养基的另半侧作同样的划线接种，然后盖好皿盖。待培养后比较平板两侧所形成的菌落或菌苔的差异来判断手指的含菌量。,实验方法,5）口腔 打开无菌平板培养基的皿盖，使口对着平板培养基的表面，以咳嗽或刺激鼻腔打喷嚏方式接种；也可用长的无菌棉签从口腔或咽喉等处取菌样，然后在平板表面作划线分离，再盖上皿盖，经培养后观察平板上的菌落或菌苔。培养 将以上各种检测平板倒置于28温箱中培养，至下周实验时观察并计数各平板上的菌落数。若有时间，可从24h起观察数次，以了解各种平板及不同类型菌落出

16、现的顺序及菌落大小、外形和颜色等的变化。,实验方法,实验结果,放线菌,酵母,细菌,霉菌,用于倒平板的培养基一定要彻底溶化，否则会在所倒的平板培养基表面出现未融化的琼脂块。而且，倒平板时的培养基温度不能过高（50-60为宜），否则会在皿盖内侧形成较多的冷凝水或在凝固的平板表面形成许多冷凝水微滴，不利于单菌落的形成。 在无菌操作倒平板过程中，切忌用手抓、握三角瓶的瓶口处，以防灼热的瓶口端烫伤手指，同时，手指上的微生物也会污染瓶的口端，造成严重的操作污染等。,注意事项,思考题,实验三 微生物的纯种分离法,1. 了解平板划线法分离菌种的基本原理及操作；,实验目的,平板划线法是指把杂菌样品通过在平板表面

17、划线稀释而获得单菌落的方法。一般是将混杂在一起的不同种微生物或同种微生物群体中的不同细胞，通过在分区的平板表面上作多次划线稀释，形成较多的独立分布的单个细胞，经培养而繁殖成相互独立的多个单菌落。通常认为这种单菌落就是某微生物的“纯种”。,实验目的,样品 混合菌液2. 培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基3. 其它 盛9ml无菌水的试管、盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角瓶、无菌玻璃涂棒、无菌吸管、接种环、无菌培养皿。,实验器材,实验方法,1、融化培养基 2、倒平板,在皿底用记号笔分成4个不同面积的区域，使AB C D,且各区的夹角应为120,3、作分区标记,4、划线操作,1）挑取菌样：选用平整、圆滑

18、的接种环，按无菌操作法挑取少量含菌试样。2）先划A区：3）划其余区,5、恒温培养,将划线后的平板至28倒置培养2-3d。,6、挑单菌落,良好的结果应在C区出现部分单菌落，而在D区出现较多独立分布的单菌落。然后从典型的单菌落中挑取少量菌体至试管斜面,经培养后即为初步分离的纯种。,用于划线的接种环，环柄宜长些（约10cm），环口应十分圆滑，划线时环口与平板间的夹角宜小些，动作要轻巧，以防划破平板。用于平板划线的培养基，琼脂含量宜高些（2%左右），否则会因平板太软而被划破。平板不能倒得太薄，最好在使用前一天倒好。为防平板表面产生冷凝水，倒平板前培养基温度不能太高。,注意事项,1倒平板时，为什么要将融

19、化的琼脂培养基冷却到 4550左右才能倾入装有菌液的培养皿内？2划线分离时，为什么每次都要将接种环上多余的菌体烧掉？3培养时为什么要将培养皿倒置培养？,思考题,实验四 细菌的革兰氏染色法和光学显微镜的使用,1. 了解普通光学显微镜的构造和原理；2. 正确掌握使用显微镜的方法；3. 了解革兰氏染色的原理和操作方法。,实验目的,实验原理,普通光学显微镜的构造（1）机械装置（2）光学系统,普通光学显微镜的工作原理,实验原理,显微镜的优劣主要取决于分辨率的大小。所谓分辨率就是显微镜工作时能分辨出两点间最小距离（D）的能力。D值愈小表明分辨率愈高。D值可用下列公式表示：,d物镜的分辨距离，单位 nm 照

20、明光线波长，单位 nm NA 物镜的数值孔径 n 物镜与标本间介质的折射率 镜口角（通过标本的光线延伸到物镜前透镜边缘所形成的夹角）,实验原理,物镜上标有放大倍数、数值孔径、工作距离及要求盖玻片的厚度等主要参数,实验方法,用油镜观察细菌,1）放置标本：将染色的细菌涂片（涂片朝上）置于镜台上2）找合适的视野：先用低倍镜寻找合适的视野，并将欲观察的部位移到视野中央。3）转换油镜：将油镜转到工作位置。4）调节聚光器与油镜数值孔径相一致：只要将聚光器上升到最高位置，可变光阑开到最大，此时两者的数值孔径即达到一致。5）加香柏油：从双层瓶的内层小管中取香柏油1-2滴加到欲观察的部位涂片上(切勿加多)，然后

21、将油镜转到工作位置，下降镜筒，使油镜浸入香柏油中，并从侧面观察，使镜头降至既非常接近玻片，又不与玻片相撞的合适位置。6）调焦：左眼从目镜中观察，同时转动粗调节螺旋，缓慢地提升油镜，至出现模糊的物像时，再用细调节螺旋调节至物像清晰为止。7）观察：仔细观察细菌形态并将结果填入记录表中。,普通光学显微镜的保养,实验原理,1）观察完后，移去观察的载玻片标本2）用过油浸镜的，应先用擦镜纸将镜头上的油擦去，再用擦镜纸蘸着二甲苯擦拭 2-3次，最后再用擦镜纸将二甲苯擦去。3）转动物镜转换器，放在低倍镜的位置。4）将镜身下降到最低位置，调节好镜台上标本移动器的位置，罩上防尘罩。,二. 革兰氏染色原理 G-菌的

22、细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经复红复染后就成红色。 G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。,实验原理,1. 菌种 培养24小时的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌。2. 染色液和试剂 结晶紫、碘液、95%酒精、石炭酸复红 、蒸馏水、香柏油。3. 器材 载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微 镜。,实验器材,1.革兰氏染色（1）涂片,实验方法,（2）晾干,实验方法,（3）固定

23、,实验方法,（4）结晶紫染色： 加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色1min；水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。,crystal violet stain wash with water 结晶紫染色 水洗,实验方法,（5）媒染： 碘液，媒染1min；水洗：用水洗去碘液。（6）脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色 1520s至流出液无色，立即水洗。（7）复染：滴加复红复染1min；水洗：用水洗去涂 片上的复红染色液。,碘液复染,95%酒精脱色,沙黄复染,实验方法,（8）晾干：将染好的涂片用吸水纸吸干。（9）镜检： 1）用低倍镜对光。最大光圈 2）低倍镜观察（寻找观察目标）。适当缩小光圈

24、 3）高倍镜观察（选取理想的观察目标）。 4）油镜观察：高倍镜观察后- 上升镜筒-油镜转至正下方，在载玻片上加一小滴油-小心地下降镜筒使镜头浸在油里-用粗螺旋将镜筒慢上升，寻找目标（物象）用细螺旋调节，使物象清晰-观察记录。最大光圈,实验方法,革兰氏阴性杆菌,革兰氏阳性球菌,实验结果,实验原理,三、细菌的芽孢染色,细菌的芽孢具有厚而致密的壁，透性低，不易着色，若用一般染色法只能使菌体着色而一旦着色后又难以脱色这一特点而设计的。 芽孢染色法就是根据芽孢既难以染色而一旦着色后又难以脱色这一特点而设计的。 芽孢染色法除了用着色力强的燃料外，还需要加热，以促使芽孢着色，再使菌体脱色，而芽孢上的染料则难

25、以渗出，故仍保留原有的颜色，然后用对比度强的染料对菌体进行复染，使菌体和芽孢呈现处不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽孢，便于观察。,菌种： 培养24小时的枯草芽孢杆菌菌种斜面试剂： 孔雀石绿，番红复染液，香柏油仪器及器材： 显微镜，酒精灯，试管夹，载玻片，镊子，吸瓶，吸水纸，擦镜纸,实验器材,实验方法,实验方法,1）制备菌液： 加1-2滴自来水于小试管中，用接种环从斜面上挑取2-3环的菌苔于试管中并充分打匀，制成浓稠的菌液。2）加染色液：加5%孔雀绿染色液2-3滴于小试管中，用接种环搅拌使染色液与菌液充分混合。3）加热：将此试管浸于沸水浴（烧杯）中，加热15-20min。4）涂片：用接种环从试

26、管底部挑数环菌液于洁净的玻片上，并涂成薄膜。5）固定：将玻片通过微火3次。6）脱色：用水洗，直至流出的水中无孔雀绿颜色为止。7）复染：加沙黄染色液，染2-3min后，倾去染色液，不用水洗，直接用吸水纸吸干。8）镜检：用油镜观察。结果：芽孢为绿色，菌体为红色。,枯草芽孢杆菌培养16小时的芽孢染色图片,实验结果,实验结果,枯草芽孢杆菌培养48小时的芽孢染色图片,注意事项,搬动显微镜时应一手握住镜壁，另一手托住镜座，镜身保持直立，并紧靠身体，步态健稳。切忌单手拎提。各个镜面切忌用手涂抹，以免手上的油，汗沾于镜面，否则日后易发霉、腐蚀。用二甲苯擦镜头时，用量要少，不宜久抹，以防胶粘透镜的树脂被溶解。切

27、勿用乙醇擦镜头和支架。玻片要洁净无油，否则菌液涂不开。挑菌宜少，涂片宜薄，过厚则不易观察。用改良法时，欲得到好的涂片，首先要制备浓稠的菌液，其次从小试管中挑取被染色的菌液时，应先用接种环充分搅拌，然后再挑取菌液，否则菌体沉于管底，涂片时菌体太少。,1. 要使视野明亮，除调节光源外，还可采取哪些措施？2. 使用油镜应注意哪些问题？3. 革兰氏染色中哪一步是关键，为什么？你如何控制这一步？4. 不经复染这一步，能否区别革兰氏阳性菌和阴性菌？5. 在芽孢染色涂片上为什么有时会出现大量游离的芽孢？6. 芽孢染色的原理是什么？用一般染色法是否能观察到芽孢？,思考题,实验四 微生物的间接计数法水中细菌总数

28、的测定,1. 了解利用平板菌落计数法测定微生物样品中活细胞的原理。2. 熟练掌握平板菌落计数的操作步骤与方法。,实验目的,平板菌落计数法是一种应用广泛的测定微生物生长繁殖的方法，其特点是能测出微生物样品中的活细胞数，故又称活菌计数法。 本法的原理和操作要点是：先将待测定的微生物样品按比例地做一系列稀释，再吸取一定量某几个稀释度的菌悬液于无菌培养皿中（或凝固的无菌平板培养基的表面），再及时倒入融化且冷却至45左右的培养基，立即充分摇匀，水平静置待凝（或用涂布棒将平板表面的菌液及时涂布均匀）。经培养后，将各平板中计得的菌落数的平均值换算成单位容积的含菌量，在乘以样品的稀释倍数，即可测知原始菌样的单

29、位容积中所含的活细胞数。,实验原理,1. 牛肉膏蛋白胨培养基；2. 无菌空瓶；灭菌生理盐水；灭菌培养皿、吸管、 试管；3. 自来水、池水、河水或湖水。,实验器材,实验方法,1、融化培养基2、编号：取6-8支装有4、5ml的无菌生理盐水的试管，依次编号为10-1、10-2 、 10-3 、 10-6（视菌液浓度而定）；在取7套培养皿，依次编号为10-1、10-2 、 10-3 、 10-6，各稀释浓度做3个重复测定平板，留下一个平板作空白对照。,plate out 0.1 ml,试样稀释 (10倍稀释法),分别用1ml的无菌移液管精确吸取三个稀释度的菌液各0.2ml，加至相应编号的无菌培养皿中。

30、,实验方法,3、稀释菌液,4、转移菌液,10-4,10-5,10-6,实验方法,5、倒培养基,菌液移入培养皿后应立即倒上融化并冷却至50左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（倒入量12-15ml）。,6、摇匀平板,前后-左右 顺时针-逆时针,7、倒置培养,待平板完全凝固后，倒置于37 恒温箱中培养。,8、计菌落数,实验方法,培养48h后取出平板，选出菌落数在30-300个/皿范围内的各皿，计算每皿的菌落数，并将结果记录在下列表中。计数时，可用彩笔或钢笔在皿底点涂菌落法进行计数，以防漏计或重复。在高密度分布的菌落平板中，选取有代表性的区域后粗略统计菌落数。简单算术法 活菌数(个/ml)=X1+X2+X3

31、,9、清洗器皿,3,5,稀释倍数,注意事项,1. 各稀释度菌液移入无菌培养皿内时，要“对号入座”，切勿混淆。2. 每支移液管只能接触一个稀释度的菌液试管，每支移液管在移取菌液前，都必须在待移菌液中来回吹吸几次，使菌液充分混匀并让移液管内壁达到吸附平衡。3. 菌液加入培养皿后要尽快倒入融化并冷却至50左右的琼脂培养基液，立即摇匀，否则菌体细胞常会吸附在皿底上，不易形成均匀分布的单菌落，从而影响计数的准确性。,平板菌落计数的原理是什么？它适合于哪些微生物的计数？菌液样品移入培养皿后，若不尽快地倒入培养基并充分摇匀，将会出现什么结果？为什么？平板菌落计数法与显微镜直接计数法相比，各有何优缺点？,思考

32、题,实验六 放线菌和真菌的培养与形态观察,1. 学会用插片法培养放线菌的制片方法。2. 掌握用显微镜观察放线菌个体形态特征的方法。3. 掌握用显微镜观察霉菌的个体形态特征。,实验目的,在接种过放线菌的琼脂平板上，插上盖玻片或在平板上开槽接种后在搭上盖玻片，放线菌的菌丝体可沿着培养基与盖玻片的交界线蔓延生长，从而较容易地黏附在盖玻片上。 待培养物成熟后再轻轻地取出盖玻片，就能获得在自然状态下生长的直观标本。 将它置于载玻片上（让含培养物的面朝上）做显微镜检查，就可观察到放线菌在自然状态下着生的菌丝体的各种形态特征。,实验原理,1.菌种：放线菌、黑曲霉。2. 染色液：高氏1号琼脂培养基，PDA培养

33、基。3. 器材：培养皿，盖玻片，镊子，载玻片，接种环，擦镜纸，酒精灯，显微镜。,实验器材,观察放线菌的形态特征常用的方法： 插片法 搭片法 玻璃纸法 压片法,实验方法,插片法：1）倒平板：融化高氏1号培养基，冷却至50左右倒平板。平板宜厚些（利于插盖玻片，每皿倒入约20ml培养基）。冷凝待用。2）两种插片法：先划线接种后插片与先插片后划线接种。1. 先接种后插片：用接种环以无菌操作法从斜面菌种上挑取少量孢子，在平板培养基的一侧作来回划线接种。接种量可适当多些，然后以无菌操作法在接种线处插入无菌盖玻片（常以40-50角插入，深度约为盖玻片的1/3长度）即可。,实验方法,菌种划线,盖玻片,2. 先

34、插片后接种,实验方法,用无菌镊子取无菌盖玻片，在平板培养基的另一侧先插上无菌盖玻片，然后在交界线上接种（接种线长约为盖玻片的一半，即在盖玻片两端留有空白，因为放线菌的菌丝会向两边蔓延生长）。以此法制备的片子，可省略镜检时先要擦去盖玻片另一面菌丝体的操作步骤。,盖玻片,菌种划线,可在交界处划一条线标记,实验方法,3）培养 将插片平板倒置于28温箱中培养3-7天。4）镜检 用镊子小心取出盖玻片，并将其背面附着的菌丝体擦净（先插片后接种的可省略）。然后将玻片无菌丝体的面放在洁净的载玻片上，用低倍镜、高倍镜或油镜观察。,实验结果,霉菌的培养与观察：,倒平板：每皿约15mL培养基,三点接种,培养：28，

35、37d,镜检：挑取菌落边缘菌丝，放置于载玻片上（预先加1d水或乳酸石炭酸棉蓝），用针适当挑开菌丝，盖上盖玻片，用低高倍镜进行观察。,实验方法,观察黑曲霉菌丝分隔情况和分生孢子着生情况（着重辨认分生孢子梗、分生孢子）,实验结果,青霉,实验结果,1. 镜检时请特别注意放线菌的基内菌丝、气生菌丝的粗细和色泽差异。挑取霉菌时，应尽量避免挑段菌丝，可适当挑取培养基。观察时，应先用低倍镜沿着琼脂块的边缘寻找合适的生长区，然后再换高倍镜仔细观察有关构造并绘图。,注意事项,1镜检时，你如何区分放线菌的基内菌丝和气生菌丝？,思考题,放线菌的菌落形态,霉菌的三点接种,实验七 微生物显微镜直接计数法,1. 学习使用

36、血细胞计数板计酵母菌细胞的原理和方法。2. 了解微生物细胞活体染色的原理和计数的方法。,实验目的,利用血细胞计数板计数的原理 将经过适当稀释的微生物细胞或孢子悬液，加至血细胞计数板的计数室中，在显微镜下逐格计数。由于计数室的容积是固定的。（0.1mm3）故可将在显微镜下计得的菌体细胞数换算成单位体积试样中的含菌量。此法所计得数值为样品中的死菌数和活菌数的总和，故称其为总菌计数法。,实验原理,血球计数板是一块特制的载玻片，其上四条纵槽构成了三个平台，中间的平台比两边的平台低0.1mm，此平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分成9个大方格，中央的大方格为计数室。计

37、数室边长1mm，共有400个小方格，加盖玻片于突起部分上时，即形成一个体积为0.1mm3的计数室。 计数室的规格有两种：一种是25个中方格16个小格，另一种是16个中方格25个小格，所以小方格的总数是相同的，都为400个。,实验原理,在计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上16或25，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成1ml菌液中的总菌数。如果设五个中方格的总菌数为A，菌液稀释倍数为B，那么，一个大方格中的总菌数即（0.1mm3中的总菌数）为 A5 16(或25)B。所以1ml菌液中的总菌数 = A516（或25）101000B。,实验原理,美蓝是常用的活体

38、染色染料，当它处于氧化态时呈蓝色，还原态时为无色。 美蓝进行活体染色时，由于活细胞代谢过程中的脱氢作用，美蓝接受氢后就由氧化态转变成还原态，因此活细胞呈现为无色，而衰老或死亡的细胞由于代谢缓慢或停止，不能使美蓝还原，故细胞呈淡蓝色或蓝色。,实验原理,死活细胞鉴别原理,美蓝（氧化型）蓝色,酵母活细胞,新陈代谢,还原能力,美蓝（还原型）无色,实验原理,1.菌种：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）培养约2d的麦芽汁斜面培养物；2.染色液和试剂：0.05和 0.1% 吕氏碱性美蓝染液；3.器材：废液缸、载玻片、盖玻片、酒精灯、擦镜纸、显微镜等。,实验器材,1. 制备酵母菌菌液

39、 取斜面菌种一支，用缓冲液将菌苔洗下来，倒入含有玻璃珠的三角瓶中，充分振荡以分散细胞。将上述菌液再进行适当稀释。菌液应稀释到每一计数板的中格平均有15-20个细胞数为宜。 2. 活体染色 取上述配制的美蓝液0.9ml于试管中，再取上述菌液0.1ml相混合，染色10min后进行计数。,实验方法,3洗净计数板 先用自来水冲洗（切勿用硬刷子洗刷），再用95%乙醇棉球轻轻擦洗后用水冲洗，然后用吸水纸吸干（切忌在煤气灯上烘烤而导致计数板爆裂）。盖玻片也作同样的清洁处理。,实验方法,4.加染色菌液 先在低倍镜下（视野宜暗些）寻找计数板大方格网，再在大方格网中央寻找计数室并将其移至视野的中央，转用高倍镜观察

40、和计数。 通常选取25中格计数室内的5格及4个角与中央记取其含菌数。 为提高精确度，每个样品必须重复计数2-4个计数室内的含菌量。 5.分别计数与计算 分别计各中格中的死细胞（蓝色）和活细胞（无色）数目，在计算出活细胞百分比。,实验方法,实验方法,6. 清洗,计数板先用蒸馏水冲洗，吸水纸吸干，再用乙醇棉球轻轻擦拭后水冲，最后用擦镜纸擦干，最后放入计数板的盒中。,实验结果,将显微计数结果记录于下表中。T表示五个中方格中的总菌数；D表示菌液稀释倍数。,1. 加样时先摇匀菌液，计数室中不可有气泡产生；计数时，格线上的菌体只数压在底线及右侧线上的菌体数。3. 如遇酵母出芽，只有芽体与母细胞一样大时才计

41、为两个。4. 清洗计数板时切勿用手或硬物刷洗。,注意事项,实验八 食用菌菌种的分离和制种技术,了解食用菌菌种的采集和分离原理。 学会食用菌菌种的分离和制种的操作方法。,实验目的,实验原理,蕈菌是一类大型真菌，其中有许多可供食用，俗称为食用菌，如蘑菇、香菇、平菇、木耳等。 它含有丰富的蛋白质和维生素，其脂肪含量低且有多种低聚多糖类，故有很高营养与药用价值。 改善人体内微生态环境，有利于双歧杆菌和其它有益菌的增殖，经代谢产生有机酸使肠内pH值降低，抑制肠内沙门氏菌和腐败菌的生长，调节胃肠功能， 抑制肠内腐败物质，改变大便性状，防治便秘，并增加维生素合成，提高人体免疫功能。 低聚糖类似水溶性植物纤维

42、，能改善血脂代谢，降低血液中胆固醇和甘油三酯的含量； 低聚糖属非胰岛素所依赖，不会使血糖升高，适合于高血糖人群和糖尿病人食用； 由于难被唾液酶和小肠消化酶水解，发热量很低，很少转化为脂肪。,实验原理,所谓锁状联合是双核菌丝细胞分裂的一种特殊形式，借锁状联合使双核菌丝得以不断增殖。 镜检是否具有锁状联合，是判断蘑菇等菌种是否被霉菌污染的常用方法之一。,1）菌种：双孢蘑菇菌种，平菇菌种等。2）培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），食用菌制种的营养原材料等。3）器皿：普通光学显微镜，载玻片，盖玻片，镊子，无菌培养皿，无菌滤纸，单面刀片等。,实验器材,1）蘑菇菌丝体的形态观察制PDA斜面 接蘑菇母

43、种 插片或搭片,实验方法,恒温培养,制备镜检片,镜检观察,检锁状联合,实验结果,注意事项,在原种或栽培种的培养中，从第3天到菌丝覆盖培养基表面并深入料内2cm左右起，要勤检查，发现杂菌污染要及时妥善处理。 培养好的菌种要放在凉爽、干燥、清洁与避光处，及时使用以防菌种老化。,高等食用真菌的生活史与霉菌的生活史有何不同特点？食用蘑菇的菌种制备与形态特征观察中各需注意哪些方面？平菇的菌种制备与原种或栽培种的制备及管理等方面有何异同？,思考题,实验九 微生物生长量的测定和生长曲线的绘制,1. 了解细菌生长曲线的基本特征，测定大肠杆菌在不同培养条件下的生长曲线。2. 掌握利用细菌悬液的混浊度间接测定细菌

44、生长的方法。,实验目的,生长曲线就是把一定量的菌体细胞接种到恒定容积的液体培养基中，在适宜的条件下进行培养，在此过程中，其细胞数目将随培养时间的延长而发生规律性的变化，如以细胞数目的对数值（或OD值）为纵坐标，以培养时间为横坐标作一条曲线，即为微生物的生长曲线，它反映了微生物群体的生长规律。依据其生长速率的不同，可把生长曲线分为延迟期、对数期、稳定期和衰亡期四个时期。这四个时期的长短因菌种的遗传性、接种量和培养条件的不同而有所改变。因此测定微生物的生长曲线，可了解各菌的生长规律，对于科研和生产都具有重要的指导意义。,实验原理,测定微生物生长曲线的方法很多，有血球计数法、平板菌落计数法、称重法、

45、比浊法等。 本实验采用分光光度计进行光电比浊测定，由于细菌悬浮液的浓度与混浊液成正比，因此，可利用分光光度计测定菌悬浮的光密度来推知菌液的浓度，并将所测得的光密度值（OD值）与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定条件下的实生长曲线。,实验原理,1. 菌种 培养18-20h的大肠杆菌(Escherichia coli)培养液。2. 培养基 （1）牛肉膏蛋白胨液体培养基（2）葡萄糖铵盐合成培养基3. 仪器或其他用具 723型分光光度计，水浴振荡摇床，无菌试管，无菌吸管等。,实验器材,1. 菌种的培养：取大肠杆菌斜面菌种1支，以无菌操作挑取1环，接入牛肉膏蛋白胨培养液中，静止培养1824h左右。

46、此菌液用作“种子”培养液。2. 分装培养基：将牛肉膏蛋白胨液体培养基和葡萄糖铵盐液体培养基分装11支试管，每管内5ml。用记号笔标明培养时间，即0、1.5,、3、 4、 6、8、10、 12、14、16和20 h。,实验方法,3. 接种：用1 ml无菌吸管，每次准确地吸取0.2ml大肠杆菌培养液分别接种到已编号的11支牛肉膏蛋白胨液体培养基和11支葡萄糖铵盐液体培养基试管中，接种后振荡，使菌体混匀。4. 培养：将已接种的试管置摇床37振荡培养，振荡频率250 r /min（温度和频率可随需要调节）。分别在0、1.5,、3、 4、 6、 8、10、 12、14、16和20 h将标有相应时间的试管

47、取出，即放冰箱中贮存，最后一同比浊测定其光密度值。,实验方法,5. 比浊侧定 分别以未接种的牛肉膏蛋白胨液体培养基和葡萄糖铵盐液体培养基作空白对照，选用600 nm波长进行光电比浊测定。从最稀浓度的菌悬液开始依次测定，对细胞密度大的菌悬液用未接种的牛肉膏蛋白胨液体培养基和葡萄糖铵盐液体培养基适当稀释后测定，使其光密度值在0.1 0.65之内(测定OD值前，将待测定的培养液振荡，使细胞均匀分布)，记录OD值时，注意乘上所稀释的倍数。,实验方法,实验报告,将测定的OD600值填入下表：,2. 绘制大肠杆菌的生长曲线 以上述表格中的时间为横坐标，大肠杆菌的OD值为纵坐标，在坐标纸上作图。所绘制成的曲

48、线即为大肠杆菌在本实验条件下的生长曲线。,实验结果,在生长曲线测定中，一定要用空白对照管的培养液随时校正仪器的零点。,注意事项,1.如果用活菌计数法制作生长曲线，你认为会有什么不同?两者各有什么优缺点?2.细菌生长繁殖所经历的四个时期中，哪个时期其代时最短? 若细胞密度为103/ml，培养4.5 h后，其密度高达2 108/ ml，请计算出其代时。3.次生代谢产物的大量积累在哪个时期? 根据细菌生长繁殖的规律，采用哪些措施可使次生代谢产物积累更多?,思考题,实验九 细菌鉴定中的糖发酵试验,1. 学习几种主要微生物的生理代谢试验及检验方法；2. 认识微生物代谢类型的多样性；3. 了解这些生化试验

49、的原理,实验目的,实验原理,由于各种细菌具有不同的酶系统，所以它们能利用的底物（如糖、醇及各种含氮物质等）不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不相同，因此可利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌。在肠杆菌科细菌的鉴定中，生理生化试验占有重要的地位，常用作区分种、属、族的重要依据。,不同的细菌分解糖、醇的能力不同。有些细菌分解某些糖产酸产气，有的仅产酸不产气，因此可根据其分解利用糖能力的差异作为鉴定菌种的依据。是否产酸，可在糖发酵培养基中加入指示剂溴麝香草酚蓝（其pH指示范围为6.0-7.6，它在碱性条件下呈蓝色，在酸性条件下呈黄色），经培养后根据指示剂的颜色变化来判断。是否产气，可从培养基

50、中的杜氏小管中是否有气泡观测。,实验原理,糖类发酵实验,1. 菌种：未知细菌2. 培养基和试剂：葡萄糖发酵培养基、蔗糖发酵培养基、乳糖发酵培养基试管各3支（内装有倒置的杜氏小管）等。 3. 器材：试管架、接种环、酒精灯等。,实验器材,1. 试管标记：在试管外壁标明发酵培养基名称和接种细菌菌名。2. 接种：各取葡萄糖发酵培养基、蔗糖发酵培养基、乳糖发酵培养基试管各1支，接种未知细菌，另各取1支不接种，作为空白对照。3. 培养：将接种的和做对照的共6支试管放置37恒温箱中培养，24h后观察结果；4.观察各试管颜色变化及杜氏小管中有无气泡。,实验方法,1. 与对照管比较，若糖发酵管保持原有颜色，其反