分子诊断基因治疗a课件.ppt

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1、分子诊断基因治疗a,分子诊断基因治疗a分子诊断基因治疗a一 概述： 病理学在经历了几个阶段 器官病理学 组织病理学 细胞病理学 免疫病理学,分子诊断基因治疗a分子诊断基因治疗a分子诊断基因治疗a一 概,一 概述： 病理学在经历了几个阶段 器官病理学 组织病理学 细胞病理学 免疫病理学,一 概述：,随着50年代DNA双螺旋构造的发现，有关人类遗传物质，基因的研究进入了分子时代。肿瘤基因和病毒基因研究的新发现，特别是细胞分子生物学根底理论和技术方法出现了革命性的创新并日益完善成熟，使人类生物医学进入了分子水平时代。病理学的开展也不例外，将病理学这门有着悠久历史的学科推进到分子水平，逐步形成了分子病

2、理学。病理学诊断也由以形态学观察为根底逐步进入分子水平，既分子诊断,随着50年代DNA双螺旋构造的发现，有关人类遗传物质，基因的,分子病理学： 应用细胞分子生物学的理论和技术方法，对人类疾病发生开展、发病原因、机制、疾病的形态变化从分子or基因水平加以认识。 病理学诊断也由以形态学观察为根底逐步进入分子水平，既分子诊断以探查基因的变化来到达诊断疾病的目的。,分子病理学：,分子诊断的特点： 灵敏度高：基因虽然微量，难以检测，但目前已有使用基因or其片段高度扩增的PCR技术，以及应用高灵敏度的基因探针，即可探测。 特异性强：基因诊断检测的目标是基因，不同的基因的碱基序列各不一样，检测基因的分子生物

3、学方法亦是高度特异性的。 适用范围广。,分子诊断的特点：,目前主要应用于： 人类遗传病的基因诊断or产前诊断；肿瘤； 感染性疾病病原体细菌，病毒； 多基因病；组织器官移植配型； 法医学个人识别个人特异性的DNA指纹图； 亲子鉴定。 其中肿瘤的分子诊断涉及到，多种恶性肿瘤、癌前病变。 诊断的基因涉及多种癌基因，抑癌基因及相关基因。,目前主要应用于：,二 分子诊断在肿瘤研究中的意义和应用1 肿瘤易感基因的检测： 肿瘤分子遗传学研究发现，局部肿瘤的发生具有 遗传学根底，故肿瘤遗传相关的易感基因检测对 于肿瘤高危人群的筛测具有实用价值。 已明确的肿瘤易感基因及相关肿瘤有：,二 分子诊断在肿瘤研究中的意

4、义和应用,染色体, 基因产物位于细胞核。 APC-家族性腺瘤性息肉病，该基因定位于5q21染色体, 基因产物位于细胞膜，功能不清。WT1-肾母细胞瘤，该基因定位于11p13染色体, 基因产 物位于细胞核。BRCA1-乳腺癌，卵巢癌等，该基因定位于17q21染色体, 基因产物位于细胞核，为核内磷酸化蛋白与激素信 号传导有关。,分子诊断基因治疗a课件,抑癌基因与相关肿瘤抑癌 染色体 基因产 遗传性肿瘤 散发性肿瘤基因 定位 物定位Rb 13q14 核内 视网膜母细胞瘤 视网膜母细胞瘤 膀胱癌 乳癌 食道癌 肺癌P53 17p13 核内 膀胱癌 乳腺癌 食道癌 肺癌 肝癌 卵巢癌 淋巴瘤DCC 18

5、q12 胞膜 结肠癌 直肠癌APC 5q21 胞浆 家族性多发性腺瘤 结肠癌 直肠癌 胃癌 胰腺癌WT1 11p13 核内 Wilms瘤 Wilms瘤P16 9q21 核内 黑色素瘤 黑色素瘤 膀胱癌 乳腺癌 肺癌 肾癌 卵巢癌BRCA1 17q21 胞浆 乳腺癌 卵巢癌 乳腺癌 卵巢癌 结肠癌 直肠癌 前列腺癌,抑癌基因与相关肿瘤,二 分子诊断在肿瘤研究中的意义和应用2 肿瘤的分类： 对BCR区基因重排的检测，可对慢性粒细胞性白学病进展诊断，该基因定位于22q染色体, 该基因称为断裂点群区域基因，9q上的AB1基因与22q34.36区域基因序列相融合。 对N-myc和C-myc的扩增和表达检

6、测，对鉴别神经母细胞瘤和神经上皮瘤具有应用价值。N-myc明显扩增和过度表达-神经母细胞瘤。C-myc的扩增和过度表达-神经上皮细胞瘤。,二 分子诊断在肿瘤研究中的意义和应用,二 分子诊断在肿瘤研究中的意义和应用3 肿瘤的早期诊断： K-Ras基因突变，在胰腺癌，结肠癌，肺癌中发生率较高，其突变点在第12编码子最常见。应用针吸活检检测胰腺癌中第12编码子突变，检出率达100%。 应用PCR-RFLP(限制性酶切片段长度多态性方法检测了结肠癌患者Ras基因突变达33.3%. 另有学者检测了有Ras基因突变的7例中，1例病人随访4年后发现了结肠癌。 K-Ras基因编码鸟苷酸结合蛋白，与GTPase

7、结合。其突变降低了Ras蛋白与GTPase的结合能力，导致Ras蛋白与GTP的持续结合，从而促进细胞的生长作用。,二 分子诊断在肿瘤研究中的意义和应用,二 分子诊断在肿瘤研究中的意义和应用4 肿瘤的预后判断： 肿瘤相关基因的突变，扩增及过表达等改变常与肿瘤的预后密切相关。如，P53基因突变与乳腺癌，肝癌，结肠癌等多种肿瘤预后相关。 P53基因位于17p13，基因产物定位于细胞核，编码393个氨基酸组成的53KD的核内磷酸化蛋白，具有蛋白质-DNA和蛋白质-蛋白质结合的功能，p53是细胞周期中负调节因子，与细胞周期的调控，DNA修复，细胞分化，细胞凋亡等生物学功能有关。,二 分子诊断在肿瘤研究中

8、的意义和应用,肿瘤转移抑制基因nm23的表达水平与肿瘤转移相关。 Nm23位于17q22，基因产物定位于细胞浆，基因功能 目前认为主要有以下几个方面： A,通过抑制细胞对血小板源性生长因子，胰岛素样生长因子-1反响而影响细胞运动和抑制肿瘤转移； B,通过影响细胞内微丝、微管与细胞骨架系统的聚合/解聚和G蛋白介导的信号传导，参与细胞周期的调控而调节癌细胞的转移潜能； C,nm23基因上调c-myc，促进转录发生，并调节肿瘤细胞与微环境的反响，促进基底膜形成而抑制肿瘤细胞生长和转移。 CerbB-2基因的过表达与乳腺癌预后相关。 上皮生长因子受体，为磷酸化蛋白。,肿瘤转移抑制基因nm23的表达水平

9、与肿瘤转移相关。,二 分子诊断在肿瘤研究中的意义和应用5 肿瘤的预见性治疗： 肿瘤的发生是多基因，多步骤，多阶段的过程。在肿瘤发生，开展的不同时期，可能涉及不同的基因和不同的变化形式，与肿瘤临床治疗敏感性密切关联。如能在分子水平上对肿瘤基因变化提供指标，那么对肿瘤的预见性治疗具有指导意义。如90%的胰腺癌，50%的结肠癌，30%的非小细胞肺癌存在Ras基因的激活，对放疗具有抵抗性，如能从基因水平上改变异常的基因状态，那么可提高放疗敏感性。,二 分子诊断在肿瘤研究中的意义和应用,起动阶段 促进阶段 进展阶段正常胃粘膜萎缩性胃炎肠化异型增生原位癌转移癌 基因点突变 基因扩增 基因缺失 or过量表达

10、 or重排 Ras, P53 erbB2, EGFR Apc,P53, P16, Rb, nm23,起动阶段 促进阶,二 分子诊断在肿瘤研究中的意义和应用6 肿瘤的预后监测： 如用多聚酶链反响(polymerase chain reaction, PCR)技术可使白血病细胞检出率到达1/106左右，应用PCR技术检测周围血中的肿瘤细胞，可提高对肿瘤转移监测的准确性。分子诊断在肿瘤的监测方面具有重要意义。 肿瘤的分子诊断主要集中于对癌基因，抑癌基因及相关基因的检测，分别在蛋白质，RNA和DNA水平进展判断。,二 分子诊断在肿瘤研究中的意义和应用,三 肿瘤基因过表达及其检测 1 基因过表达的形式：

11、 癌基因的激活和抑癌基因的失活是肿瘤发生过程中的关键因素，癌基因的激活有多种表现形式，其中基因产物过表达为形式之一。 癌基因一般为单拷贝基因，在肿瘤细胞内的一些癌基因在DNA复制过程中形成多拷贝，这种基因的扩增，使得基因过表达，表现为mRNA和蛋白质量的增加。 抑癌基因在正常情况下维持细胞的正常周期。P53其野生型基因产物半衰期短而不易检测到，但突变后起到癌基因的作用。其产物半衰期延长，应用一定的方法即可在肿瘤细胞内检测到过表达的P53蛋白。,三 肿瘤基因过表达及其检测,人类肿瘤中的癌基因扩增癌基因 肿瘤及扩增百分比%C-myc 乳腺癌(15-23), 结肠癌(3-6) 肺鳞状细胞癌(12-2

12、5)N-myc 神经母细胞瘤(10-31)c-myc, N-myc or L-myc 肺小细胞癌(11-23) C-myc or L-myc 肺腺癌(2-11)ErbB-2 乳腺癌(16-33), 胃癌和食道癌(5-13), 卵巢癌(20-33)K-ras 乳腺癌(3), 卵巢癌(4-8), 肺癌(4),人类肿瘤中的癌基因扩增,几种常见肿瘤癌基因的扩增率 基因 肿瘤类型 扩增率(%) 基因 肿瘤类型 扩增率(%) C-erbB-2 乳腺癌 16-33 N-Myc 肺腺癌 2-11 胃，食道癌 5-13 K-Ras 乳腺癌 3-10 卵巢癌 20-33 胰腺癌 45 胆囊癌 45-58 卵巢癌

13、8-8 肝癌 25-45 胆囊癌 30-61C-Myc 乳腺癌 25-30 N-Ras 肝癌 24 结，直肠癌 3-6 胆囊癌 40-60 肝癌 25-42 肺鳞癌 15-25,几种常见肿瘤癌基因的扩增率,2 基因过表达的检测：1表达产物的检测： 癌基因，抑癌基因其蛋白产物的过表达可以应用相应的抗体，通过免疫组织化学Immunohistochemistry方法检测肿瘤组织中蛋白产物，or蛋白印迹(Western Blot)以及酶联免疫吸附实验(ELISA)方法检测肿瘤细胞or血清中的蛋白产物。 免疫组化：在组织切片上进展。Or细胞爬片。 特点-是保持组织构造的条件下原位进展分析。 ELISA是

14、在细胞悬液中进展。,2 基因过表达的检测：,Western blot 既可对组织细胞进展分析，也可对释放至血液中的蛋白质进展检测。流式细胞仪Flow cytometry 新一代测定蛋白质产物的方法,首先标记荧光于相应的抗体蛋白，与含有特异性抗原的细胞结合后，用流式细胞仪对不同荧光信号的细胞进展分类、测试。 在已报道的研究结果中，许多肿瘤都存在其相关基因的蛋白产物过表达。如乳腺癌C-erbB-2表达，阳性率50%，P53 为50%，并与其组织学类型、浸润、转移倾向和预后有关。P53基因产物在大多数肿瘤中都有过表达，包括胃癌，直肠癌，肺癌，食道癌，肝癌，卵巢癌等。,Western blot,2基因

15、扩增的检测： 肿瘤基因的扩增可产生过量的表达蛋白，此外表现为基因拷贝数的增加和转录产物mRNA的增加，可通过分子诊断方法进展检测。 经典的方法： 核酸分子杂交原位杂交 In situ hybridization,ISH Southern blot(DNA杂交)，Northern blot(RNA杂交)， 原位PCR，反转录PCR。,2基因扩增的检测：,核酸分子杂交： 是检测核酸分子间序列同源性的一种技术。不同来源的核酸单链只要彼此间有一定的互补顺序，即可按碱基配对规那么以氢键相结合。通常是先对一种核酸进展标记如放射性同位素or荧光素、生物素等作为探针，去探测另一核酸序列。先经过变性使DNA双链

16、分开成单链，再进展杂交，可以是DNA-DNA, RNA-RNA, or DNA-RNA之间进展。,核酸分子杂交：,原位杂交： 用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特定的DNA或RNA序列。 用原位杂交技术检测肿瘤细胞内癌基因的mRNA可检出激活的癌基因。用不同种类的癌基因探针检测同一种癌组织内mRNA可以明确有哪些基因被激活。,原位杂交：,Southern blot： 1975年由Southern提出并以其名字命名的一种DNA特定序列定位技术。 根本原理从组织细胞中提取基因组DNA，用一种or多种限制性内切酶酶切，通过电泳，转膜，原位变性固定于固相支持物硝酸纤维滤膜or尼龙膜，用

17、已标记的特异性DNA or RNA探针与固定有DNA的固相支持物杂交，经放射自显影or化学发光自显影，对显影条带进展分析。可以确定在众多酶解产物中某一特定序列DNA片段的位置和大小。最常见的研究对象为基因组DNA，也可以用于质粒DNA的片段分析。,Southern blot：,Northern blot： 1977年Alwine等提出的一种类似于Southern的方法，主要用于分析mRNA。 根本程序提取组织细胞中的RNA-电泳，原位转移至固相支持物上-杂交-放射自显影or化学发光自显影结果分析。以显示目标RNA所存在的位置，含量。,Northern blot：,PCR聚合酶链反响： 1983

18、年美国PE-Cetus公司的Mullis等人创造，1985年公开报道，该技术的创造在生命科学中掀起了一场革命。其实质就是一种在体外经酶促反响将特定的DNA序列进展高效，快速扩增的技术。 反响体系： Taq酶属DNA聚合酶。 合成的DNA引物。 Mg2, 缓冲液提供反响适宜的酸碱度。 三磷酸脱氧核苷酸dNTP。,PCR聚合酶链反响：,分子诊断基因治疗a课件,原位PCR： 1992年建立。在组织细胞原位进展DNA扩增的定位，定性研究方法。PCR扩增技术原位杂交技术相结合，通过PCR技术对靶核苷酸序列在染色体上or组织细胞内进展原位扩增，使基因拷贝数放大，再通过原位杂交方法检测，以到达对靶核苷酸进展

19、定位，定性，定量分析。逆转录PCRRT-PCR： 为RNA的快速体外扩增的一种技术。RNA的扩增需将RNA转化为DNA，用逆转录酶来完成，首先合成的第一条链cDNA，以cDNA作为模板，再用特异的引物进展PCR扩增。,原位PCR：,四 基因突变及其检测 基因突变的结果使癌基因激活或抑癌基因失活，细胞表型发生变化和肿瘤发生。 肿瘤细胞可检测到突变的基因。 癌前病变or癌前状态组织细胞存在不同形式和不同程 度的基因突变。 在同一种肿瘤的不同开展阶段也可能会涉及多种基因不同形式的突变。,四 基因突变及其检测,1 基因突变的形式： 点突变指基因在特定位置发生一个核苷酸的改变， 使相应蛋白质的一个氨基酸

20、改变，继而改变了蛋白质 的空间构型和生物学功能。 研究说明，大局部的肿瘤几乎都存在相应基因的点突变 如肺癌，膀胱癌，结肠癌，胃癌，乳腺癌等存在H-Ras, K-Ras, N-Ras的第12，13，61编码子的点突变。 P53, P16, P15等几种抑癌基因也在多种肿瘤中存在点 突变。,1 基因突变的形式：,人类肿瘤中的Ras基因突变Ras突变百分比% 活化的Ras基因肺腺癌 30 K-Ras结肠腺癌 50 K-Ras胰腺癌 90 K-Ras胆管腺癌 90 K-Ras膀胱癌 6 H-Ras乳腺癌 5 K-Ras宫颈癌 25 H-Ras甲状腺癌 60 H-Ras, K-Ras, N-Ras黑色素

21、瘤 20 N-Ras精原细胞瘤 40 K-Ras, N-Ras,人类肿瘤中的Ras基因突变,人类肿瘤中P53基因突变热点和频率肿瘤类型 突变频率 突变热点(编码子)肺癌 56 157，248，273结肠癌 50 175，245，248，273食道癌 45 不确定卵巢癌 44 273胰腺癌 44 273皮肤癌 44 248，278胃癌 41 不确定,人类肿瘤中P53基因突变热点和频率,人类肿瘤中P53基因突变热点和频率肿瘤类型 突变频率 突变热点(编码子)头颈部鳞癌 37 248膀胱癌 34 280肝细胞癌 45 249乳腺癌 22 175，248，273甲状腺癌 13 248，273宫颈癌 7

22、 273,人类肿瘤中P53基因突变热点和频率,基因缺失指基因片段的缺失Gene loses，缺失的范围差异较大，可以是1-2个碱基，也可以是一个片段。是另一种主要的突变形式。常见的缺失位点如乳腺癌的3p 7q 11p 13q 16q 17p等，结肠癌的5q 17p 18q等。基因片段的缺失可使该基因激活、转录异常，使基因正常的生物学功能丧失。基因缺失是肿瘤形成的原因还是细胞恶性转化后的结果，仍值得深入探讨。,基因缺失指基因片段的缺失Gene loses，缺失的范,基因易位或重排某一基因在肿瘤细胞中从染色体的正常位置转移到其它染色体的某个位置上称易位or重排Gene translocation

23、and rearrangement。易位与重排易使癌基因被激活，或使抑癌基因失活，从而使细胞恶变。细胞癌基因的编码序列在DNA分子上是不连续的，由内含子分隔，其中有些序列起到促进子和调节基因的作用，如染色体出现易位、重排等改变时，可使细胞癌基因与正常的抑制子分开而被置于活化DNA序列的控制之下，而使其活化。Burkitt淋巴瘤 c-myc基因 8q24易位于2p11。慢性or急性粒细胞白血病，急性淋巴细胞白血病，癌基因Ab1从9号染色体易位于22号染色体。9q3422q11。Ewing肉瘤，SiS基因从22号染色体易位于11号染色体。SiS基因编码生长因子类癌基因，其产物为PDGF-血小板生长

24、因子亚单位，作用于PDGF受体，使细胞增殖。,基因易位或重排某一基因在肿瘤细胞中从染色体的正常位置转移到,几种常见肿瘤的染色体易位常见肿瘤 染色体易位 涉及的癌基因小无裂细胞淋巴瘤 t(8; 14)(q24; q32) c-Myc滤泡性淋巴瘤 t(14;18)(q32;q21) Bcl-2Burkitt淋巴瘤 t(8;2)(q24;p11) c-Myc t(8;14)(q24;q23) c-Myc t(8;22)(q24;q11) c-MycEwing肉瘤 t(11;22)(q24;q12) c-Sis透明细胞肉瘤 t(12;22)(q13;q12) ？滑膜肉瘤 t(X;18)(p11;q11

25、.2) ？横纹肌肉瘤 t(2;13)(q35;q14) ？,几种常见肿瘤的染色体易位,2 基因突变的检测方法： PCR-SSCP法：单链构象多态性法single-strand conformational polymorphism, SSCP是在非变性聚丙烯酰凝胶上电泳,短的单链DNA和RNA分子依其碱基序列不同而形 成不同构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。其根本原理：单链DNA在中性条件下会形成二级构造，这种二级构造依赖于其碱基组成，即使存在一个碱基的不同，也会形成不同的二级构造而出现不同的迁移率。由于该法简单快速，因而被广泛用于未知基因突变的检测。特别适合大样本基因突变的筛选工作。 技术

26、要点：在PCR反响中掺入放射性同位素以标记被检DNA，其产物在非变性聚丙烯酰凝胶上电泳。 缺点：该法不能测定突变的准确位点，还需要通过序列分析来确定。,2 基因突变的检测方法：,杂合双链分析法(Heteroduplex analysis, HA)： 将突变型-野生型DNA双链进展杂交，由于突变型和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA，在其错配处形成突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应的同源双链DNA不同的迁移率。,杂合双链分析法(Heteroduplex analysis,等位基因特异性寡核苷酸分析法： 等位基因特异性寡核苷酸分析法allele-specific oligonucleoti

27、de, ASO为一种以杂交为根底对突变的检测技术。以PCR和ASO相结合，设计一段20bp左右的寡核苷酸片段，其中包含了发生突变的部位，以此为探针，与固定在膜上的经PCR扩增的样品DNA杂交。可以用各种突变类型的寡核苷酸探针，同时以野生型探针为对照，如出现阳性杂交带，那么表示样品中存在与该ASO探针相应的点突变。,等位基因特异性寡核苷酸分析法：,DNA芯片技术DNA chip： 是90年代后开展的一项DNA分析新技术，主要目标是用于DNA序列的测定，基因表达，基因突变体的检测和分析。又称基因芯片。,DNA芯片技术DNA chip：,根本原理： 将许多序列的寡核苷酸DNA密集排列在一块基片尼龙膜

28、or载玻片外表，彼此之间重叠一个碱基，并覆盖全部所需检测的基因，将荧光标记的正常DNA和突变DNA分别与两块DNA芯片杂交，由于至少存在一个碱基的差异，正常的和突变的DNA将会得到不同的杂交图谱，经过共聚焦显微镜分别检测两种DNA分子产生的荧光信号，并通过电脑应用特别的软件处理，即可确定是否存在突变。,根本原理：,基因芯片的应用： 基因诊断，DNA芯片可用于大规模筛查 由基因突变引起的疾病。 据文献报道，DNA芯片用于检测遗传性 乳腺癌和卵巢癌基因BRCA1第11外显子的 突变，检测了315例病人样品，发现其中 14例有基因突变，没有假阳性结果出现。,基因芯片的应用：,应用DNA芯片技术分析基因组和发现新基因。用于基因表达的研究。进展DNA序列分析。,应用DNA芯片技术分析基因组和发现新基因。,谢谢大家！,谢谢大家！,