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1、二. 免疫荧光双重染色法: 用不同的荧光色素标记不同的抗体, 染色后观察, 相应的抗原物质显示不同的颜色. A. 直接法: 1. 一步法: 将FITC (490495520530nm, 黄绿色荧光)和TRITC (550620nm, 红色荧光)分别标记的两种抗体按一定比例混合, 使每个抗体均为最适稀释度, 然后孵育切片. 2. 二步法: 先后依次使用两种荧光抗体分别孵育切片.,1,二. 免疫荧光双重染色法: 用不同的荧光色素标记不同的抗体,3. 观察: 同一个视野里.a. 对每一种荧光标记物(绿色或红色)使用不同的滤色板进行观察和照相, 每张照片显示一种荧光, 比较两张照片. b. 两种荧光重
2、叠照相, 则在一张照片上可发现分别含不同抗原的细胞(呈绿色或红色), 如果两种抗原存在于同一个细胞或结构, 则呈现两种红绿荧光的混合色, 如黄色.,免疫荧光双重染色法: FITC绿色, TRITC红色, 混合色为黄色.,2,3. 观察: 同一个视野里.免疫荧光双重染色法: FITC绿,B. 间接法: 1. 两种一抗不标记, 但来自不同种属的动物如兔和豚鼠. 2. 两种来源于同种动物或不同种动物的二抗(如羊抗兔IgG和羊抗豚鼠IgG, 或羊抗,兔IgG和猪抗豚鼠IgG)分别以FITC和TRITC标记. 3. 染色程序:a. 先用第一种一抗和相应的标记二抗依次孵育切片, 显示第一种抗原; 然后再用
3、第二种一抗和相应的标记二抗依次孵育切片, 显示第二种抗原. b. 将两种一抗混合后孵育切片, 再将两种标记的二抗混合后孵育切片, 最后用荧光显微镜观察.,3,B. 间接法: 兔IgG和猪抗豚鼠IgG)分别以FITC和T,免疫荧光双重染色法: FITC绿色, TRITC红色, 混合色为黄色.,4,免疫荧光双重染色法: FITC绿色, TRITC红色, 混合,Y.W Lin. USP26 stained by Alexa Fluor 488 and Myc stained by Alexa Fluor 594 in COS7 cells. Nuclei were stained by Hoechs
4、t blue,5,Y.W Lin. USP26 stained by Alex,三. 免疫酶双重染色A. 单酶法: 1. 原理: a. 用一种酶如 HRP标记显示两种不同的抗原, 但用不同的电子供体如 DAB和CN呈现不同颜色的反应终产物. b. 两种一抗来自同种属动物, 两重染色之间需将第一次染色反应中的各级抗体和酶或各级抗体, 酶和反应产物从组织上洗脱. c. 连续做两次染色, 所费时间较长.,6,三. 免疫酶双重染色6,抗体, 酶和反应产物洗脱,7,抗体, 酶和反应产物洗脱7,2. 染色的最佳条件: 先对两种待检抗原分别染色, 以决定合适的抗体稀释度和反应条件等. 3. 双重染色的先后次
5、序: a. 先显示含量较少的抗原. b. 先显示容易受染色过程和洗脱过程影响的组织抗原.c. 先用不太敏感的抗体.d. 先用DAB显色. 4. 对照试验: a. 单染对照.b. 在进行第二次染色前, 要证明第一次染色的各级抗体和酶活性被完全除去, 而且洗脱后对第二个待检抗原无影响.,8,2. 染色的最佳条件: 先对两种待检抗原分别染色, 以决定合,5. 抗体洗脱:a. 酸洗法: pH2.2甘氨酸-HCl缓冲液(可加入适量二甲基甲酰胺, DMF)14小时使抗原-抗体复合物解离. b. 氧化法: 2.5% KMnO4: 5% H2SO4: DDH2O=1:4:10260, 1分, 氧化除去抗体,
6、0.5% Na2S2O5漂白液脱色. 第一次染色用CN显色, 并注意对第二种抗原的影响.c. 甲醛蒸气法: 1升容器+3g多聚甲醛+切片, 置80烤箱14小时, 蒸汽破坏抗体的Ig结合部位.,第一次用ABC法, 氧化法洗脱抗体. 对照试验证实此为假性双标.,9,5. 抗体洗脱:第一次用ABC法, 氧化法洗脱抗体. 对照试,6. 具体操作步骤: a. 方法1: 第一次染色后, 除去抗体和酶而使有色反应终产物留在抗原部位, 再用同样方法进行第二次染色. *. 切片处理, 抑制内源性酶及正常血清封闭同前. *. 用PAP法完成第一次染色, CN-H2O2显色. TBS洗两次, 每次510分. *.
7、氧化法洗脱. TBS洗如上. *. 用PAP法完成第二次染色, 0.05%DAB-0.01%H2O2显色. TBS洗如上. 甘油胶封片.,10,6. 具体操作步骤: 10,一抗来自同种动物的单酶法免疫酶双重染色,11,一抗来自同种动物的单酶法免疫酶双重染色 11,大鼠垂体前叶促性腺激素细胞(蓝色)和生长激素细胞(棕色), 免疫酶(PAP法)双重染色.,12,大鼠垂体前叶促性腺激素细胞(蓝色)和生长激素细胞(棕色),b. 方法2: 第一次染色后, 照相记录结果并记住照相视野的部位. 用有机溶剂将反应终产物溶解除去, 并将第一次染色形成的抗体复合物洗脱掉, 然后进行第二次染色. 对同一部位再一次照
8、相, 比较先后照相所得照片. *. 切片处理同上. *. 用PAP法完成第一次染色, CN-H2O2显色. TBS洗两次, 每次510分. *. 以TBS封片, 照相(注意随时从盖片边缘补加TBS, 防止切片干燥). *. 去盖片, TBS洗, 再用酒精-二甲苯-酒精处理, 除去CN蓝色反应产物, DDH2O洗. *. 氧化法洗脱, 然后TBS洗两次如前. *. PAP法完成第2次染色, 0.05%DAB-0.01%H2O2或CN-H2O2显色. *. TBS洗同上, 封片. *. 找出第一次照相的部位, 再次照相.,13,b. 方法2: 第一次染色后, 照相记录结果并记住照相视野的,大鼠垂体
9、前叶GnRH相关肽阳性细胞(左, 蓝色)与促性腺激素细胞(右, 棕色)为同一种细胞, 免疫酶(PAP法)双重染色.,14,大鼠垂体前叶GnRH相关肽阳性细胞(左, 蓝色)与促性腺激素,B. 双酶法: 1. 原理: a. 用两种无关的酶分别标记显示两种抗原, 常用的酶为HRP和AKP, 或HRP和葡萄糖氧化酶. b. 两种一抗来源于不同种属的动物, 如兔和小鼠, 或同种动物(如小鼠)的两种单克隆抗体, 但其Ig亚类不同, 如IgGl和IgG2a. c. 两种二抗分别是抗兔IgG和抗小鼠IgG, 或抗小鼠IgGl和抗小鼠IgG2a. 可以来自同种属动物或不同种属动物, 可以是酶标抗体(一个用HRP
10、, 另一个用AKP标记), 也可以是未标记抗体(一个用兔PAP, 另一个用小鼠APAAP).,15,B. 双酶法: 15,c. 可避免抗体残留而引起的假性双标记, 不需中间洗脱处理. 由于无交叉反应, 可将两重染色的同一层抗体混合同时使用并先后显示两种酶的活性, 在同一张切片上获得不同颜色的反应终产物, 如棕色和蓝色. 如两种抗原共存于同一个细胞, 则出现灰紫色的混合色.,16,c. 可避免抗体残留而引起的假性双标记, 不需中间洗脱处理.,2. 染色的最佳条件: 先对两种待检抗原分别染色, 以决定合适的抗体稀释度和反应条件等. 3. 双重染色的先后次序: 先显示HRP, 再显示AKP或葡萄糖氧
11、化酶. 4. 对照试验: a. 单染对照.b. 必需排除两套抗体系统之间的交叉反应. 如第二种羊抗兔IgG二抗可能与第一种小鼠IgG一抗结合而出现假性双标记, 因此应事先做抗体进行交叉染色实验.,17,2. 染色的最佳条件: 先对两种待检抗原分别染色, 以决定合,5. 染色步骤: 以先后使用PAP法和APAAP法为例. a. 切片处理, 抑制内源性酶及正常血清封闭如前. b. 两种一抗混合液(各自稀释度由单染色决定), 室温30分或4过夜. TBS洗两次, 每次510分. c. 两种二抗混合液(各自稀释度由单染色决定), 室温30分. TBS洗同上. d. PAP和APAAP混合液(各自稀释度
12、由单染色决定), 室温30分. TBS洗同上. e. 显示HRP, 如用0.05%DAB-0.01%H2O2, 镜下控制染色. TBS洗同上. f. 显示AKP, 如用萘酚AS-MX磷酸盐加固蓝BB, 镜下控制染色. TBS洗同上. g. 甘油胶封片.,18,5. 染色步骤: 以先后使用PAP法和APAAP法为例. 1,6. 注意事项: a. 过厚切片(7m)可能出现混合色(双标记)的假象. b. APAAP法中缓冲液用TBS而不用PBS, 或至少在显示酶活性的一步中用TBS. c. 内源性AKP一般不会引起问题. d. 正常血清封闭用两种二抗来源动物的正常血清. 四. 免疫酶-免疫荧光双重染
13、色法: 首先用免疫酶法显示第一种抗原, 然后用间接免疫荧光法定位第二种抗原. 若两个一抗来自同一动物, 需要注意可能发生的交叉反应.,19,6. 注意事项: 19,五. 免疫酶-免疫金(银)双重染色法: A. 免疫酶-免疫金双重染色法: 1. 用PAP法显示第一种抗原, 为了加强与胶体金的红色的对比, 用CN显色(蓝色), 如该抗原存在于神经, 则用DAB显色. 2. 用酸洗法洗脱第一次染色的抗体复合物, 继之用IGS法显示第二种抗原, 在光镜下监视染色, 直到出现满意的红色为止. 3. 用PAP法后再用IGS法, 可防止标记在二抗的胶体金颗粒与抗体一起洗脱掉. 金标抗体穿透组织能力差, 常需
14、用较大的一抗和金标抗体浓度并提高其穿透力.,20,五. 免疫酶-免疫金(银)双重染色法: 20,B. 免疫酶-免疫金银双重染色法: 1. 用IGSS法显示第一种抗原, 用5nm小颗粒胶体金标记二抗. 应用物理显影液进行银加强后, 在金颗粒周围形成金属银壳, 不但增强了金颗粒的可见度, 而且封闭了第一次染色的各级抗体, 从而避免了第二次染色试剂发生交叉反应. 因银壳可能覆盖第二种抗原, 该法只适用于两种抗原存在于不同组织结构. 2. 缓冲液彻底清洗后, 再用免疫酶法(如PAP或ABC法等)显示第二种抗原. IGSS法所得黑色可与免疫酶法所得棕色, 蓝色等形成显明对比.,21,B. 免疫酶-免疫金银双重染色法: 21,
