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1、发酵液中分别提纯透亮质酸摘要：透亮质酸微生物发酵液中往往都含有蛋白质、核酸等杂质，因此需要分别纯化。只有高纯度的透亮质酸才能更好的发挥其工业效用，但是分别纯化的方法却多种多样。目前主要方法有过滤法、凝胶层析法、离子交换层析法等，而不同的方法又将导致操作、成本、和纯度的不同。因此本文将从多方面多角度综合分析各种透亮质酸分别纯化方法。关键词：透亮质酸多糖发酵分别提纯过滤凝胶层析离子交换透亮质酸（hyaluronicacid,简称ha）又名玻璃酸，是一种由d-n-乙酰氨基葡萄糖和d-葡萄糖醛酸为结构单元的酸性高分子粘多糖。ha具有很多自然多糖共有的性质：呈白色，为无定形固体，无臭无味，有强吸湿性，溶
2、于水，不溶于有机溶剂。它是一种国际上公认的生物大分子保湿剂，用于眼科显微手术、关节炎治疗、高档化妆品、食品添加剂等领域1。1分别提纯透亮质酸发酵法生产的ha具有分别精制简洁，保湿性强，品质稳定，产量大等优点，目前已得到广泛使用，并已成为讨论ha生产的主要方向。由于微生物发酵液中提取的透亮质酸粗品都含有菌体，杂蛋白、核酸等杂质，需要进一步分别纯化。以下简洁介绍几种工业上常用的发酵液中透亮质酸的分别提纯的方法：1.1过滤法过滤法分别纯化发酵液中的ha是一种简洁有效并可以规模化生产ha的分别纯化方法，可以有效地除去菌体和杂蛋白，对分子量的影响相对较小。邓禹等2采纳25gl三氯乙酸灭活菌体并使蛋白质变
3、性沉淀，以发酵液质量1.2%的混合硅藻土为过滤助剂，过滤温度为60,ph为7.O的透亮质酸发酵液预处理工艺，完全去除了透亮质酸发酵液中的菌体和蛋白质等杂质。采纳这一工艺得到的成品透亮质酸中葡萄糖醛酸含量达46.39%,蛋白质含量仅为0.047%,分子量为190万，提取收率为91.3%o这种方法采用三氯乙酸灭活菌体并使蛋白质变性沉淀，然后以硅藻土作为过滤助剂吸附、截留蛋白质和菌体的透亮质酸发酵液预处理方法。L2凝胶层析法凝胶层析法是生物化学中一种常用的分别手段，凝胶层析是依据不同分别纯化目的和ha分子量大小选择合适的分子筛进行分别纯化的，透亮质酸分子量达几十万到几百万，而蛋白质的分子量仅为几万，
4、所以选择合适的凝胶可以起到分别纯化的效果。吴华昌等3采纳葡聚糖凝胶g-100,以0.lmol/1氯化钠溶液为洗脱剂，以ha提取率与纯度为指标，对ha发酵液进行分别纯化，再用醇沉法提取ha,拟达到提高ha提取率和纯度的目的。在优化的凝胶层析条件下,ha提取率达到79.85%,蛋白质去除率为84.93%。1.3离子交换层析法假如采纳化学方法从发酵液中分别纯化透亮质酸，纯化过程中的Ph值、光、热和还原剂等因素易导致其黏度发生不行逆的下降。而在进入ha纯化阶段后，由于离子交换层析等具有选择性吸附特点的层析技术已经成为分别提取生物大分子的有效方法。倪杭生等4采纳强酸型阳离子树脂为交换剂的离子交换柱，和经
5、组氨酸基团修饰的强碱型阴离子树脂为交换剂的离子交换层析柱串联。选择以氯化钠溶液为洗脱剂，在优化的洗脱条件下，对ha粗品进行分别纯化，纯化重量收率为58%61%,分子量近IOO万。ha粗品溶液先通过交换柱，其中主要杂质蛋白质是两性物质，在偏酸性溶液中带正电荷，能与强酸型阳离子发生交换吸附而被纯化。2透亮质酸分别提纯方法的分析总结从发酵液中分别提纯透亮质酸是发酵法生产透亮质酸的关键步骤之一，而目前报道的去除ha发酵液中菌体和蛋白质等杂质的方法有过滤法、凝胶层析法、离子交换层析法等。虽然过滤法具有设施简洁、操作便利、试验重复性好、成本低廉，且能有效去除蛋白质类杂质，但提纯效率相对还是比较低的，这种方
6、法通常只用于透亮质酸的初期分别纯化。凝胶层析是基于被分别组分之间的分子量大小不同而起到分别的效果，这样就避开了化学方法纯化ha过程中的ph、酶、光、热和还原剂等因素导致糖昔键的水解或分子间解聚，避开了黏度发生不行逆的下降。但凝胶层析法成本较高，且分别提纯ha的提取率也比较低。离子交换法基于被分别组分与交换剂之间存在的静电作用，离子交换层析分别条件温柔，不引起分子结构的变化，这具有很强的优越性。与化学提取法相比，离子交换法的提取率还较低，离子交换树脂的化学修饰比较困难，因此在离子交换剂的选择以及离子交换树脂的基团修饰方面还需要进一步的讨论。面对这诸多问题每种分别纯化方法也都存在肯定的局限性，单一
7、的分别纯化方法并不能达到很高的纯化程度，只有依据制备ha的不同要求在不同阶段选择适当的分别纯化的方法，并对工艺过程和方法进行系统优化，才能获得高纯度、高分子量的ha。因此从发酵液中分别纯化ha往往是由多种分别纯化方法联合完成。所以，对于发酵液中透亮质酸的提取方法还有待于进一步的讨论探究。3透亮质酸展望2004年全球的ha在化妆品和医疗用途上，销售总值高达3040亿美元，还以每年20%的递增率增长。在ha的研发上，国内外学者开头着重于对ha进行修饰及对其衍生物的应用进行讨论，以解决纯ha易溶于水、汲取快速和在组织中停留时间短等特性。在ha分别提纯工艺讨论的重点将是对分别纯化方法优化组合，精细化操
8、作，降低生产成本的同时提高分别纯化工艺的平安性，操作上的简捷性，探究适合于工业化生产的工艺路线，在提高ha纯度的同时尽量保持高的分子量。因此，ha的研发以及纯化工艺的改进将成为当前的进展趋势。参考文献1孙尚志,张青春,张辉等.透亮质酸(ha)的功能和生产进展j长春中医药高校学报,2007,23(3)88-892邓禹,堵国成,李秀芬等.基于发酵液特性的透亮质酸提取预处理工艺j.过程工程学报,2007,7380-384.3吴华昌，马钦元,等.凝胶层析在发酵液中分别提纯透亮质酸中的应用j.生物技术通报,2022,12:184-1874倪杭生,李润,贺明丽等.透亮质酸的离子交换层析纯化j.中国医药工业杂志,2001,32(11):485-488.
