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1、ICSCCSDB51JllDB51/XXXXX-XXXX大熊猫重要疾病检测技术规范TechnicalSpecificationforDetectionofImportantDiseasesofGiantPandas（送审稿）XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施四川省市场监管局发布目次前言II大熊猫重要疾病检测技术规范11范围12规范性引用文件13术语与定义14主要仪器25病原检测项目26病原检测方法37病原检测规则38结果判定及结论49废弃物处理4附录A（规范性附录）大熊猫犬瘟热病毒反转录RT-PCR检测方法5附录B（规范性附录）大熊猫轮状病毒反转录RT-PCR检测方法7附录C（规
2、范性附录）大熊猫猫泛白细胞减少症病毒巢式PCR检测方法9附录D（规范性附录）大熊猫源巴贝斯虫检测方法12附录E（规范性附录）大熊猫西氏贝蛔虫检测方法14本标准根据:GB/T1.1-2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则起草。本标准附录A、附录B、附录C、附录D和附录E为规范性附录。本标准由四川省林业和草原局提出并归口。本标准由四川省市场监督管理局批准。本标准起草单位：成都大熊猫繁育研究基地、军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所、江苏大学本标准主要起草人：刘颂蕊、岳婵娟、苏小艳、李运莉、侯蓉、兰景超、杨奎兴、冯娜、张文、燕霞、张东升、张洪文、李林、范雪阳本标准根据:GB/T
3、1.1-2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则起草。本标准附录A、附录B、附录C、附录D和附录E为规范性附录。本标准由四川省林业和草原局提出并归口。本标准由四川省市场监督管理局批准。本标准起草单位：成都大熊猫繁育研究基地、军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所、江苏大学本标准主要起草人：刘颂蕊、岳婵娟、苏小艳、李运莉、侯蓉、兰景超、杨奎兴、冯娜、张文、燕霞、张东升、张洪文、李林、范雪阳是DNA生物合成的一种特殊方式，以RNA为模板，通过反转录酶合成DNA。3. 3互补脱氧核糖核酸ComplementaryDNA,cDNA以信使核糖核酸为模板，在反转录酶作用下进行反转录所得到
4、的脱氧核糖核酸。4. 4病原微生物PathogenicMicroorganism指可以侵犯机体，引起感染的微生物。病原微生物指肮毒体、真菌、细菌、螺旋体、支原体、立克次体、衣原体、病毒。5. 5寄生虫Parasite指具有致病性的低等真核生物，为在宿主或寄主体内或附着于体外以获取维持其生存、发育或者繁殖所需的营养或者庇护的一切生物。4主要仪器6. 1低温冰箱。6.2 生物安全柜。6.3 超净工作台。6.4 涡旋振荡器。6.5 可调微量加样枪。4. 6高速离心机。4.7 PCR仪。4.8 电泳仪。4.9 凝胶成像系统。4.10 恒温培养箱。4.11 恒温摇床。4.12 生物显微镜。4. 13水浴
5、锅。4.14高压灭菌锅。5病原检测项目5.1 病原微生物5.1.1 必须检测项目犬瘟热病毒CanineDistemperVirus猫泛白细胞减少症病毒FelinePanleukopeniaVirus轮状病毒Rotavirus金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus侵袭性大肠杆菌EntermvasiveE.coli布氏杆菌Brucella5.1.2 必要时补充检测项目犬腺病毒CanineAdenovirus犬冠状病毒CanineCoronavirus乙型脑炎病毒EncephalitisBVirus肺炎克雷伯菌KlebsiellaPneutnoniae5.2 寄生虫5.2.1 必须检
6、测项目巴贝斯虫Babesia西氏贝蛔虫Baylisascarisschroederi蟀虫Ixodidae5.2.2 必要时补充检测项目隐抱子虫Cryptosporidiutn蠕形蜻Demodex弓形虫Toxoplasmagondii6病原检测方法6.1病原微生物犬瘟热病毒，检测核酸，方法见附录A；轮状病毒，检测核酸，方法见附录B；猫泛白细胞减少症病毒，检测核酸，方法见附录C；犬腺病毒，检测核酸，方法见DB51/T171072013；犬冠状病毒，检测核酸，方法见DB51/T1710.4-2013；乙型脑炎病毒,检测核酸，方法见DB51/T1710.18-2016；金黄色葡萄球菌，检测核酸和病原菌
7、，方法见DB5141710.16-2013；侵袭性大肠杆菌，检测核酸和病原菌，方法见DB51/T1710.5-2013；布氏杆菌，检测抗体，方法见GB/T18646-2018；肺炎克雷伯菌，检测核酸和病原菌，方法见DB51”1710.14-2013；6.2寄生虫巴贝斯虫，检测核酸和显微镜观察，方法见附录D；西氏贝蛔虫，检测核酸和显微镜观察，方法见附录E；隐胞子虫，检测核酸和显微镜观察，方法见DB51/T2389-2017；蟀虫，显微镜观察，方法见DB51/T1710.9-2013；蠕形蜻，显微镜观察，方法见DB51T1710.102013;弓形虫，检测核酸和显微镜观察，方法见DB51/T238
8、7-2017。7病原检测规则7.1采样方式样品的采集、运输和保存按照SN/T2123-2008出入境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范执行。按照病原检测（病毒、细菌、寄生虫）所需样品要求联合取样。在行为训练条件下非麻醉或者麻醉状态下采集大熊猫的粪便、肛拭子、口咽拭子、鼻拭子、血液、毛发或皮屑、乳汁或胸腹水等样本。7. 2送检要求样品和样品送检单需尽快送达实验室，如实、详细填写样品送检单上的动物信息（个体谱系号或呼名）、样品名称、采样日期、数量、检测项目等内容。如不能立即送检，则样品需根据不同的检测项目选择相应的保存方式。检测病原核酸的样本应保存在-20C或-80C冰箱内，细菌培养和寄生虫镜检
9、样品需4保存，在48h内送检。8结果判定及结论根据使用的试剂及方法说明，进行结果判断；未见阳性结果，判断为阴性结果；出现阳性或可疑结果时，应在使用一个疗程药物治疗或间隔2个潜伏期后进行二次检测，二次检测结果为阳性或可疑结果时判定为阳性。根据检测结果出具检测报告，检测报告应包括动物信息、样本信息、检测方法、检测结果和结论。9废弃物处理废弃物处理按照GB/T19489-2008实验室生物安全通用要求7.19执行。附录A(规范性附录)大熊猫犬瘟热病毒反转录RT-PCR检测方法A.1样品采集与处理样本为大熊猫的口咽拭子或新鲜粪便，采集后立即送至实验室进行病原检测。样品的采集、运输和保存按照SN/T21
10、23-2008出入境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范执行。A.2待测样品RNA提取及反转录将样品按照病毒RNA提取试剂盒的操作说明提取RNA,反转录为CDNAo反转录体系见表AJo表A.1犬瘟热病毒的反转录体系组分加入体积(L)总RNA28AMVBuffer10IOMmdNTP7RandomPrimer(N9N6)1Oligod(T)Primer1AMVreversetranscriptase2RRI1total5()室温孵育Iomin,42C水浴lL5hA.3RT-PCR反应引物参照地方标准引物上游引物(5,-3,)：Cgagtctttgagatagggtt下游引物(5,-3,)：Cct
11、ccaaagggttcccatgaA.4对照设立阳性对照：取己知犬瘟热病毒阳性CDNA作为阳性对照；阴性对照：以灭菌双蒸水作为阴性对照。A.5RT-PCR反应体系及条件A.5.1RT-PCR反应体系见表A.2o表A.2犬瘟热病毒的RT-PCR反应体系组分加入体积(L)上游引物1下游引物1cDNA模板2ddH2O8.5总体系25A.5.2RT-PCR反应条件95预变性3min后循环开始，95变性30s,50C退火30s,72C延伸1min,共35个循环，72最后延伸7minoA.5.3RT-PCR扩增产物大小产物大小：454bpoA.5.4RT-PCR扩增产物检测取PCR扩增反应结束后的产物，经
12、1.2%琼脂糖凝胶电泳检测(120V,30min),通过凝胶成像系统观察结果。A.6结果判定阳性对照出现454bp的目的片段，阴性对照无条带，实验成立；待检样品出现454bp目的片段时判定犬瘟热病毒阳性；未出现454bp目的片段时，判定犬瘟热病毒阴性。附录B(规范性附录)大熊猫轮状病毒反转录RT-PCR检测方法7.1 样品采集与处理样本为大熊猫的肛拭子或新鲜粪便样品，采集后立即送至实验室进行病原检测。样品的采集、运输和保存按照SN/T2123-2008出入境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范执行。7.2 待测样品RNA提取及反转录将样品按照病毒RNA提取试剂盒的操作说明提取RNA,反转录为C
13、DNAo反转录体系见表B.lo表B.1轮状病毒的反转录体系组分加入体积(L)总RNA28AMVBuffer10IOMmdNTP7RandomPrimer(N9N6)1Oligod(T)Primer1AMVreversetranscriptase2RRI1total50反应程序：3745min,855s,4保存。7.3 RT-PCR反应引物上游弓I物(5,3)：Tggtattgaatataccacaat下游弓I物(5y)：Aaggatggcccacaggatcag7.4 对照设立阳性对照：取已知轮状病毒阳性质粒CDNA作为阳性对照；阴性对照：以灭菌双蒸水作为阴性对照。7.5 RT-PCR反应体系
14、及条件7.5.1 RT-PCR反应体系见表B.2o表B.2轮状病毒的PCR反应体系组分加入体积(L)上游引物1下游引物1cDNA模板2ddH2O8.5总体系257.5.2 RT-PCR反应条件95预变性5min后循环开始，94变性30s,55退火30s,72延伸30s,共30个循环，72最后延伸10mino7.5.3 RT-PCR扩增产物大小产物大小：340bpo7.5.4 RT-PCR扩增产物检测取PCR扩增反应结束后的产物，经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测(120V,30min),通过凝胶成像系统观察结果。7.5.5 判定阳性对照出现340bp的目的片段，阴性对照无条带，实验成立；待检样品出现
15、34ObP目的片段时,判定轮状病毒阳性；未出现340bp目的片段时，判定轮状病毒阴性。上游引物1下游引物1cDNA模板2ddH2O8.5总体系257.5.6 RT-PCR反应条件95预变性5min后循环开始，94变性30s,55退火30s,72延伸30s,共30个循环，72最后延伸10mino7.5.7 RT-PCR扩增产物大小产物大小：340bpo7.5.8 RT-PCR扩增产物检测取PCR扩增反应结束后的产物，经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测(120V,30min),通过凝胶成像系统观察结果。7.6 结果判定阳性对照出现340bp的目的片段，阴性对照无条带，实验成立；待检样品出现34ObP目的
16、片段时,判定轮状病毒阳性；未出现340bp目的片段时，判定轮状病毒阴性。上游引物0.5下游引物0.5DNA模板1ddH2O8总体系20NSl基因内套反应体系见表C.2。表C.2NSI基因内套反应体系组分加入体积(L)2TaqPCRMastermix10上游引物0.8下游引物08DNA模板0.4ddH2O18总体系30VPl基因外套反应体系见表C.3。表C.3VPl基因外套反应体系组分加入体积(L)2TaqPCRMastermix10上游引物0.5下游引物0.5DNA模板1(JdH2O8总体系20VPl基因内套反应体系见表C.4。表C.4VPl基因内套反应体系组分加入体积(L)2TaqPCRMa
17、stermix12上游引物0.8下游引物08DNA模板().5CldH2O15.9总体系30NSl基因外套：95预变性5min后循环开始，95变性30s,53.6C退火30s,72C延伸50s,共31个循环，72最后延伸5mioNSl基因内套：95C预变性5min后循环开始,95C变性30s,58.6C退火30s,72延伸40s,共31个循环，72最后延伸5min。VPl基因外套：95预变性5min后循环开始，95变性30s,55.5C退火40s,72延伸Imin,共31个循环，72最后延伸7111m。VPl基因内套：95预变性5min后循环开始，95变性30s,60.5C退火30s,72C延
18、伸50s,共31个循环，72最后延伸5mineC.5.3产物大小NSl基因产物大小：435bpoVPl基因产物大小：607bpoC.5.4PCR扩增产物检测取PCR扩增反应结束后的产物，经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测(120V,30min),通过凝胶成像系统观察结果。C.6结果判定NSl基因检测阳性对照出现435bp的目的片段，阴性对照无条带，实验成立；VPl基因检测阳性对照出现607bp的目的片段，阴性对照无条带，实验成立；待检样品同时出现435bp、607bp目的片段时，判定猫泛白细胞减少症病毒PCR检测阳性；未出现435bp、607bp目的片段时，判定猫泛白细胞减少症病毒PCR检测阴性；仅
19、出现一个目的条带时，判定猫泛白细胞减少症病毒PCR检测疑似阳性,经基因测序后以测序比对结果为准。NSl基因外套：95预变性5min后循环开始，95变性30s,53.6C退火30s,72C延伸50s,共31个循环，72最后延伸5mioNSl基因内套：95C预变性5min后循环开始,95C变性30s,58.6C退火30s,72延伸40s,共31个循环，72最后延伸5min。VPl基因外套：95预变性5min后循环开始，95变性30s,55.5C退火40s,72延伸Imin,共31个循环，72最后延伸7111m。VPl基因内套：95预变性5min后循环开始，95变性30s,60.5C退火30s,72
20、C延伸50s,共31个循环，72最后延伸5mineC.5.3产物大小NSl基因产物大小：435bpoVPl基因产物大小：607bpoC.5.4PCR扩增产物检测取PCR扩增反应结束后的产物，经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测(120V,30min),通过凝胶成像系统观察结果。C.6结果判定NSl基因检测阳性对照出现435bp的目的片段，阴性对照无条带，实验成立；VPl基因检测阳性对照出现607bp的目的片段，阴性对照无条带，实验成立；待检样品同时出现435bp、607bp目的片段时，判定猫泛白细胞减少症病毒PCR检测阳性；未出现435bp、607bp目的片段时，判定猫泛白细胞减少症病毒PCR检测阴性
21、；仅出现一个目的条带时，判定猫泛白细胞减少症病毒PCR检测疑似阳性,经基因测序后以测序比对结果为准。D.2.3对照设立阳性对照：取己知巴贝斯虫阳性质粒DNA作为阳性对照;阴性对照：以灭菌双蒸水作为阴性对照。D.2.4PCR反应引物根据巴贝斯虫18SrRNA基因序列设计以下引物：上游引物(5-3，)：Gtcttgtaattggaatgatgg下游弓I物(5，-3，)：TagtttatggttaggactacgD.2.5PCR反应体系及条件D.2.5.lPCR反应体系见表D.lo表D.1巴贝斯虫PCR反应体系组分加入体积(L)2TaqPCRMastermix12.5上游引物LO下游引物LODNA模
22、板2.0CidH2O8.5总体系25.0D.2.5.2PCR反应条件95预变性5min后循环开始，95变性30s,56退火30s,72延伸30s,共35个循环，72最后延伸10minoD.2.6PCR扩增产物大小产物大小：465bpoD.2.7PCR扩增产物检测取PCR扩增反应结束后的产物，经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测(120V,30min),通过凝胶成像系统观察结果。D.3结果判定阳性对照出现465bp的目的片段，阴性对照无条带，实验成立；待检样品出现465bp目的片段时,判定巴贝斯虫阳性；未出现465bp目的片段时，判定巴贝斯虫阴性。附录E（规范性附录）大熊猫西氏贝蛔虫检测方法E.1粪便检
23、查E.1.1样本采集收集大熊猫新鲜粪便，放置4。C保存待用。E.1.2漂浮法A）漂浮法使用的溶液配制：将氯化钠或者硫酸镁缓慢加入盛有沸水的容器内，搅拌，直至氯化钠或者硫酸镁不再溶解为止，冷却后盛装，备用；B）用竹签挑取黄豆粒大小的粪便于圆形直筒瓶（高约3.5cm,直径2cm）中；C）加入饱和盐水或者硫酸镁水，当液面接近瓶口时改用滴管滴加，使液面略高于瓶口又不溢出为止；D）在瓶口覆盖载玻片，静止15min20min后镜检。E.1.3改良加藤厚涂片法A）透明液配制：量取蒸储水和纯甘油各IOOmL,混合后，再加入3%孔雀绿或亚甲基蓝1mL,储瓶备用；B）取亲水玻璃纸（25mmx40mmx40m）放入
24、透明液中浸泡24h以上即可使用；C）将尼龙绢片（8CmX8cm）置于粪便标本上，使粪渣通过尼龙绢片滤出至表面；D）将定量板小孔朝上置于载玻片中部；E）垂直向上移去定量板，取1张浸泡好的玻璃纸盖在粪样上，用一张载玻片盖于玻璃纸上,使粪便均匀展开至玻璃纸边缘；F）静置0.5hlh后镜检，记录观察到的全部虫卵数。E.2大熊猫西氏贝蛔虫的PCR检测E.2.1样本采集样本为大熊猫粪便样品，采集后立即送至实验室进行检测。样品的采集、运输和保存按照SN/T2123-2008出入境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范执行。E.2.2待测样本DNA的提取与保存按照DNA提取试剂盒的操作说明提取样本DNA,冻存于
25、.80冰箱备用。E.2.3对照设立阳性对照：取已知西氏贝蛔虫阳性质粒DNA作为阳性对照；阴性对照：以灭菌双蒸水作为阴性对照。E.2.4PCR反应引物根据西氏贝蛔虫线粒体12SrRNA基因序列设计以下引物:上游弓I物（53D：Ttttaccttggcattttgtc下游弓I物（53D：CtctcaattactactcaacctccE.2.5PCR反应体系及条件E.2.5.1PCR反应体系见表EJo表E.1西氏贝蛔虫PCR反应体系组分加入体积(L)2TaqPCRMastermix12.5上游引物1.0下游引物1.0DNA模板2.0CldH2O总体系8.525.0E.2.5.2PCR反应条件95预变性5min后循环开始，95变性30s,50退火30s,72C延伸30s,共35个循环，72最后延伸10minOE.2.6PCR扩增产物大小产物大小:291bpoE.2.7PCR扩增产物检测取PCR扩增反应结束后的产物，经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测(120V,30min),通过凝胶成像系统观察结果。E.3结果判定阳性对照出现291bp的目的片段，阴性对照无条带，实验成立；待检样品出现291bp目的片段时,判定西氏贝蛔虫阳性；未出现291bp目的片段时，判定西氏贝蛔虫阴性。
