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1、PCR常见问题、原因分析及其对策,PCR技术简介,PCR常见问题、原因分析及其解决方案,提高PCR反应特异性的策略,临床PCR检测的常见问题,定量PCR常见问题,PCR标准反应体系,DNA模板 引物 反应缓冲液 Mg 2浓度 dNTPs dH2O 耐热聚合酶,反应体系对PCR扩增的影响,DNA模板,纯 度 蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制PCR反应完整性 模板降解会导致PCR扩增无产物浓 度 加量过多导致非特异性扩增增加,引 物,特异性 长度适当、避免二级结构和二聚体完整性 避免反复冻融浓 度 应适当,过高导致非特异性增加, 过低则扩增产物 太少,反应体系对PCR扩增的影响,过高非特异性严重过低无
2、扩增产物,浓度适当避免反复冻融,H值适当避免污染,H值,盐离子浓度稳定剂,增强剂,反应缓冲液,dNTPs,dH2O,Mg 2浓度,如何选择最合适的DNA聚合酶,PCR用耐热DNA聚合酶,Taq酶,fu酶,Hotstart Taq酶,混合酶,Taq plus,Long Taq,Taq platinum,特异性-基因组扩增、RT-PCR,保真性-基因筛选、测序、克隆,长片段扩增-构建基因图谱、测序等,扩增效率-复杂模板扩增（GC含量高、二级结构）,PCR试剂盒-复杂模板扩增、大规模基因检测,如何选择最合适的DNA聚合酶-根据PCR实验需求,PCR常见问题之一-无扩增产物,现象：正对照有条带，而样品
3、则无,M 1 2 正对照,原因,模板含有抑制物，含量低Buffer对样品不合适引物设计不当或者发生降解反应条件：退火温度太高，延伸时间太短,纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量更换Buffer或调整浓度重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物降低退火温度、延长延伸时间,对策,PCR常见问题之二-非特异性扩增,现象： PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。,原因,对策,引物特异性差模板或引物浓度过高酶量过多Mg2+浓度偏高退火温度偏低循环次数过多,重新设计引物或者使用巢式PCR适当降低模板或引物浓度适当减
4、少酶量降低镁离子浓度适当提高退火温度或使用二阶段温度法减少循环次数,PCR常见问题之三-拖尾,现象：产物在凝胶上呈Smear状态,M 1 2,原因,对策,模板不纯Buffer不合适退火温度偏低酶量过多dNTP、Mg2+浓度偏高循环次数过多,纯化模板更换Buffer适当提高退火温度适量用酶适当降低dNTP和镁离子的浓度减少循环次数,PCR常见问题之四-假阳性,现象：空白对照出现目的扩增产物,原因,靶序列或扩增产物的交叉污染,对策,操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。各种试剂最好先进行
5、分装，然后低温贮存。,提高PCR反应特异性策略,巢式PCR（Nest-PCR）,递减PCR（TouchDown PCR）,热启动PCR（HotStart PCR）,使用PCR增强剂,策略之一巢式PCR,PR1,PF2,PR2,巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同多套引物都互补的靶序列很少。 巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5 RACE）的特异性。,策略之二递减PCR,递减PCR通过在PCR的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm高大约5的退火温度下开始，然后每个循环降低1-2,直到退火温度低于Tm 5。特异
6、性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用，如AFLP、DNA指纹分析等。,策略之三热启动PCR,热启动主要是通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR 仪达到变性温度；现在有很多公司都有HotStart Taq酶出售，该酶具有热启动的性能，使用简单方便，适合于高通量应用；热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。,策略之四使用PCR增强剂,甲酰胺、DMSO、甘油、甜菜碱等都可充当PCR的增强剂。其可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结
7、构区。增强剂浓度要适当。,荧光定量PCR常见问题,荧光定量PCR扩增效率确认：,相关系数（R2）：大于0.98标准曲线斜率：-3-3.5PCR扩增效率（E）：0.91.2重复性好：STD 0.2特异性好,荧光定量PCR常见问题,无Ct值（信号）出现或出现过晚：,阴性对照出现明显的扩增：,荧光PCR mix或水污染；出现引物二聚体：设计特异性引物。,反应循环数不够；检测荧光信号步骤有误；引物、探针设计不佳或降解；模板量少或降解。反应条件或体系不佳：优化；扩增片段过长：100200bp。,荧光定量PCR常见问题,溶解曲线不止一个主峰：,引物设计不佳：设计特异性引物；引物浓度不适：降低引物浓度；退火
8、温度低：调整退火温度；镁离子浓度过高：降低镁离子浓度；模板中有基因组污染：注意提取过程；耗材仪器不匹配；反应体系污染等：设置阳性阴性对照。,荧光定量PCR常见问题,扩增效率低：,重复性不好：,反应体系中部分成分尤其是荧光染料降解； 反应条件不佳：延长退火、延伸时间，改为三步法， 降低退火温度，提高引物浓度，重新设计引物； 反应体系中有抑制物：一般为模板引入。,加样不准确； 仪器温度均一性不好； 模板浓度低。,荧光定量PCR常见问题,扩增曲线不正常：,基线等设置不当：减小基线终点；模板量过多：将模板稀释。,临床PCR检测的常见问题,假阳性问题,假阴性问题,定量问题,方法学问题：靶基因序列特异性、
9、引物错配、非特异性扩增 污染问题：样本污染、产物污染,试剂因素 操作因素 仪器因素 标本因素,外标定量与内标定量,临床PCR检测常见问题解决办法,严格区分及实验人员培训；使用UNG技术。,假阳性解决办法：,假阴性解决办法：,设置阳性对照监测试剂问题；降低操作难度，提高操作人员素质；阳性对照、标准曲线或使用内对照监控仪器故障；使用抗干扰能力强的试剂提取样本DNA。,临床PCR检测常见问题解决办法,外标定量与内标定量：,RT常见问题,RNA降解或起始量少RNA含抑制成分cDNA 5端不全目的基因在组织中不 表达或表达量太低,原因,对策,分离高质量的RNA使用高温逆转录酶，如RT007（BioFlux）使用随机引物或GSP尝试其它组织,问题1：RT-PCR没有产物,六种Taq和MasterMix：Taq、Pfu、HotStart Taq、Taq plus、Long Taq、Taq PlatinumdNTP引物 SP6,Tn7,M13,Super RNase H- Reverse Transcriptase,TA 克隆系统：pBS-T 载体、连接和克隆试剂盒pGM-T 载体、连接和克隆试剂盒pCF-T 、pCF-Blunt 载体、快速连接试剂盒感受态细胞,DNA Marker：22种不同大小的分子量标准,TIANGEN相关产品,
