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1、,油脂生物工程的结晶微生物油脂,21世纪,前言开发生物油脂的重要意义国内外对油脂开发的情况生物油脂简介微生物油脂的产油机理生产工艺及培养步骤生物油脂的利用和展望,前沿,随着石化资源日益枯竭，石油价格的不断上涨石油供求矛盾日渐突出，寻找和开发石化资源的替代能源具有重要的战略意义。而现在科研工作者将生物柴油作为新一代替代物。它主要是利用微生物油脂生产的。生物柴油是重要的液体可再生能源产品之一，其化学成分主要是甲醇（或乙醇），可以代替全部或部分石化柴油，生物柴油具有能量密度高，润滑性好，储运安全，抗爆性好，燃烧充分等优良使用性能和再生性，环境友好性特点。目前,国际上生产生物柴油的原料仍以植物油为主,
2、 原料成本占总生产成本的70%85%, ，这严重地制约了生物柴油的产业化进程。一些微生物菌体油脂含量超过其细胞干重的70%,因此利用微生物油脂为原料制备生物柴油在未来生物柴油产业中将发挥重要作用。,开发微生物油脂的意义,微生物油脂资源是可无限再生产的资源。而石油的开采量仅供人类50年的使用。因此，石油化工产品逐渐向油脂化学产品转移也是必然的。通过微生物发酵，把农副产品及其食品工业的造纸工业中产生的废弃物都可加以利用，同时还保护了环境。生产微生物油脂不受场地、不受季节和气候变化，不受原料生产的影响，一年四季除设备维修外，都可连续生产。随着人口的增加，人们对油腊的需求量逐年增长，微生物油脂可以弥补
3、不足。具有功能性，从丝状真菌中提取富含多不饱和脂肪酸 如r一亚麻花生四烯酸、EPA、DHA等保健微生物油脂。,不饱和脂肪酸的作用,1.调节血脂 高血脂导致高血压、动脉硬化、心脏病、脑血栓、中风等疾病的主要原因，鱼油里的主要成分EPA和DHA，能降低血液中对人体有害的胆固醇和甘油三脂；能有效地控制人体血脂的浓度；并提高对人体有益的高密度脂蛋白地含量。维持低浓度血脂水平对保持身体健康，预防心血管疾病、改善内分泌都起着关键的作用。 2.清理血栓 降低血液黏稠度，增进红细胞携氧的能力。鱼油中的EPA，还有防止血小板粘连、凝聚的功能，因此它可以有效防止血栓的形成，预防中风。 3.免疫调节 补充EPA、D
4、HA。可以增强机体免疫力，提高自身免疫系统战胜癌细胞的能力。日本的研究发现鱼油中的DHA能诱导癌细胞“自杀”。,4.维护视网膜提高视力 补充足够的DHA对活化衰落的视网膜细胞有帮助，对用眼过度引起的疲倦、老年性眼花、视力模糊、青光眼、白内障等疾病有治疗作用。DHA可提供视觉神经所需营养成分，并防止视力障碍。 5.补脑健脑 DHA是大脑细胞形成发育及运动不可缺少的物质基础。人有记忆力、思维功能都有赖于DHA来维持和提高。补充DHA可促进脑细胞充分发育，防止智力下降，健忘及老年痴呆等。 6.改善关节炎症状减轻疼痛 Omega-3系列不饱和脂肪酸可以辅助形成关节腔内润滑液，提高体内白细胞的消炎杀菌的
5、能力，减轻关节炎症状，润滑关节，减轻疼痛。,国内利用微生物生产多不饱和脂肪酸油脂是从上世纪80年代末开始的。1988年上海工业微生物研究所利用M102菌株进行发酵生产-亚麻油酸，含量为8.0%。1993 年南开大学生物系用深黄被孢霉为出发菌株, 经紫诱变后,在发酵生产- 亚麻酸, 菌体得率为29.3%, 油脂含量达44.7%, 其中- 亚麻酸含量达9.44%。武汉烯王生物工程有限公司曾于2000年引进中国科学院等离子体物理研究所的花生四烯酸高产菌发酵技术, 在50 t 罐生产时, 花生四烯酸含量在50%以上, 干菌体得率超过3%, 总油脂超过30%。2003 年施安辉等通过对粘红酵母GRL51
6、3 生产油脂的研究发现, 最终油脂产量可达菌体干重的67.2%,国外对于微生物油脂的研究工作起步较早,早在第一次世界大战前, 德国科学家就曾试图利用酵母、单细胞藻类和菌类生产油脂, 以缓解当时食用油脂供应不足的状况, 后因战争爆发而中止研究。在20 世纪40 年代, 人们发现了高产油脂的斯达凯依酵母、粘红酵母、曲霉属及毛霉属。1986 年, 日本和英国首先推出了含- 亚麻酸(GLA) 微生物油脂的保健食品、功能性饮料、高级化妆品等。20 世纪90 年代以后, 特种油脂的发展愈来愈受重视, 研究人员相继从丝状真菌、细菌、酵母和微藻类中,开发了能生产许多特种油脂的菌种, 并取得突破, 为进一步形成
7、生产力提供了技术依据。,微生物油脂（microbial oils）又称单细胞油脂（single cell oil，SCO），是由酵母、霉菌、细菌和藻类等微生物在一定条件下利用碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂为碳源、氮源、辅以无机盐生产的油脂和另一些有商业价值脂质。在适宜条件下, 某些微生物产生并储存的油脂占其生物总量的 20%以上, 具有这样表型的菌株称为产油微生物。具有潜在商业化价值，可应用于营养保健品、药物、水产养殖饲料和生物柴油原料等方面。,微生物生产油脂的特点,(1)微生物生长周期短，生长繁殖快，代谢活力强。适应性强，易于培养和品种改良。(2)微生物产油脂所需劳动力低，占地面积小，且不
8、受场地、气候和季节变化等的限制能连续大规模生产。(3)微生物生长所需原材料来源丰富且便宜，可利用农副产品、食品加工及造纸业的废弃物(如乳清、糖蜜、木材糖化液等)为培养基原料，十分有利于废物再利用和环境保护。(4)微生物油脂的生物安全性好。(5)不同的菌株和培养基的产品构成变化较大，适合开发一些功能性油脂，如富含油酸、一亚麻酸、AA、EPA、DHA、角鲨烯、二元羧酸等的油脂以及代可可脂。(6)微生物油脂组成和植物油脂相似，可替代植物油脂制取生物柴油，降低生物柴油制取成本。,微生物油脂和成途径,微生物油脂积累大体分为两个阶段.发酵培养的前期为细胞增殖期,这个时期微生物要消耗培养基中的碳源和氮源,以
9、保证菌体代谢旺盛和增殖过程.在这一阶段中细胞和合成油脂,但主要用于细胞骨架的组成,即以体质脂形式存在.当培养基中碳源充足而某些营养成分缺乏是,菌体细胞分裂速度锐减,微生物基本不再进行细胞繁殖,而过量的碳元素继续被细胞吸收,在细胞中经糖酵解途径进入三羧酸循环,同时甘油三酯的积累过程被激活.,产生机制,微生物产生油脂的过程本质上与动植物产生油脂的过程相似, 都是从利用乙酰CoA 羧化酶的羧化催化反应开始, 经过多次链的延长及经去饱和酶的一系列去饱和作用等, 完成整个生化过程。其中去饱和酶是微生物通过氧化去饱和途径生成不饱和脂肪酸的关键酶, 该过程称之为脂肪酸氧化循环。,乙酰CoA 羧化酶和去饱和酶
10、是两个主要的催化酶。 乙酰CoA 羧化酶催化脂肪酸合成的是一种限速酶, 此酶是由多个亚基组成的以生物素作为辅基的复合酶。 乙酰CoA 羧化酶结构中有多个活性位点, 如乙酰CoA 结合位点、ATP 结合位点、生物素结合位点等。因此该酶能为乙酰CoA、ATP 和生物素所激活。另外,丙酮酸盐对该酶有轻微的激活作用, 磷酸盐对该酸的活性有较低程度的抑制作用。 去饱和酶是微生物通过氧化去饱和途径生成不饱和酸的关键酶, 去饱和作用是由一个复杂的去饱和酶系来完成的。,微生物油脂的制备工艺,菌种筛选原料灭菌菌体培养菌体收集预处理油脂提取精炼成品油脂,菌种的筛选,能够产生油脂的的微生物有酵母、霉菌、细菌、藻类。
11、目前研究的较多的是酵母、霉菌、藻类，能够产生油脂的细菌则较少。不同的菌种，产生微生物的油脂脂肪酸组成均不同。产脂细菌:嗜酸乳杆菌产脂霉菌:深黄被孢霉，高山被孢霉，卷枝毛霉，嗜酸乳杆菌，米曲霉，土曲霉雅致枝霉 三孢布拉氏霉等产脂酵母:假丝酵母，浅白色隐球酵母，胶粘红酵母，产油油脂酵母等产制藻类:盐生杜氏藻，粉核小球藻，等鞭金藻，三角和指藻，新月菱形藻等,菌种的筛选,用于工业化生产油脂的菌株必须具备以下条件: 油脂积蓄量大, 含油量应达50%左右, 油脂生成率高, 转化率不低于15%能适应工业化深层培养, 装置简单生长速度快, 杂菌污染困难风味良好、食用安全无毒、易消化吸收,细菌生产油脂,细菌是最
12、简单,最小的微生物细胞.大多数产油细菌在高葡萄糖时产生不饱和的甘油三脂,但大多数细菌不产生甘油三酯而是积累复杂的脂类.加之产生于细胞外膜上,提取困难,因此产油细菌无工业意义。,霉菌和酵母生产油脂,霉菌和酵母被认为是良好的产油微生物.从80年代开始,大量的研究报道就集中到了霉菌和酵母。霉菌中脂肪酸类型比酵母丰富很多。大多数霉菌油脂含量在20%-25%之间.美霉菌主要用于生产高比列的不饱和脂肪酸。同时需注意的是,不同霉菌的脂肪酸的组成有很大差别。,酵母在脂肪酸的分布模式上相当单一,绝大多数仅有C16和C18脂肪酸,与许多植物油脂相似,其中基本的饱和脂肪酸是软脂酸,基本的不饱和脂肪酸是油酸,也有少数
13、含有单不饱和脂肪酸棕榈油酸,多不饱和脂肪酸也存在于酵母中.酵母中油酸含量一般丰富。产油酵母能在各种碳源上生长良好, 如蔗糖,糖蜜,乳糖等。酵母转化碳水化合物为油脂的理论33%,但实际有20%左右,虽然数值上看很低,但在所有生物油脂生产中已经很高了。,菌体的培养,微生物油脂的培养原料：碳源：葡萄糖、果糖、蔗糖、石蜡等氮源有铵盐、尿素、玉米浆、硝盐等无机盐类有氯化钾、硫酸镁以及铁、锌等离子 另外，食品工业的废弃物，如淀粉厂的废水、糖厂的废糖蜜、乳品厂的乳清等，也是产油微生物的好原料。,菌体的培养,微生物培养可采用液体培养法、固体培养法和深层培养法。,培养过程影响微生物油脂积累的因素,不同种属的微生
14、物产油脂量,油脂成分及含量各不相同。而就同一种微生物菌株,在不同培养条件下,其产油脂量,油脂成分及含量也各不相同。产油菌种是生产微生物油脂的关键,而培养基组成,培养时间,温度,PH值等,又是影响各类菌种油脂得率的重要因素,必须综合考虑。,碳源和氮源对菌体产油脂的影响,碳源是微生物产油脂的一个关键因素, 当培养基中碳源充足而其它营养成分缺乏时, 微生物菌株会将过量的碳水化合物转化为脂类。 目前最常用的碳源是葡萄糖, 因为以葡萄糖为碳源可获得更高的菌体生物量, 而且其价格相对于其它碳源更便宜, 有利于降低成本。 氮源的主要作用是促进细胞的生长, 高C/N 有利于菌体生长, 低C/N有利于油脂的积累
15、, 此外氮源的种类也会影响油脂的积累。,培养时间对菌体产油脂的影响,微生物细胞的油脂含量随微生物生长阶段的不同而有显著差异, 如油脂酵母的油脂含量在生长对数期较少, 在生长对数期末期开始急剧增加,至稳定期初期达到最多。培养时间的长短也是一个影响因素, 培养时间不足, 菌体总数少而影响油脂产量; 培养时间过长, 细胞变形、自溶, 合成的油脂进入培养基中难以收集, 同样影响油脂产量。此外, 不同微生物的最佳培养时间也不相同。,温度对菌体产油脂的影响,温度的改变之所以能调节脂肪酸成分, 是由于细胞对外界温度的变化会产生一种适应性反应。通常情况下, 不饱和脂肪酸的熔点比饱和脂肪酸低, 短链脂肪酸的熔点
16、比长链脂肪酸低。因此当菌株从高温转移到低温时, 细胞膜中不饱和脂肪酸及短链脂肪酸含量增加, 主要是棕榈油酸或油酸等含量的增加; 当温度升高时, 平均链长就增长, 有利于细胞膜的正常流动和增强其通透性。, pH 值对菌体产油脂的影响,不同种类的微生物, 产油的最适pH 值也不同。 酵母产油的最适pH 值为3.56.0, 霉菌的为中性至微碱性。构巢曲霉在pH 值为2.87.4 下培养时, 随pH 值上升, 油酸含量增加。油脂酵母培养基的初始pH 值越接近中性, 稳定期菌体的油脂含量越高。在培养过程中不断调整pH 值, 使微生物处于其最适pH 值范围内, 可有效地提高微生物的产油量。,通气量对菌体产
17、油脂的影响,油脂是由基质的糖类还原而成, 当微生物产生油脂时, 必须供给大量氧气, 不饱和脂肪酸的生物合成也需要大量氧气。研究发现, 产油真菌在供氧不足的条件下, 甘油三酯的合成会强烈受阻,并引起磷脂和游离脂肪酸大量积累; 在通气条件下, 游离脂肪酸会部分转化成含有2 个或3 个双键的脂肪酸, 从而使不饱和脂肪酸大量增加。,无机盐对菌体产油脂的影响,对真菌而言, 适当增加无机盐和微量元素的添加量可提高油脂合成速度和产油量。据国外科研杂志报道, 在培养基中适当增加Na, K, Mg 等元素含量, 构巢曲霉的油脂积累量可25%26%提高到50%51%。日本长沼等人员研究证明, 在培养基中适当增加F
18、e, Zn 离子, 可加速产油微生物对油脂的合成, 但添加量不宜太大, 否则会严重阻碍真菌对油脂的合成。,光照周期和强度,对自养型藻类是靠光合作用来合成有机物质的，因此控制光照周期和光照强度，不仅能提高藻类的油脂产量，还可以控制不饱和脂肪酸含量。,菌体的预处理,微生物油脂属于胞内产物, 有些油脂与蛋白质或糖类呈结合态存在, 由于细胞壁较坚韧, 所以在用有机溶剂浸提前须对菌体细胞进行预处理。预处理方法主要有掺砂共磨法( 将菌体与砂子一起进行研磨) 、与盐酸共煮法( 与稀盐酸共煮使细胞壁分解, 有利于获得油) 、菌种自析法( 让菌体在50 下保温23 d) 、蛋白质溶剂变性法( 用乙醇或丙醇使结合
19、蛋白质变性) 、反复冻融法( 通过反复冻融的过程来破坏细胞壁) 、超声波破碎法( 通过超声波高频振动产生的空穴效应达到破壁的目的) 等方法。其中, 掺砂共磨法较接近传统植物油脂的前处理工艺, 常用于工业化生产微生物油脂。反复冻融、超声波破碎等方法适用于实验室小型操作。,油脂的提取,用于油脂浸提的溶剂应该能使全部油脂物质溶解, 而且要求有足够的极性使其与细胞膜、脂蛋白等连接键被破坏。用于油脂浸提的溶剂主要有乙醚、异丙醚、氯仿、乙醚- 乙醇、石油醚、氯仿-甲醇等。往往由于磨碎的微生物干菌体颗粒较细, 溶剂渗透性极差, 混合油不易浸出, 因此在浸提前可对干菌体进行造粒处理, 这样可提高浸出设备的利用
20、率。,研究人员常采用的油脂提取方法酸热法、索氏提取法、超临界CO2 萃取法、有机溶剂法。索氏法是油脂提取中最常用的方法, 该方法油脂得率最高, 但耗时较长, 且样品需先经烘干处理, 样品的需要量也大。超临界CO2 萃取法因其可在常温下操作, 具有有效防止提取物氧化分解、无溶剂残留、安全性高等特点, 所以在生理活性物质的提取、分离上已得到广泛应用,酸热法主要是利用盐酸对细胞壁中糖及蛋白质等成分的作用, 使原来结构紧密的细胞 壁变得疏松, 再经沸水浴及速冻处理, 使细胞壁进一步被破坏, 从而有效地浸提出细胞中的油脂。,微生物油脂的分析,目前, 常用的油脂定性分析法主要是苏丹黑染色法通常采用苏丹黑染
21、色测吸光度绘制标准曲线法和索氏提取重量差法求油脂得率。 最近有报道以Nile blue 或Nile red 为染色剂测吸光度更有利于确定胞内油脂的含量。,也可利用气质联用仪在线检测, 即在待测样品的酯化菌体油脂中加入5%KOH甲醇溶液封管水解, 加入14%BF3 甲醇溶液封管甲酯化, 再加饱和NaCl 溶液分层, 以石油醚提取,用无水硫酸钠干燥, 将溶剂挥发后进样测定。,微生物油脂组成成分,微生物的油脂跟动植物类似,以两种形式存在,一种是体质脂形式,作为细胞的结构组成部分存在于细胞中,在微生物中含量十分恒定,如细胞膜上的磷脂;另一种形式是储存脂形式,油脂在微生物细胞内以脂肪粒或脂滴形式存在于细
22、胞质中。微生物油脂中甘油三酯占95%,其他脂质约占10%。,微生物油脂的精炼,微生物油脂的精炼工艺主要包括水化脱胶、碱炼、脱色、脱臭等工序。精炼后的油脂其分析指标包括：气味和滋味、色泽、水分、比重、透明度、酸价、碘价、过氧化值、脂肪酸组成、甘油三酯组成等。,微生物油脂的应用,食品工业微生物油脂可以作为食品强化剂、添加剂等应用于食品工业。奶与奶制品从被孢子霉属真菌油脂中提取的亚麻酸，添加到奶或者奶粉中，可以提高奶或奶粉的营养价值，使其接近母乳。比如亨氏公司、贝因美、飞鹤乳业、银桥乳业等知名乳品企业生产的奶粉类产品中已经添加武汉福星生物药业有限公司生产的富含AA的微生物油脂。,冷冻糕点如雪糕等都含
23、有一定量的油脂，油脂既是油脂源又能形成产品的质构和口感。使用富含亚油酸的微生物油脂作为糕点的油脂来源，可使亚油酸和其他活性物质产生协同增效作用，对高血压、动 脉硬化等疾病起到积极预防的效果疾病起到积极预防的效果。,医疗方面 人体缺乏多不饱和脂肪酸将产生某些疾病，而补充多不饱和脂肪酸可预防或治 疗某些疾病。微生物油脂富含多不饱和脂肪酸，具有医疗作用。如一些含不饱和脂肪酸的保健品。,乳化饮料 以富含不饱和脂肪酸的功能性微生物油脂作为油相，用乳糖酶对脱脂乳中的乳糖进行水解，以水解溶液为水相，添加适量的乳化剂，可以制成水包油型的乳化饮料。此乳化饮料可以代替牛乳，既可以预防动脉硬化，也可以避免乳糖不适症
24、。 饲料工业 微生物油脂可作为添加剂应用于虾、蛋鸡等的饲料中微生物油脂的粗制品作为微生物饲料添加剂加入饲料中，可以明显提高畜禽的消化吸收率，改善肉蛋的品质。,能源方面 目前生物柴油主要由动物、植物油脂通过转脂化生产，但动植物油脂日益紧缺，已无法满足人类的需求。 微生物油脂的脂肪酸组成类似植物油脂，如菜籽油、棕榈油和大豆油等，并且富含饱和和不饱和的长链脂肪酸，能够代替食用植物油脂作为生产生物柴油的原料。,随着生物科学技术的发展, 微生物油脂的研究将逐步走向成熟, 尤其是根据各种产油微生物的培养条件及产油机理, 研究微生物混合培养生产油脂, 开发利用微生物油脂进行功能性油脂的生产, 利用工业( 特别是食品工业的) 废水及废气进行微生物培养生产油脂, 利用微生物油脂为生物柴油提供原料油脂等方面的研究具有广阔的应用前景。总之, 微生物油脂的研究技术将成为新世纪油脂工业的一个发展方向, 使油脂行业的加工范围更加广阔, 并将在促进人类保健、解决人类能源题方面起着越来越重要的作用。,
