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1、第三节 外植体（培养物）的建立,1、主要任务：成功的将外植体建立在试管中。2、主要技术环节：（1）、外植体的选择（2）、外植体的消毒（3）、培养基的选择、配制（4）、外植体消毒与接种3、关键问题：（1）、污染（Infection）（2）、褐变（Browning）,第二节 外植体（培养物）的选择,根据细胞全能性学说，植物体的每一个细胞都含有全部的遗传信息，都能再生出一个新植株。但是，要使每个细胞的全能性都表现出来，在目前还是不易做到的事。因而，外植体（初始培养物）的选择非常重要。,1、基因型：再生能力（1）、双子叶单子叶；（2）、被子植物裸子植物；（3）、双子叶植物中：茄科（Solanacea）
2、；秋海棠科（Begoniaceae）；景天科（Crassulaceae）；苦苣苔科（Gesneriaceae）；十字花科（Cruciferae）再生力特强；郁金香（Tulip）再生力较弱。（4）、同一种植物中：活体（in vivo）再生力强者，离体（in vitro）再生力也强。,第二节 外植体（培养物）的选择,杜鹃花 Rhodoendron,第二节 外植体（培养物）的选择,2、根据母株的年龄和生长发育阶段选择：,第二节 外植体（培养物）的选择,2、根据母株的年龄和生长发育阶段选择：,植株的生长与发育,第二节 外植体（培养物）的选择,2、根据母株的年龄和生长发育阶段选择：,第二节 外植体（培养
3、物）的选择,杜鹃花 van Weerden Poelman,第二节 外植体（培养物）的选择,第二节 外植体（培养物）的选择,3、根据时间和季节取材,第二节 外植体（培养物）的选择,3、根据时间和季节取材,第二节 外植体（培养物）的选择,4、根据母株位置选择：,具原基结构的外植体：茎尖、侧芽、原球茎、鳞芽、分生组织,不具原基结构的外植体：根、茎、叶、花、果等器官，需要脱分化。,第二节 外植体（培养物）的选择,第二节 外植体（培养物）的选择,第二节 外植体（培养物）的选择,第二节 外植体（培养物）的选择,第二节 外植体（培养物）的选择,第二节 外植体（培养物）的选择,4、根据外植体的大小选择：,外
4、植体大小,第二节 外植体（培养物）的选择,4、污染（Infection）能否有效地控制微生物污染是植物离体培养是否成功的关键技术之一。对于离体培养的探索性研究实验，污染会导致实验失败；对于大规模的离体繁殖生产来说，污染使生产成本大大增加。因此，无论是科研机构还是生产厂家都十分重视微生物污染问题。植物离体培养中的污染可分为外植体、培养基、无菌操作和培养环境四个方面。其中培养基和无菌操作方面的污染，目前已得到十分有效的控制。外植体方面污染最复杂，也最难控制，其可能是细菌引起的，也可能是真菌引起的；微生物可能是附生性的，也可能是内生性的。近年来，国外较重视各种微生物的鉴定，并根据不同的微生物种类采取
5、相应的控制措施，这方面的研究进展较快。,第三节 外植体（培养物）的建立,（1）、产生污染的因素：外植体：通常多年生的木本材料比一二年生的草本材料带菌多；老的材料比幼嫩的带菌多；田间生长的材料比温室的带菌多；带泥土的材料比清洁的带菌多。一年中以雨季的材料带菌多，一天中以中午阳光最强时的材料带菌少。培养基：高压蒸汽灭菌的温度、压力、时间和正确使用情况，以及过滤灭菌中过滤膜孔径、过滤灭菌器械的灭菌处理、过滤灭菌操作等均影响培养基的灭菌效果。操作环节：接种室是否清洁、干燥、密闭，是否经常用紫外线灯照射、甲醛熏蒸、70酒精喷雾杀菌等，操作是否等熟练。培养环境：培养室要求清洁、密闭。每天用70酒精喷雾除菌
6、、降尘，每周用少量甲醛熏蒸灭菌。如有空气过滤装置效果更好。培养室相对湿度太高时，污染加重。,第三节 外植体（培养物）的建立,（2）、污染的防止：母株保护：保持母株清洁，减少喷灌。温室种植，喷施杀菌（虫）剂，减少病原菌含量。材料选择：选取生长发育健壮，病虫危害少的材料。严格清洗、消毒与无菌操作。小容器、分散接种。,第三节 外植体（培养物）的建立,（3）、污染估算及对策：污染估算：首次接种通常污染率4060%按40%计：接种100个材料1个材料/容器：污染量=100X40%=40获得量=100-40=60。2个材料/容器：2污染：1X40%X40%=16%1污染：2X40%X40%=32%2未污染
7、：60%X60%=36%污染率=100-36=62%污染量=100X62%=62获得量=100-62=48,3 个材料/容器：污染率=100-（60%）3=78.4%污染量=100X78.4%=79获得量=100X（60%）3=214 个材料/容器：获得量=100X（60%）4=135 个材料/容器：获得量=100X（60%）5=8防止污染的对策：小容器、多数量、尽量分散、相互隔离,第三节 外植体（培养物）的建立,（4）、附生菌控制：采用化学杀菌剂可以有效地杀死附生菌，但是一些较特殊的外植体材料，如密披绒毛的叶片或幼果、花芽或带苞片的叶芽，附生菌可能潜伏在外植体上，无法彻底清除。这时，必须采取
8、一些特殊的措施，才能有效控制附生菌。取材来源：从保护条件下生长的植株上取材，可有效地控制微生物污染。保护条件指温室、培养箱、生长室等。从温室、培养箱里取材，可有效减少附生菌的群体数量。从栽培于温室中的植株上取材和从露地取材相比，前者污染率更低。所取植株的生长土壤，是组织培养中的一个重要污染源。如果采用温室栽培，事先应进行土壤灭菌。此外，灌溉水也可能成为污染源。取材于用过滤水和用缄市饮用水灌溉的植株，前者大大降低了微生物污染.材料预处理：在对外植体进行常规化学灭菌之前，对特殊材料进行特殊预处理，可以收到很好的效果。例如，在对密披绒毛的枇杷幼果进行灭菌之前，先把绒毛刮去，灭菌效果很好。对于密披绒毛
9、的叶片，可先连枝带叶放在自来水下冲洗，去除污物后，用0.5Tween20浸1h（其间换新鲜液23次），然后进行常规灭菌，就可起到彻底杀菌的作用。对兰花花芽常规灭菌之前，先用10的杀藻铵（Benzalkonium Chloride）溶液浸渍材料10min，效果很好。,第三节 外植体（培养物）的建立,（5）、内源菌防治：植物组织培养中对材料只能进行表面灭菌，而对材料组织内部所带的细菌往往难以对付。表面污染与内源污染的区别：,第三节 外植体（培养物）的建立,常见内源菌：芽孢杆菌（rod bacteria）为主，尤其是Bacilus licheniformis 和B.subtilis（“white g
10、host”）。真菌中主要是镰刀菌(Fusarium)、轮枝孢菌(Verticillium)、瓶霉菌(Phialophora)和丝核菌(Rhizoctonia)。内源菌的检测：通常情况下，通过观察培养瓶就可看到一些污染的迹象；但是对于生长缓慢的细菌或内生菌来说，仅靠肉眼观察是不够的，必须通过指示培养，即采用微生物特别容易生长的培养基和培养条件，让外植体上的微生物快速生长，然后予以鉴定培养基中加入蛋白胨（peptone）、胰蛋白胨（trypone）或酵母汁(YE)。,第三节 外植体（培养物）的建立,第三节 外植体（培养物）的建立,防止方法：在培养基中加入抗生素。利用茎尖培养。利用无菌材料。,抗生素
11、防治内源菌：外植体顶芽培养发现的污染、不同采收期外植体存在的污染和表面彻底消毒后的细菌污染都可能是内生菌造成的。内生菌的污染，无论用何种表面消毒方法都不能彻底消除，因此，必须使用抗生素进行间接防治处理。选用适当的抗生素特别重要。理想的抗生素应该具备以下特性：可溶性、稳定性、不受pH高低和培养基差异的影响、无边界效应、广谱性、杀菌性、不产生抗性诱导、既廉价又对人体无害。,第三节 外植体（培养物）的建立,常用如下抗生素：链霉素(10 mgL)、青霉素(20mgL)、地霉素(5mgL)、夹竹桃霉素(20mgL)、杆菌肽(50mgL)、新霉素(1mgL)。例如：用奥复星（氧氟沙星注射液）4080 mg
12、L、注射用的青霉素96192 mgL可有效抑制枣树试管苗的细菌污染，而链霉素40800mgL和硫酸庆大霉素2060mgL抑制枣树细菌效果不明显。,第三节 外植体（培养物）的建立,单独使用一种抗生素，通常效果很差，几种抗生素的配合使用，可以起到协同增益作用，但有时也可能使个别药物相互作用而失效。几种高浓度杀菌剂配合使用很可能对植物有毒害。对于某一特定细菌，确定抗生素的最低杀菌剂量是很重要的，这种最低剂量可以通过不同浓度的抗生素与细菌进行液体共同培养来确定。若找到有效浓度，则在实验处理前就可确定对植物材料的毒性范围。,第三节 外植体（培养物）的建立,抗生素对植物材料的毒性因植物类型不同差异很大，因
13、此，用植物离体培养进行基本的测试是实验成功的重要一步。由于植物毒性影响或抗生素渗透性差，在处理污染实验中，抗生素对分离组织也可能失效。了解抗生素对细菌和植物二者的效应，是消除污染和保护培养物的关键。此外，抗生素常作为预防污染作用而加入到培养基中，或者在已鉴定出细菌污染的情况下，用于抑制细菌生长或消灭细菌。抗生素的抗菌作用在中性培养基(pH6.57.5)中比常规状态提高许多，而在酸性条件下则失效，而且抗生素具有热敏感性，不能采用高温高压灭菌，只能采用过滤灭菌的方法加入培养基。,第三节 外植体（培养物）的建立,（6）、特殊污染源：污染中特别注意一种呈乳白色的细菌污染，这种细菌为芽孢杆菌。法国林木育
14、种协会鉴定为迟缓芽孢杆菌(Bacilluslenlus)，它外被荚膜，耐高温，一般灭菌剂难以杀死。它可以随培养材料、用具等传播；它可出现在培养基表面，或呈滴形云雾状存在于培养基内。若出现应及时淘汰污染源，并对所用过的器皿和用具进行严格高温灭菌处理。,第三节 外植体（培养物）的建立,5、褐变（Browning）：（1）、概念：外植体在培养容器中被氧化变褐而死亡的现象。,第三节 外植体（培养物）的建立,（2）、外植体材料褐化原理：植物组织的褐化是通过含铜的氧化酶如多酚氧化酶和酪氨酸酶起作用所致，其作用的底物通常是酪氨酸和邻位羟酚类化合物如绿原酸等。酶和底物在植物正常生长的情况下是在组织内的不同部位
15、，当细胞受伤或组织垂死时，酶和底物就跑到一起发生作用，当酚被氧化为活性酸化物和环形多聚体氧化蛋白时便形成深色化合物，这些物质又很快被氧化和变成复杂的抑制性物质，从而导致外植体材料变褐死亡并使培养基变褐。,第三节 外植体（培养物）的建立,（3）、褐化发生的可能因素：与组培植物品种有关：不同的植物种与品种之间常有很大差异，有人把此归结为基因型的不同。一般来说，植物材料中单宁类和多种羟酚类化合物的含量高，易引起外植体材料的严重褐化。多数木本植物比草本植物易引起褐化，多年生草本植物比一年生草本植物易引起褐化。,第三节 外植体（培养物）的建立,第三节 外植体（培养物）的建立,与取样外植体年龄有关：引起褐
16、化程度的轻重常与取样外植体组织的年龄有关，通常是幼龄部位产生褐化较轻，随着组织的老龄化而褐化加重。因此，在外植体接种时常需要剥去鳞片和大叶片，尤其是以切取幼嫩的芽尖或切取顶芽分生组织（或带少量叶原基）接种更为理想。,与外植体取样时间有关：外植体材料的褐化程度常与外植体的取样时间有关。一般在春夏季，尤其是春季采取生长旺盛部位的外植体产生褐化较轻，已木栓化或木质化的枝条和处于休眠状态的休眠芽作为外植体时褐化严重。,第三节 外植体（培养物）的建立,第三节 外植体（培养物）的建立,与培养基有关：接种外植体的培养基的状态（固体，半固体或液体培养基）、无机盐浓度和激素种类及浓度，以及培养基的pH值，都与外
17、植体接种后产生的褐化程度有关。一般在液体培养基上加滤纸桥和半固体培养基上褐化程度比在固体培养基上轻。低盐培养基，尤其是Mn2+和Cu2+离 子浓度较低时，外植体的褐化程度比在高盐培养基上轻。培养基中的细胞分裂素（BA、KT），常常不仅能促进酚类化合物的合成，而且还能刺激酚氧化酶的活性，因此，较高浓度的BA反而会加重外植体的褐化程度。培养基的pH值较低时常有利于减轻外植体的褐化。,与温度和光照有关：外植体接种后，开始培养的温度和光照条件也常对外植体的褐化程度有一定的影响。,第三节 外植体（培养物）的建立,（4）、防止褐化产生的几种途径：根据外植体产生褐化的原理和有关的影响因素，可以采取以下途径来
18、防止或减轻褐化，提高外植体接种的成功率。移去法：流水冲洗材料：在外植体材料表面消毒前用流水冲洗一段时间（数小时或过夜），然后进行表面消毒和接种，接种后在短时间（一天后）内多次转移到新鲜的培养基上，直至褐化基本消失。多次转移：在外植体开始接种时用液体培养基振荡培养一段时间，并在短期内更换几次新鲜培养基，待褐化现象明显减轻后再转入固体培养基培养。,第三节 外植体（培养物）的建立,吸附法：用活性炭（AC）或聚乙烯毗咯烷酮（PVP）等吸收酚及其有害产物。通常可在培养基中附加23克升的活性炭，或520克升的PVP，或加倍Fe-EDTA(螯合铁)的用量，均有减轻褐化伤害的效果。改变氧化一还原势法：应用还原
19、剂可造成较低的氧化一还原势，能有效地防止褐化的发生。常用的还原剂有维生素C、柠檬酸、半胱氨酸盐酸盐、谷胱甘肽和巯基乙醇等。使用方法可以在外植体材料消毒前快速浸入上述抗氧化剂溶液中，也可以用抗氧化剂溶液浸湿滤纸，在湿润的滤纸上进行外植体材料的切割，这样伤口很快就可以接触抗氧化剂而防止材料褐化。,第三节 外植体（培养物）的建立,第三节 外植体（培养物）的建立,减少氧化机会：创伤是外植物体脱分化和形成愈伤组织的一个条件。由于被溶解的氧会提高氧化还原势，从而造成外植体伤口表面很快地氧化引起褐变。因此，应尽可能地减少新鲜外植材料切割、接种操作过程中在空气中暴露的时间，以便减轻外植体的褐变。,抑制酚氧化酶
20、的活性法：铜是酚氧化酶的功能性金属离子，利用螯合剂螯合铜离子对减轻褐化也是有效的。譬如乙二胺四乙酸（EDTA）、二乙基二硫代氨基甲酸脂和二甲基二硫代氨基甲酸脂等都是铜离子的螯合剂，同时这类螯合剂 也可能是抗氧化剂，可以用来抑制酚氧化酶的活性。一定的低温（18以下），降低多酚氧化酶的活性或减少底物，均能降低酚类物质的氧化速率，从而减轻材料的褐化。,第三节 外植体（培养物）的建立,降低环境的pH值法：多酚氧化酶的活性在pH值6.5时最大，随着pH值的降低而活性下降。上述的维生素C和柠檬酸等不仅是还原剂，同时也能降低pH值，降低多酚氧化酶的活性，从而减轻材料的褐化。热激处理法：多酚氧化酶是一种不耐热
21、的酶，在45 50以上时活性迅速下降，在40以下保持较稳定的活性。所以，如果外植体材料采用4550高温预处理45分钟后进行外植体接种，也可有效地抑制褐变。,第三节 外植体（培养物）的建立,暗培养法：光线常可增加植物体内酚的生物合成和加速伤口部位酚的氧化，故新接种的外值体可以先进行暗培养714天后再逐步移入光照培养。培养基的附加物法：一般来说，较高浓度的激动素水平对茎尖的生长和分化是需要的，但容易引起材料和培养基加深褐化。因此，可以在外植体接种开始的一周内适当降低激动素水平来减轻材料和培养基的褐变。MS培养基中的高K含量也常容易引起褐化，可改用12的KNO3量。此外，碳水化合物也是酚化物生物合成
22、所必需的，适当降低培养基中的蔗糖浓度至1也常可以减轻褐化，有些植物可能在蔗糖培养基中褐化严重，而在葡萄糖或山梨糖培养基上褐化较轻。,第三节 外植体（培养物）的建立,第三节 外植体（培养物）的建立,6、培养反应的观察与统计：材料接种培养后要经常进行观察和调查统计。并根据培养材料的反应决定下一步操作。（1）、污染率：（2）、褐变率：（3）、诱导（启动）率：,第三节 外植体（培养物）的建立,愈伤组织：在离体培养条件下，培养的植物细胞、组织或器官等材料由于切伤后分泌的创伤激素和培养基中添加的外源激素共同作用下，往往会发生愈伤组织。通常应控制其不要太大，以免消耗较多养分。为此分离时伤口要小，培养基中也不
23、要加过多的生长素。花药、叶片、茎段、花器官等培养，经常先在诱导培养基诱导愈伤组织，然后再进一步转入分化培养基促进芽的再分化。,第三节 外植体（培养物）的建立,胚性愈伤组织和胚状体（体细胞胚）：在叶片培养过程中，可以发现培养材料逐渐变大、肥厚，形成肿胀突起，表面逐渐出现密集的小突起，它同芽点不同，初为淡绿色，逐渐转绿，呈球形小点，用显微镜观察，可见到叉状对生的子叶原基。在茎尖、茎段、叶片等的培养中，培养l0d-15d后，在切口处产生黄色或乳黄色的愈伤组织，表面呈颗粒状突起，30d左右颗粒状突起出现大量球形、棒状胚状体，特别是叶脉部位发生的胚状体多而整齐。所以胚状体是很容易从形态、发生数量等方面加
24、以观察区分出来的。,第三节 外植体（培养物）的建立,胚状体（体细胞胚）与芽,第三节 外植体（培养物）的建立,第三节 外植体（培养物）的建立,芽：芽的产生有两种情况，一种是从愈伤组织上产生不定芽，如茎段培养先诱导产生绿色的愈伤组织，以后上面出现透明的亮点，再接着伸出叶尖或上面长有白色茸毛的小叶，一个月后主茎伸长，形成小植株。再一种是从茎尖、侧枝等产生，由于培养基中添加高细胞分裂素的作用，促进腋芽的萌发，培养中很容易用肉眼观察到，经一个周期的培养可长成一丛芽。产生的芽还可分离接种继续扩大繁殖，或分离至生根培养基培养，得到完整植株。,第三节 外植体（培养物）的建立,根：根的培养发生大多所需时间较短，仅个别木本植物长些，一般较易观察。如河岸红杉培养30d-40d，在苗基部切口处，先发生少量愈伤组织，由绿逐渐变褐，接着出现白色粒状的根尖，以后根尖很快伸长，并长出侧根，形成根系。,
