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1、转基因蓝藻生长繁殖状况及其外源基因稳定性研究作者：王宇 指导老师 曾国寿摘要 本文研究了不同条件下两种转基因蓝藻生长繁殖状况，以及外源基因的稳定性。与对照的7942集胞藻相比，转基因集胞藻MT与1146的生命活力随传代代数的增加呈下降趋势，其所含的外源基因也随传代代数的增加而逐渐丢失；在水培养条件下，转基因集胞藻MT与1146的生长状况也明显不如7942集胞藻。这说明了在没有筛选压时或在自然条件下转基因蓝藻对天然蓝藻无法造成生态位的入侵，证明转基因蓝藻作为生物反应器对环境来说是比较安全的。关键词 蓝藻 外源基因 稳定性蓝藻是藻类中最原始的类群，是具有植物型放氧光合作用的原核生物，结构简单、生长
2、迅速、适应性强、部分种类具有天然转化系统和有效重组系统，以蓝藻为生物反应器，生产目的蛋白，具有周期短、成本低、易操作等优点。目前，已有不少外源基因转入蓝藻并得以表达的报道，如Tandeaude Marsac以pUC303为载体,在单胞蓝藻Synechococcussp.PCC7942中表达了原核基因芽孢杆菌杀幼蚊毒素基因1；Price等人通过穿梭表达载体pCA在蓝藻Synechococcussp.PCC7942中表达了人的碳酸酐酶基因,对蓝藻细胞的光合作用产生了一定影响2；孙军等人将小鼠金属硫蛋白-1(mMT-1)cDNA基因片段与穿梭质粒表达载体pDC-8重组,在固氮丝状蓝藻Anabaena
3、sp.PCC7120中表达了金属硫蛋白3；闫艳春等人同样将抗性尖音库蚊酯酶B1基因与穿梭质粒表达载体pDC-8重组,在蓝藻Synechococcussp.PCC7942中表达了有活性的这种酯酶4等。但是，和其他转基因物种一样，转基因蓝藻对环境的安全性问题引起了人们的关注，人们对转基因蓝藻从实验室或生产车间的泄漏及外源基因的逃逸是否会对生态环境造成不利影响心存疑虑。因此，本文通过研究两种转基因蓝藻的生长繁殖状况及其外源基因的稳定性来探讨这个问题。1 材料和方法1.1实验材料1.1.1藻种1） 转入pUCMT质粒（含Ampr基因）的集胞藻（本文简称MT）2） 转入pAM1146质粒（含）Ampr基
4、因）的集胞藻（本文简称1146）3） 前两者的受体藻种集胞藻7942（本文简称7942）1.2仪器与试剂1.2.1 主要仪器光照培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂SPX-300B-G型）；洁净工作台（ 上海淀山湖净化设备厂SDJ-CJ）；722型分光光栅光度计（中国厦门分析仪器厂）；台式离心机（上海安亭科学仪器厂 TGL-16G）；电泳仪（六一仪器厂，DYY-5型）；PCR仪（Biometra公司，T Gradient）1.2.2 试剂1）BG-11培养基2）LB细菌培养基3）引物由上海博亚生物技术有限公司合成5端引物 5GGC AAC TAT CTC AGC GAT CT 33端引物 5
5、GTG TCG CCC TTA TTC CCT TT 3dNTP,Taq酶、CTAB等均购自上海博亚生物技术有限公司；DNA Marker(DL2000)购自大连宝生物公司。1.3实验方法1.3.1 7942、MT、1146继代培养（25与29）7942、MT、1146接种于BG-11液体培养液，进行继代培养。培养条件为：温度25或29，光照强度为2700LUX，每日光照时间12h。继代培养时各从每瓶所对应的前一代藻液取25ml分别置于75ml BG-11培养液中，以每9天为一代，进行培养。繁殖至第五代和第七代后，将编号为MT、1146、7942的第五代和第七代提取DNA、进行PCR 扩增，对
6、比是否有Ampr基因。1.3.2 7942、MT、1146长期不继代繁殖将7942、MT、1146、MT混7942、1146混7942与BG-11培养液的混合液用500ml的锥形瓶盛装，置于恒温光照培养箱培养。培养条件为：25或29，光照强度为2700LUX, 每天光照时间12h。在第35天时提取DNA，进行PCR 扩增，对比是否有Ampr基因。1.3.3 在自然水中的培养将MT、1146、7942、MT混合7942、1146混合7942 五种样品，分别与防空洞水、万石岩水库水、自来水（以10ml：10ml的比例混合）；在温度为29,每天光照时间12h的条件下恒温培养。每13天记录一次其生长情
7、况，研究对比MT，1146，7942在自然环境下的存活能力。并在显微镜下观察其生物种类及形态的变化。23个月后提取各样品的DNA，进行PCR 扩增，进行研究对比，是否有Ampr基因存在。1.3.4 蓝藻 DNA的提取藻液（OD730=0.5）欲1000rpm离心10min，弃上清（重复一次）；2%CTAB液（5ml/g）,65度水浴1.5h;等体积氯仿/异戊醇抽提后离心10min,取上清，（重复一次）；加入1/10体积3mol/L NaAc与2倍体积无水乙醇，混匀，-20度放置30min,1000rpm 离心10min，弃上清；沉淀用75%与100%乙醇各洗涤一次，室温晾干，溶于50L去离子水
8、，4保存备用。1.3.5 PCR扩增 以Ampr基因为模版设计引物，进行PCR扩增。20L反应体系中含10buffer2.0L；Mg2+2.5mol/L；dNTP 150mol/L；引物各0.25mol/L；模板1L；Tap酶 0.15U；94度 45sec,52度1min,72度1min,30个循环；72度 5min。2结果与分析2.1 PCR扩增结果2.1.1继代培养五代及七代时的PCR扩增结果（见图1）表一 继代培养五代及七代时的PCR扩增结果型号 代数温度2529-1-2-3-4-5-1-2-3-4-5MT五代+七代+1146五代+七代+（+：代表PCR扩增结果为阳性，：代表PCR扩增
9、结果为阴性）为了方便比较，把图1的数据总结成表一。从表一可以看出：七代时转基因蓝藻的Ampr基因丢失比五代时更多，这说明转基因蓝藻在传代过程中外源基因会逐渐丢失 MT的这种趋势比1146更明显，这可能与转入不同的外源基因有关；与25相比，29时外源基因丢失的频率更大，这是由于29更适于蓝藻生长，在相同时间里蓝藻传代的代数更多，传代的代数多，外源基因丢失的可能性就越大。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41图
10、1 继代培养五代及七代时的PCR扩增结果15：MT7代-17代-5（29） 6：MT与7942混合（29）7：7942（29） 812：1146 7代-17代-5（29）1317：1146 5代-15代-5（25） 1721：MT 5代-15代-4（25） 2226：1146 5代-15代-5（29） 2731：MT 5代-15代-5（29）3236：1146 7代-17代-5（25） 3841：MT 7代-17代-5（25）2.1.2不继代长期培养的PCR扩增结果（见图2）在29时，7942+1146、 7942+MT的PCR扩增无阳性带，说明外源基因已经丢失。 1 2 3 4 5 6 图2
11、 不继代长期培养的PCR扩增结果1：pUCMT 2: 7942+1146（29） 3: 7942+MT（29） 4：7942（29）5：MT 6：11462.1.3、MT、1146、7942、MT混合7942、1146混合7942 五种样品，分别与防空洞水、万石岩水库水、自来水混合PCR 检测结果（图3）：为了方便比较，把图3的数据总结成表二。从表二可以看出，只有极少数的水培养环境中仍有Ampr基因存在，而大部分的水培养环境中Ampr基因易丢失，说明外源基因在转基因蓝藻水培养中很容易消失。表二 转基因蓝藻在水培养中检测到的PCR结果型号 样本 自来水万石岩水库水防空洞地下水MT1146+794
12、2MT和79421146和7942 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 图4 转基因蓝藻在水培养中检测到的PCR结果13：1146分别与自来水、万石岩水库水、防空洞地下水混合 46：MT分别与自来水、万石岩水库水、防空洞地下水混合 79：7942分别与自来水、万石岩水库水、防空洞地下水混合1012：1146+7942分别与自来水、万石岩水库水、防空洞地下水混合 1215：MT+7942分别与自来水、万石岩水库水、防空洞地下水混合 16：pUCMT 17：pAM11462.2 密度变化情况2.2.1继代培养各代密度变化规律。前六代两种转基因藻在继代
13、培养过程中随着传代代数的增加吸收比呈下降趋势，从第七代开始上下波动；而天然藻7942各代的密度呈上下波动，并无下降趋势（见图5）。而且，从整体看，29时蓝藻的密度高于25，说明29更适于蓝藻生长。前六代两种转基因蓝藻的密度不如天然藻且变化呈下降趋势，说明转基因蓝藻生活活力不如天然藻，可能的原因是外源基因的转入打破了天然藻固有的代谢平衡，天然藻长期进化过程中形成的对环境的适应性受到了一定的削弱。从第六代开始，两种转基因藻密度呈出现了上下波动的情况，可能是由于随着传代的进行，外源基因丢失，转基因藻的代谢又回到天然藻的水平，所以出现了和天然藻一样的上下波动趋势。 从转基因藻五代代细胞计数来看，114
14、6每平方毫米的细胞数呈下降趋势，MT从第一代到第二代呈明显上升（可能是由于第一代的数量太少，培养基营养过剩导致第二代数量明显上升），第二代之后逐渐下降，综合两种藻总的还是呈下降趋势。而天然藻7942各代并无下降趋势（见图6）。这与同为密度指标的吸收比结果相一致。 图5继代培养蓝藻密度变化图6转基因蓝藻各代细胞数变化（29）2.2.2不继代长期培养密度变化：天然藻比转基因藻的密度要高（特别是29），转基因藻与天然藻混合培养会使天然藻的密度有轻微的下降。25时各种藻的密度要比29时高。（见图7）29培养比25培养细胞数量要少，可能是由于在不添加新培养基的情况下，29代谢更旺盛造成营养消耗更多，以致
15、后来由于营养不足使生长密度相对不如25培养。转基因藻与天然藻混合培养会使天然藻的每平方毫米细胞数有轻微的下降的原因是转基因藻的生长活力不如天然藻，当1：1混合时自然使天然藻的密度有所下降。 图7 不继代长期培养的细胞数量比较2.3水培养的蓝藻的生长状况2.3.1 表面形态观察结果（1）防空洞水培养的各类藻大致呈细水颗粒状，后成为絮状，有附壁现象。（2）万石岩水库水培养的三种单种藻均出现块状，两种混合藻形成厚附壁，随后脱落成带状，所有用万石岩水库水培养的藻液中均出现大型藻类。（3）自来水培养的藻均有沉积，摇后均匀。（4）三种单种生长形态较接近，两种混合藻生长形态较接近，三种单种对于两混合种来说显
16、得更绿。（5）在自然水中生长的藻均有沉淀等现象，说明自然环境长势比在培养液中的长势差。2.3.2 显微观察结果(1) 水培养下集胞藻形态显微观察:除了在1146+万石岩水中存在集胞藻以外,其余各瓶均无集胞藻存在,仅存许多绿色碎片.只有1146+万石岩水中存在集胞藻,大约每个视野有10个,并且可以自由游动。（2）水培养下大型藻类形态的显微观察。在显微镜下，我们观察到1146+万石岩水、MT+防空洞水、7942和1146+万石岩水、7942+万石岩水、7942和MT+万石岩水、MT+万石岩水中都存在大型藻类，且都呈丝状。1146+万石岩水中大型藻有腐烂现象，可能是因为死亡过久造成 。MT+万石岩、
17、 MT+防空洞水中均产生丝状片状藻类。在MT+万石岩水、MT+防空洞水、7942和1146+万石岩水、7942和MT+万石岩水中均存在绿色至灰色的丝状片状物。3.讨论3.1转基因蓝藻中外源基因的稳定性 从本实验的结果可以得出，在没有选择压的情况下，转基因蓝藻中外源基因的稳定性较差，随着传代的进行，外源基因会较快得消失，对环境安全不会构成威胁。但是以蓝藻为生物反应器的目的是为了高效稳定地表达目的蛋白，这要求目的基因要稳定地存在于转基因蓝藻中。已报道的大部分研究都是通过加选择压（如加卡那霉素）的筛选，使外源基因相对稳定。在选择压力下外源基因仍然较快地消失的报道5只有极少数。3.2 转基因蓝藻的生长
18、繁殖状况 从本实验的结果可以得出，在没有选择压的情况下，转基因蓝藻的生长繁殖状况比天然藻相对要差，在与天然藻的竞争中处于劣势，即使不慎从实验室或生产车间逃逸，也不会危害环境。但在有选择压的情况下，天然藻逐渐黄化死亡，而转基因藻依然保持绿色6，为生产目的蛋白提供最基本的前提。 综上所述,转基因蓝藻在没有选择压力的自然情况下，逃逸蓝藻及其外源基因没有扩散，并且较快消失，因此，对环境来说是安全的。参考文献： 1Lou SL,Liu Gf,Zhang J,etal. The progress of genetic engineering of cyanobacteria. In: Cytology,
19、enetics and Molecular Biology of Algae.(eds Chaudhary BR and AgrawalS.B.) J.SPB Academic Publishing,1996,421-439.2Price GD, Badger MR. Expression of human carbonic anhydrase in the cyanobacterium Synechococcus PCC7942 creates a high CO2-requiringphenotype J . Plantphysiol, 1989, 91: 505-513. 3 孙军,金苹,徐旭东,等.小鼠金属硫蛋白-IcDNA在蓝藻中的克隆和表达 J.生物工程进展,1994,14(6):39-42.4闫艳春,乔传令,张媛.解毒酶基因在蓝藻中的克隆与表达J.生物工程学报,2000,16(1):42-45.5 Microbiology，1997；43：27252731.6 戴征，施定基，张卉，等. 人表皮生长因子（hEGF）基因在蓝藻中的表达J.植物学报,2001,43(12):1260-1264.致谢； 本项目受到陈亮博士指导和帮助，特此表示感谢8
