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1、平台简介：以家蚕作为生物反应器，利用分子生物学手段，构建了系统的家蚕杆状病毒高效表达药用外源蛋白体系，建立了全方位的具有自主知识产权的生物医药产业化平台。我们在国际上首次克隆家蚕杆状病毒（BmNPV）的P10基因并证明P10启动子也是强启动子，具备作为表达载体启动子的功能特征，首次利用BmNPV P10启动子在家蚕细胞中表达了氯霉素乙酰基转移酶。成功构建重组可救活线性化家蚕核多角体病毒基因工程载体，筛选效率提高1000倍，时间缩短10倍；成功构建半胱氨酸蛋白缺失型家蚕核多角体病毒基因工程载体，表达效率提高40%。通过构建一系列的新型重组病毒和表达载体，形成全新的家蚕生物反应器技术平台。此后，以
2、家蚕生物反应器技术平台生产口服疫苗和药物为研究特色，建立了家蚕生物反应器生物制药技术平台和家蚕功能基因组研究技术平台，主要致力于应用基因工程技术和生化下游技术制备药物及疫苗，探索基因工程药物（疫苗）口服途径及其产业化，同时开展家蚕功能基因组学的研究，探索家蚕生长发育中的基因调控机制。在国内外学术刊物上发表研究论文170余篇，其中被SCI收录 40余篇，编写专著6本；完成科研项目26项，其中国家级13项，省部级10项，在研项目4项；获得国家发明专利14项，公开国家发明专利5项；在国际学术刊物上发表研究论文37篇；申请国家发明专利17项，获得国家发明专利7项。在家蚕生物反应器生产口服药物和疫苗的研
3、究、家蚕功能基因组学和蛋白质组学以及家蚕RNA相关研究中都取得了新的突破。平台具体内容、研究成果：一、家蚕生物反应器生产口服蛋白质药物技术平台体系的构建通过一系列的新型基因工程载体的构建，成功建立家蚕生物反应器蛋白表达技术平台。家蚕生物反应器表达的产物经证实可以直接用于口服药物的开发，目前已经证明家蚕表达生产的药物由于有蚕血淋巴本身的大量蛋白的保护作用和一些未知的机理，直接经口服给药而进入血液循环。这类药物既可以免去药物的分离纯化过程，又可解除病人注射的痛苦和被感染的危险。(1) 家蚕生物反应器蛋白高效表达技术平台的构建国际上首次克隆并测序家蚕杆状病毒（BmNPV）的P10基因（GenBank
4、 登录号为S76783），并证明P10启动子也是强启动子，具备作为表达载体启动子的功能特征，此后，首次利用P10启动子在家蚕细胞中表达了氯霉素乙酰基转移酶；通过野生型家蚕核多角体病毒中国镇江株BmNPV ZJ8基因组与修饰型苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒AcNPV BacPAK6基因组在家蚕细胞内同源重组，构建成重组救活可线性化修饰型家蚕核多角体病毒基因工程载体BmBacPAK6。BmBacPAK6含有Lac Z基因和两个Bsu36 I酶切位点用于线性化。BmBacPAK6用作外源基因表达重组救活病毒筛出率几近100。BmBacPAK6用作载体表达人EPO基因，感染家蚕虫体和家蚕蛹时，EPO表达量达
5、7.4104U/ml血淋巴；在此基础上，成功构建半胱氨酸蛋白酶缺失型BmNPV基因工程载体，通过一种半胱氨酸蛋白酶基因缺失型家蚕核多角体病毒BmZJCP基因组DNA和构建的转移载体pCP-GFP与上述BmBacPAK6共转染家蚕细胞，经细胞内同源重组获得。此半胱氨酸蛋白酶缺失型病毒感染的家蚕细胞中，外源基因表达量比对照高约40，宿主存活期及产物高表达期延长，从而提高总表达量。通过构建一系列的新型重组病毒和新型表达载体，形成全新的家蚕生物反应器蛋白高效表达技术平台。(2) 口服有效的rhGM-CSF蛋白药物的制备及其生白效果至今，有很多的外源蛋白在家蚕细胞和幼虫中得到表达，但作为生物反应器，家蚕
6、蛹可能更加适合表达外源目的基因。我们通过重组家蚕杆状病毒在家蚕蛹中成功表达了人粒细胞-巨细胞激落刺激因子（hGM-CSF）。表达的重组蛋白rhGM-CSF分子量为29kDa，等电点5.1，脱糖基化分析表明和大肠杆菌表达rhGM-CSF相比，家蚕蛹表达rhGM-CSF经过了糖基化后修饰，同时还可能经过了其他的翻译后修饰。重组家蚕蛹蛋白粗提物中rhGM-CSF比活达到6.8106 cfu mg-1，经纯化我们得到比活大于8.4106 cfu mg-1的重组蛋白。本研究表明家蚕蛹能够作为一种方便的低成本的生物反应器用于外源基因的表达。相关研究成果发表在J. Biotechnol.上。我们通过家蚕蛹生
7、物反应器高效表达了rhGM-CSF，为了进一步研究家蚕蛹所表达的rhGM-CSF药效功能，从家蚕蛹中大规模纯化重组蛋白成为一个较大的挑战。我们建立了两个大量纯化重组蛋白的方法：分别采用硫酸铵分级沉淀和等电点沉淀法得到重组蛋白的初步纯化产物，然后再结合凝胶过滤和离子交换色谱法得到纯化的蛋白。研究表明，采用等电点沉淀法可能更加有效，通过这种方法，我们从1000g接种感染的蚕蛹中纯化得到95纯度的重组蛋白11.7mg，其比活高达9.0106 cfu mg-1。和其他方法相比，该方法纯化蛋白的得率提高了大约40。相关研究成果发表在Appl. Biochem. Biotech.上。家蚕生物反应器表达的r
8、hGM-CSF为29kDa糖蛋白（BmrhGM-CSF）。生物活性检测表明，BmrhGM-CSF具有刺激人骨髓细胞形成集落的能力，集落形成效果和BmrhGM-CSF成剂量依赖关系，和射线的照射的浓度呈负相关。动物试验表明，口服BmrhGM-CSF15分钟后，可以在老鼠的血液中检测到20kDa125I标记的BmrhGM-CSF蛋白片段。免疫组化试验显示可以在老鼠肠的组织细胞中检测到BmrhGM-CSF。这些结果表明BmrhGM-CSF可能通过动物肠微绒毛被吸收到动物血液中。动物药理学试验进一步证实：（1）BmrhGM-CSF能提高白细胞减少症小鼠脾脏的CFU-S形成能力和骨髓细胞中DNA合成能力
9、；（2）BmrhGM-CSF能显著诱导恒河猴和狗骨髓粒细胞和核细胞的生长，口服BmrhGM-CSF9天后，动物的白细胞水平显著提高，且呈剂量依赖关系。高剂量组狗的白细胞水平达到1.5109cells/L，远远高于阴性对照组的狗。同时骨髓涂片试验表明，口服BmrhGM-CSF动物的白细胞中肌胚细胞和前颗粒性细胞所占百分比远远高于阴性对照组动物。以上结果表明家蚕生物反应器生产的29kDa BmrhGM-CSF作为具有生物活性的细胞因子能够通过口服产生效果，这为蛋白口服药物的研制开辟了一条新的途径。研制hGM-CSF胶囊（瑞福康），经国家新药评审中心评审同意进入临床试验（临床批件号：2003L025
10、11），“蚕表达基因工程生白细胞药物的方法”已获得国家发明专利（专利号：ZL98124614.1）,相关研究成果发表在Eur. J. Pharm. Sci.上。为了研究家蚕生物反应器表达的BmrhGM-CSF在人体内的口服吸收利用度，我们以每100mg蚕蛹粉中含12g的BmrhGM-CSF制成胶囊，根据双处理、双周期、两序列的随机交叉试验设计方法，选择21例志愿者，口服BmrhGM-CSF8g/kg或皮下注射大肠杆菌表达的rhGM-CSF3.75g /kg，给药后按0、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0、10.0、12.0h自臂静脉取血，ELISA
11、法测定血液中hGM-CSF浓度，结果表明19人口服BmrhGM-CSF后，有15人血液中检测到与正常血浆有显著差异的血药浓度，用梯形面积法计算药时曲线下面积AUC，根据试验品的AUC与参比品的AUC比值计算相对生物利用度F值，BmrhGM-CSF经口服后在人体中平均生物利用度为0.605%，在15人中有效吸收的平均生物利用度为0.959%，最高为3.097。受试者的血浆经质谱分析找到了来自hGM-CSF的相关片段的序列，序列最大分子量达到7336Da，最小达到2039 Da，说明BmrhGM-CSF经过口服能被人体吸收。5个剂量组27名受试者单次口服150900g的rhGM-CSF胶囊的一般检
12、查、血生化、血液学、尿液和心电图检查结果用药前后均无具临床意义的改变，无药物不良反应发生。18例恶性肿瘤患者在化疗结束24小时后开始口服BmrhGM-CSF胶囊相对安慰剂组能明显减慢或阻止白细胞下降。30例接受放、化疗患者口服BmrhGM-CSF胶囊，5天内使白细胞恢复到4109/L上，总有效率达90%，说明经吸收的BmrhGM-CSF在人体内具有活性、具有升高白细胞的功能。相关研究成果拟发表在PLoS One。(3) 糖尿病基因工程口服疫苗的制备及其对I型糖尿病的治疗研究由于家蚕生物反应器表达蛋白进行翻译后修饰，其表达产物生物活性可以和天然蛋白相媲美，我们开展了口服家蚕表达霍乱毒素B亚基（C
13、TB）与胰岛素融合蛋白对治疗自身免疫性糖尿病的研究。I型糖尿病由胰岛素分泌缺陷产生，它是一种针对胰岛细胞的自身免疫性疫病。动物实验表明通过口服一种自身抗原，如胰岛素或GAD，即诱导了免疫耐受，产生了保护作用，进而抑制糖尿病的发生。口服疾病特异性自身抗原能诱导口服免疫耐受，并能有效延缓或抑制自身免疫性疾病症状的发生。在体内成功诱导免疫耐受需要长期口服大量的蛋白抗原， CTB可作为诱导口服耐受的强大粘膜运载系统，自身抗原通过与CTB蛋白偶联可极大地较少口服自身抗原的剂量。这些都暗示CTB偶联自身抗原不仅使口服耐受防治I型糖尿病等自身免疫性疫病更具有实际应用价值，而且还有潜在的治疗前景。因此，在本研
14、究中我们构建了CTB与人胰岛素融合基因（CTB-INS），并在家蚕中得到高效表达，融合蛋白（20kDa）在家蚕幼虫的蚕血淋巴中表达量达到0.3mg/ml。经检测，该融合蛋白在家蚕中以五聚体形式存在，并且保持GM1神经节苷脂的受体结合特性以及CTB和胰岛素的抗原性。非肥胖性糖尿病（NOD）小鼠经口服含微克级的CTB与胰岛素融合蛋白的蚕血淋巴，病理组织切片实验表明胰岛发炎程度显著减轻。适时监测血糖的实验结果亦表明糖尿病的病理症状得到明显延缓，过继转移实验亦表明口服该融合蛋白产生了潜在的调节性T细胞从而抑制糖尿病的发生。这些结果表明家蚕生物反应器是一个合适的生产口服疫苗系统，并通过该系统诱导针对T细
15、胞介导的自身免疫疾病的免疫耐受，该研究是利用我国自身蚕业资源优势研制抗I型糖尿病口服疫苗，为I型糖尿病的治疗开辟了新的途径。相关研究成果发表在J. Biotechnol.和J. Biochem.Mol. Biol.上。为了提高融合基因CTB-INS在家蚕杆状病毒表达系统中的表达水平，我们同时开展了部分多角体同源序列对外源基因在杆状病毒表达系统中表达的影响分析。本研究在融合基因CTB-INS的5端融合了部分来自多角体基因的5非编码区（ATAAAT）和编码区（ATGCCGAAT）共15bp的核酸序列，因此与原CTB-INS融合蛋白相比，经过修饰的融合蛋白（mCTB-INS）在其N末端增加了两个氨基
16、酸Pro-Asn。我们将新的融合蛋白mCTB-INS在家蚕细胞和幼虫中分别表达，结果发现由于融合了部分多角体同源序列（PPHS），新的蛋白的表达量与原CTB-INS蛋白相比提高了近4倍。进一步分析得知，新蛋白N端增加的两个氨基酸并未显著影响其与神经节苷脂（GM1）的结合能力。因此，本实验中所使用的15bp多角体同源序列可被用作为一个结构元件，在多角体启动子下游促进外源基因的高效表达。相关研究成果发表在Biotech. Appl. Biochem.上。我们同时关注口服家蚕表达CTB与胰岛素B链融合蛋白对治疗糖尿病的效果。胰岛素B链包含了胰岛素的主要抗原决定族，仅仅口服胰岛素B链在动物模型中同样能
17、抑制糖尿病的发生，其效果与口服胰岛素完整蛋白相近。经检测，我们构建的CTB与人胰岛素B链融合蛋白在家蚕中以五聚体形式存在，并且保持GM1神经节苷脂的受体结合特性以及CTB的抗原性。非肥胖性糖尿病小鼠经口服含微克级的CTB与胰岛素B链融合蛋白的蚕血淋巴，病理组织切片实验表明小鼠胰岛发炎程度显著减轻。同时适时监测血糖的实验结果亦表明口服中剂量的融合蛋白能延缓糖尿病的病理症状的发生。本研究表明口服家蚕表达的CTB与人胰岛素B链融合蛋白可以作为一种口服蛋白疫苗，并对NOD模型鼠的胰岛炎症具有很好的抑制作用。相关研究成果发表在Vaccine上。(4) 家蚕生物反应器生产其他口服药物和疫苗的研究我们同时还
18、开展了其他许多重要药用蛋白和疫苗的表达和口服研究工作。（i）家蚕表达SARS基因制备抗SARS病毒口服疫苗的研究我们获得了SARS病毒基因组中与致病性相关的若干个基因，经测序鉴定正确后克隆至重组转移载体pBacPAK8中，与线性化的杆状病毒共转染家蚕培养细胞，经重组病毒筛，获得高效表达重组杆状病毒。在将表达的几种SARS基因疫苗注入实验小鼠体内后，成功地在实验小鼠体内检测到了非典（抗SARS病毒）抗体，而非接种组均无抗体反应。相关研究成果发表在Acta Biochim.Biophys.Sin.上。（ii）家蚕表达人乳铁蛋白生产口服治疗溃疡性结肠炎药物研究我们获得了在蚕体中能高效表达人乳铁蛋白（
19、hLf）基因的重组家蚕杆状病毒，在家蚕中表达量高达192 g/ml蚕血淋巴。 动物实验采用葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠急性结肠炎模型，受实验动物推荐剂量为80g/次/kg体重。采取灌喂法，连续给药10天后，测定各项指标。空白对照组每日灌喂等量蒸馏水。结果表明利用重组hLf治疗溃疡性结肠炎，反映临床表现的DAI和组织学得到改善，髓过氧化物酶（MPO）明显降低，有效的缓解硫酸葡聚糖钠（DSS）诱导的溃疡性急性结肠炎，为进一步进入临床，生产口服治疗溃疡性结肠炎药物打下理论基础。相关研究成果发表在J.Biotechnol.和Acta Biochim. Biophys. Sin.上。（iii）家蚕表达人破骨细
20、胞形成抑制因子生产口服治疗高血钙、骨质疏松症药物的研究我们获得了在家蚕中能高效表达破骨细胞形成抑制因子OPG及变体OPG-372的重组杆状病毒病毒，并发现rh-OPG在家蚕幼虫的表达产物还有二聚体的形式。将含rh-OPG-372的家蚕血淋巴注射到小鼠腹腔，结果表明，家蚕杆状病毒表达系统表达出的重组人OPG-372蛋白具有良好的降血钙生物活性，0.75mg/kg rh-OPG-372就能显著地降低小鼠体内Ca2+，并呈剂量依赖关系，6 mg/kg rh-OPG-372的降钙效果几乎与鲑鱼降钙素（sCT）相当。对小鼠每天腹腔注射一次含重组蛋白的蚕血淋巴。一个月后在股骨远端骨松质观察到骨小梁纵切面面
21、积明显增加，说明重组蛋白具有较好的生物活性。通过灌胃的方式，对小鼠进行了降血钙和骨保护的口服研究。结果表明，通过口服方式，一定剂量的重组蛋白也能有效的降低小鼠的血清钙离子浓度。虽然剂量要求比注射方式要重些，但从时间来看，效果比后者持续的更久些。我们将雌性小鼠的卵巢切割，模拟妇女绝经后雌激素分泌下降导致的骨质疏松，将含重组蛋白OPG的蚕血淋巴对小鼠进行灌胃，实验结果表明重组蛋白能有效的阻止因雌激素缺失导致的骨流失。以上结果表明，家蚕杆状病毒表达系统表达的OPG具有潜在预防和治疗高血钙、骨质疏松等骨相关疾病的功能。其临床应用和产业化生产还有待于进一步的研究。相关研究成果发表在Acta Biochi
22、m. Biophys.Sin.和Mol. Biotechnol.上。（iv）家蚕表达鸡传染性法氏囊病毒VP2基因生产抗鸡传染性法氏囊病口服疫苗通过RT-PCR技术，获得了鸡传染性法氏囊病毒（IBDV）的VP2基因，并用家蚕表达IBDV的抗原决定族基因制成口服基因工程疫苗，已申请国家发明专利（公开号为CN 1300850A），并获得农业部中试释放批件（农基安审字（2004）第018号）。相关研究成果发表在Avian Dis.和Acta Biochim. Biophys. Sin.上。（v）人EGF基因的表达与治疗胃溃疡的研究我们通过家蚕生物反应器大量表达人表皮生长因子hEGF蛋白，通过和多角体蛋
23、白融合，在多角体启动子的启动下在家蚕细胞BmN，幼虫和蛹中被高效表达。ELISA 检测表明在家蚕幼虫和蛹中，感染重组病毒后第四天hEGF蛋白表达量达到最大。表达重组蛋白的细胞粗提物和感染重组病毒的家蚕幼虫血淋巴都能有效地促进Balb/c 3T3细胞的分化。动物试验表明，感染重组病毒和野生病毒的家蚕蛹都能保护小鼠胃粘膜防止酒精诱导的胃损害。为什么野生病毒感染的家蚕蛹也能发挥保护作用？虽然其效果和重组病毒相比较差，其机制还有待于进一步研究。相关研究成果发表在African J. Biotechnol.上。（vi）人促红细胞生成素(rhEPO) 口服剂型研究获得在家蚕中能高效表达了的hEPO基因的重
24、组家蚕杆状病毒，在家蚕中表达量高达5.16105单位/蚕，蛹中表达量为2.01106单位/蛹。通过低温冷冻干燥及剂型的研制，研制了rhEPO胶囊(康血宝)。“用家蚕表达重组人促红细胞生成素制备药物的方法”已获得国家发明专利（专利号：ZL98124616.8）。（vii）蚕表达丙肝抗原制备治疗和抗丙型肝炎口服药物的研究用蚕表达的丙型肝炎（HCV）的C+E1基因产物，每头蚕可表达0.5mg，可以应用HCV抗体的检测，用蚕表达的HCV的C+E1基因产物，经过剂型研制，进行动物口服试验，通过三百只老鼠的试验，口服组的HCV抗体阳性率超过到95%以上，为口服疫苗的研制提供依据。“用蚕表达丙肝抗原制备口服
25、药物的方法”已获得国家发明专利（专利号：ZL98124615.8）。二、家蚕杆状病毒表面展示技术平台体系的构建与安全有效的人用禽流感疫苗的快速制备(1) 家蚕杆状病毒表面展示技术平台体系的建立家蚕杆状病毒gp64蛋白N端为信号肽序列，近C端为跨膜结构域，外源蛋白在信号肽的C 端与跨膜结构域N 端之间发生融合，融合蛋白经过真核细胞内质网加工后，信号肽被切除，形成的N端融合蛋白可稳定地展示于杆状病毒的表面，形成刺猬状“伪病毒”。我们构建融合了家蚕囊膜蛋白gp64蛋白N端信号肽和近C端跨膜结构域的转移载体，可以方便的将目的基因和gp64信号肽与跨膜域融合，融合基因能够成功在杆状病毒中表达并展示在杆状
26、病毒的囊膜表面，形成一个带外源病毒抗原的伪病毒，该伪病毒具有外源病毒的抗原性，可以作为基因工程疫苗，安全性高。同时，杆状病毒表面展示系统能够完成翻译后蛋白质的加工修饰，使外源产物具有较高生物学活性。(2) 安全有效的人用禽流感疫苗快速制备生产工艺的建立运用杆状病毒表面展示技术构建表达H5N1型人禽流感病毒HA蛋白的重组杆状病毒Bmgp64HA，以家蚕蛹作为生物反应器生产重组杆状病毒，并以此重组杆状病毒作为人用禽流感疫苗，同时建立人用禽流感疫苗的生产工艺。人工合成含有杆状病毒gp64信号肽、跨膜区与A/Zhejiang/16/06(H5N1)毒株的HA基因的融合基因，构建重组转移载体pBacPA
27、K-gp64-HA，与线性化的野生型杆状病毒BacPAK6共转染家蚕BmN细胞，经过多轮筛选，获得表达HA蛋白的重组杆状病毒Bmgp64HA。重组杆状病毒接种家蚕蛹，建立以家蚕蛹为生物反应器生产重组疫苗的生产工艺。将重组杆状病毒接种蚕蛹后5-6天收获蚕蛹，经过多步离心、超速离心、区带离心、超滤等方法收获重组杆状病毒。每100g蚕蛹生产重组杆状病毒8-16mg。(3) 重组人用禽流感疫苗临床前的有效性评价每组14只的BALB/C小鼠按高中低剂量组分别以150g/kg体重，30g/kg体重，6g/kg体重免疫总体积1ml的禽流感疫苗，免疫3次，每次间隔2周，抗体效价达到最高峰时攻毒，观察疫苗的免疫
28、保护效果。重组疫苗对小鼠具有较好的安全性。病毒分离、RT-PCR结果显示重组疫苗可能有抵御病毒攻击的作用。模拟临床途径将重组疫苗分高、中、低剂量（480g/kg体重、160g/kg体重、53g/kg体重）进行免疫恒河猴，每组4只，当抗体效价达到1：100时用A/tiger/ harbin/(01)/2002(H5N1)毒株进行攻毒。免疫及攻毒后，各组试验动物的血生化、血常规指标均在正常范围内。免疫后动物未出现异常的临床表现，提示疫苗具有较好的安全性。攻毒后第2天高、中、低剂量组分别有2、1、1只动物中和抗体达到1：4，攻毒后第5天高、低剂量组各有1只动物中和抗体达到1：4，攻毒后第7天高、中、
29、低剂量组分别有4、2、1只动物中和抗体达到1：8，攻毒后第14天高、中、低剂量组分别有2、1、1只动物中和抗体达到1：16。病毒接种后第2天，中剂量组各有1只动物的咽拭子为阳性，高、低剂量组未分离出病毒，模型对照组均为阳性，第5、7、14天的咽拭子均未分离出病毒。病毒接种后第7天，低剂量组和模型对照组各有1只动物的肺组织中分离出病毒。14天时肺组织的病毒分离结果均为阴性。试验结果表明疫苗组的高、中剂量组有抵御病毒攻击的作用。(4) 重组人用禽流感疫苗临床前的安全性评价（a）禽流感疫苗对精神神经系统的影响小鼠一般行为、自主活动和阈下催眠剂量戊巴比妥钠协同试验和小鼠旋转协调机能试验结果显示：小鼠经
30、皮下注射给予禽流感疫苗16、8、4mg/kg和溶媒5ml/kg剂量，对小鼠精神神经系统无明显影响。（b）禽流感疫苗对心血管、呼吸系统及体温的影响猴心血管及呼吸系统试验表明：猴分别皮下注射给予禽流感疫苗3.2、1.6、0.8mg/kg和溶媒1ml/kg剂量，对猴心血管系统和呼吸系统的各项指标均无明显影响，其血压、呼吸频率、呼吸幅度和心电各指标均与给药前相似（P0.05）；对猴体温也无明显影响，其各测量时间段的平均体温与给药前相似（P0.05），也与相应时间对照组相似（P0.05）。在本试验剂量条件下，批号为20061207的禽流感疫苗对小鼠精神神经系统无明显影响。对猴心血管系统、呼吸系统和体温也
31、无明显影响。（c）禽流感疫苗大鼠、小鼠急性毒性试验健康清洁级SD大鼠和ICR小鼠分别单次皮下注射（sc）给予禽流感疫苗94mg/kg和141mg/kg剂量，主要的毒副反应为注射部位出现直径为0.10.3cm颗粒状硬块。对大鼠、小鼠皮下注射的最大耐受剂量分别为：大鼠 94mg/kg（相当于人临床拟用剂量的18800倍、大鼠有效剂量的250倍）；小鼠 141mg/kg（相当于人临床拟用剂量的28200倍、小鼠等效剂量的263倍）。（d）禽流感疫苗猴长期毒性试验食蟹猴连续8次（每10天给药1次）分别皮下注射给予禽流感疫苗3.2、1.6、0.8 mg/（kg次）、溶媒对照和0.9%NaCl注射液 1
32、ml/（kg次）剂量，其中禽流感疫苗三个剂量组和溶媒对照组对注射部位有一定的异常作用。安全无毒剂量大于3.2 mg/kg。禽流感疫苗在高达人临床拟用剂量640倍的剂量下对猴的主要毒性反应仅表现为注射部位结痂、红斑等损伤。（e）禽流感疫苗大鼠长期毒性试验SD大鼠连续八次皮下注射给予批号为20061002、20061201的禽流感疫苗，对大鼠的主要毒副反应为注射部位出现肉芽肿样结节但停药有逐渐缩小的趋势，个别血液学指标（Grn，MCV）和脏器的重量及系数（肝脏系数、脾脏重量及系数）的升降影响。毒性靶器官为脾脏，但呈可逆性影响。中毒剂量未明显显示。毒副反应剂量为1.88 mg/(kg.次)，无毒（影
33、响）剂量大于0.375mg/（kg.次）。（f）禽流感疫苗豚鼠全身主动过敏试验资料健康白色豚鼠分别皮下注射禽流感疫苗 1700g、340g/(kg.次)，牛血清白蛋白生理盐水溶液60mg（2ml）/（kg.次）和溶媒2ml/（kg.次）剂量，隔日一次，连续3次进行致敏。末次致敏后第12天由静脉单次注射4倍致敏剂量的以上相应受试物进行激发。结果显示：禽流感疫苗对豚鼠过敏反应为极强阳性，呈剂量反应关系。上述结果表明家蚕生物反应器生产的禽流感疫苗可以作为一种高效，廉价的和安全的人用禽流感疫苗。目前疫苗I期临床试验正在开展中。上述研究成果发表在PLoS ONE上。三、基于杆状病毒出芽方式的全新膜蛋白分
34、离技术平台体系的构建杆状病毒在细胞的感染初期以出芽病毒的方式穿过细胞膜并带走细胞膜以囊膜病毒的形式存在。基于此，我们以线形化可救活家蚕核型多角体病毒为对象，构建了融合gp64蛋白信号肽与人禽流感H5N1杭州分离株HA蛋白以及gp64蛋白跨膜结构区的重组质粒，经过胞内同源重组获得能高效表达该融合蛋白的杆状病毒。此重组病毒感染家蚕蛹体72小时，获得融合蛋白可展示于囊膜病毒囊膜表面的重组病毒。经过超速离心，密度梯度离心，HA活性检测，获得的重组囊膜病毒，然后反复冻融处理使囊膜与重组病毒分离，再经超速离心获得纯的囊膜成分。经过2D电泳分离后，进行酶解，质谱分析，目标蛋白中80%以上为膜蛋白。由此表明，
35、通过重组病毒的纯化可以有效地分离细胞膜成分，并因此有效获得了膜蛋白质。在重组病毒感染细胞后期112小时，细胞膜由于病毒大量出芽而破碎，但破碎的膜上仍带有大量的HA融合蛋白。通过离心纯化获得的上清经过750kD超滤后活性部分仍能够被膜截获，被膜截获的部分再经过密度梯度离心，收集带HA活性的部分，从而获得了剩余的膜成分。扫描电镜证实破裂的带有HA活性的膜成分以囊球状存在。通过提取，2D电泳，质谱分析，65以上的蛋白为膜蛋白，说明我们建立了一种全新的膜分离和膜蛋白分离的技术。基于出芽病毒并将标记蛋白展示宿主细胞表面，通过病毒出芽，将宿主细胞的细胞膜剥离于细胞而获得纯的膜结构达到分离获得膜蛋白的目的，
36、特别适合分离低丰度膜蛋白。而我们推想，若以人和动物的出芽带囊膜病毒为材料，并以同样的原理将标记蛋白展示于宿主细胞表面，就可以通过分离病毒的方式获得大量宿主细胞的膜蛋白，进而推动膜蛋白组学的研究，具有十分重要的意义。另外，可以通过特定细胞或组织培养的方式，获得特定细胞或组织的细胞膜蛋白，对药物开发具有十分重要的意义。综上所述，基于杆状病毒出芽病毒的特殊性，结合病毒表达标记蛋白于宿主细胞表面对分离细胞内其他带膜结构囊泡的膜蛋白组研究也是一个很好的方法和技术。可以达到同时把细胞的膜蛋白和囊泡等膜蛋白分离的目的，对推动膜蛋白组学的研究增添了新的手段和技术。相关研究成果发表在proteomics上。四、
37、家蚕生物反应器多角体结晶特征表达技术平台体系构建将多角体基因与目的基因融合，克隆到转移载体中，再通过在家蚕细胞BmN中与线性化BmBacPAK6病毒发生同源重组得到多角体融合表达载体，其不仅恢复了必需基因ORF1629，救活了病毒，而且恢复了多角体基因。因而，在重组病毒筛选时，除了根据传统的方法外，还可根据有无多角体来判断重组病毒。这种新的表达系统可获得更多的重组目的蛋白，因为多角体蛋白基因序列保留越多，则表达水平越接近天然多角体蛋白的表达水平（30-50%），因而目的蛋白的表达量可超过5%。这种新的表达系统还可用于表达一些难表达难纯化的蛋白，如膜蛋白。我们利用BmBacPAKph表达膜蛋白，
38、膜蛋白与多角体蛋白融合形成结晶，表达量达到14mg/蛹（2g）(如图1所示)。150100755037图1. 融合蛋白的表达五、家蚕的分子生物学研究(1) 家蚕功能基因学研究为了探索与家蚕经济性状相关的基因的功能及其表达调控的机理和家蚕发育过程中蛋白质相互作用，我们构建了家蚕蛹cDNA文库，这对于了解蚕蛹变态期间所发生的生理生化反应具有重要的意义。通过cDNA文库的构建，我们发现大量蛹期表达的功能基因，对其中部分功能基因进行了表达，抗体制备和功能研究，为进一步研究这些功能基因在家蚕生长发育调控中的作用打下基础。（a）家蚕蛹cDNA文库的构建我们构建了家蚕蛹cDNA文库并测定了2233个新的全长
39、cDNA序列（GenBank登录号：DN236876-DN237897、DN591076-DN597089、DN985172-DN985316、DN985369-DN985373、DY230449-DY231514），以浙江理工大学名义独立列入国际上具有重要影响的家蚕KAIKO数据库中（http:/kaikoblast.dna.affrc.go.jp/），成为世界共享资源。相关研究成果发表在Appl. Biochem. Biotech.上。（b）家蚕胞内维甲酸结合蛋白的表达和功能分析胞内维甲酸结合蛋白(cellular retinoic acid binding protein, CRABP)
40、是胞内脂结合蛋白的一种，与维甲酸(retinoic acid, RA)的生物学功能密切相关。维甲酸是一种重要的信号分子，能通过调节多种基因的转录、表达，诱导细胞的增殖、分化、凋亡。我们表达了家蚕CRABP并制备多克隆抗体，效价大于1：12800。生物信息学分析推测BmCRABP可能与RA的降解有关，因此我们研究了BmCRABP和全反式维甲酸(all-trans retinoic acid, atRA)的关系。首先，我们重组了真核表达质粒pEGFP-C1-CRABP，并用BmCRABP的ORF制备了RNAi用的dsRNA，用脂质体分别转染家蚕卵巢细胞Bm5后，细胞会过量表达CRABP或抑制CRA
41、BP的表达。我们用不同量的dsRNA转染细胞，atRA处理后用MTT试验检测细胞的活力，以此确定了最佳转染条件。这个试验不仅证明干扰BmCRABP的表达使细胞对RA引起的生长抑制更加敏感，同时也证明了转染的有效性。随后用pEGFP-C1-CRABP和dsRNA分别转染细胞，MTT试验表明，当Bm5细胞过量表达CRABP时，用atRA处理后，细胞对atRA诱导的生长抑制产生耐受性；当CRABP的表达被干扰而降低时，细胞对atRA引起的生长抑制作用更加敏感。亚细胞定位分析发现，CRABP是一种细胞质蛋白，用atRA处理细胞后CRABP仍存在于细胞质中。这些数据表明，在家蚕中维甲酸结合蛋白的主要功能
42、是影响atRA对细胞的生长抑制作用。相关研究成果发表在J. Cell. Biochem.上。（c）两种家蚕14-3-3蛋白的表达分析及其亚细胞定位通过家蚕蛹cDNA文库的构建获得家蚕14-3-3和14-3-3基因,我们表达并制备了该基因的多克隆抗体。相似EST搜索、荧光定量PCR和Western blotting分析表明Bm14-3-3存在于家蚕各个组织及各个时期，Bm14-3-3除了在卵以及头部中没有发现外，在其他组织及时期都有表达；Bm14-3-3的表达量在各个组织及时期均比Bm14-3-3高；两种14-3-3蛋白在丝腺中都有大量表达。通过Western blotting和免疫荧光法分析了
43、两种14-3-3蛋白的亚细胞定位，Bm14-3-3蛋白既存在于细胞质中也存在细胞核中，而Bm14-3-3蛋白主要位于细胞质中。这些说明Bm14-3-3可能是组成性表达，而Bm14-3-3的表达具有时期和组织特异性，且两种14-3-3蛋白可能对丝腺的基因表调控以及丝蛋白的形成具有重要作用。我们同时研究了Bm14-3-3在蛹、丝腺、头部、脂肪体以及肠中的结合蛋白，电泳分析发现在每一个组织中可与Bm14-3-3蛋白结合的蛋白至少有4个组分，这些组分的大小主要位于2854 kDa之间，Bm14-3-3在各组织的结合蛋白大小非常相似，这说明Bm14-3-3在细胞的各项生命活动中起着关键作用。相关研究成果
44、发表在BBA上。（d）家蚕肌钙蛋白C基因的研究肌钙蛋白C（Troponin C, TnC）是一种EF手图形超家族蛋白，可以结合Ca2+并发挥其生物学功能。目前，国内外对肌钙蛋白C的研究多数集中在脊椎动物上，而对无脊椎动物的研究较少。我们获得并表达了家蚕TnC基因，制备的相应抗体效价可达到1：25600以上。Western blotting表明，BmTnC蛋白在家蚕的表皮、肠道、头、马氏管、睾丸等组织中都有表达，且表达量依次降低，而在丝腺和脂肪体中我们并没有检测到该蛋白的存在。通过免疫组织化学实验，我们也发现该蛋白主要分布在家蚕五龄幼虫的表皮、气门、肠道、马氏管、头部等组织中，以及蛹的头部、肠道
45、、体壁等组织中。亚细胞定位结果表明，该蛋白主要存在细胞质中。我们还利用荧光定量PCR的方法，对家蚕卵、五龄幼虫、蛹、蛾等发育时期，以及五龄幼虫各组织中的靶mRNA的量进行比较。用Protein A凝胶柱纯化多克隆抗体，并将纯化所得的抗体用于制作免疫亲和柱，从家蚕中纯化天然的BmTnC，为研究该天然蛋白的功能活性打下基础。相关研究成果发表在Cell Tissue Res.上。（e）家蚕前纤维蛋白表达分析及其特征前纤维蛋白（profilin）是一种低分子量肌动蛋白结合蛋白，其在一些细胞过程中如膜转运、小的GTPase信号途径、核内活性及神经发生及分化和肿瘤形成中起重要作用，同时可能通过特异的方式连
46、接到不同的信号通路。我们获得并表达了家蚕profilin基因BmPFN，制备的多克隆抗体效价为1:32000。亚细胞定位研究表明BmPFN主要分布于细胞质中。荧光定量PCR结果显示BmPFN蛋白在各组织中丝腺表达量最高，生殖器表达量次之，脂肪体中的表达量最低；在卵、幼虫、蛹和蛾四个发育时期中，幼虫的表达量最高，蛹次之，蛾中较少，卵中表达量最少；同时Western blotting结果显示BmPFN在蛹期表达最高，mRNA转录水平和蛋白表达水平存在一定的差异，该蛋白可能存在翻译水平的调控，如microRNA对蛋白表达调控，生物信息学分析也表明该基因mRNA存在9个microRNA结合位点，正在进
47、行进一步的试验验证。RNA干扰实验显示BmPFN在家蚕细胞正常的增殖中起重要作用。相关研究成果发表在Appl. Biochem. Biotechnol.上。（f）家蚕AdoMet依赖的RNA甲基转移酶基因的RNAi及亚细胞定位研究RNA甲基化是细胞内转录后加工过程的一种形式，存在于各种生物体内，与生物合成、信号转导、蛋白修复、染色体调控及基因沉默等均有较大关系。RNA中的这些甲基化修饰主要是通过S-adenosyl-L-methionone（AdoMet）依赖的甲基转移酶(MTase)来催化的。我们获得并表达了家蚕AdoMet依赖的RNA甲基转移酶基因，制备的抗体效价为1：51200。West
48、ern印迹分析呈阳性并发现在蚕蛹中也有特异性条带，分子量为20kD左右，证实了重组蛋白的表达。免疫荧光细胞定位实验结果表明，RNA MTase大量存在于细胞质中，同时细胞核中也有RNA MTase存在，但量相对较少。我们还合成了BmRNAMTase的dsRNA，并转染了家蚕细胞Bm5，通过MTT法测细胞活性，实验结果表明，当双链RNA浓度为6.0 g/ml、干扰72h后细胞活性明显降低。同时，在干扰72 h后，用ELISA方法检测细胞中蛋白的表达量，结果表明，RNAi后细胞中的蛋白量明显减少。DNA Ladder实验表明，干扰后死细胞数量增加，但细胞并未发生正常的凋亡现象，推测是干扰后一些非正
49、常因素导致了细胞的死亡。相关研究成果发表在Comp. Funct. Genom.上。（g）家蚕中一个新Kazal型蛋白酶抑制剂的表达、定位及其功能研究Kazal型蛋白酶抑制剂广泛存在于生物体内，对机体的发育和免疫应答等生理过程发挥极其重要的作用。我们获得并表达了家蚕Kazal型蛋白酶抑制剂基因，制备的抗体效价达到1:106000以上。将爬片的Bm5细胞进行细胞免疫实验，发现BmSPI表达在细胞质中，而细胞核中几乎没有。取五龄家蚕做横切冷冻切片，用Cy3标记的羊抗兔二抗做免疫组织定位，发现该蛋白几乎遍及各组织中，特别是表皮中含量最高。提取五龄蚕的各个组织和各个时期（卵，幼虫，蛹，蛾）的总RNA，进一步用荧光相对定量PCR检测表明BmSPI在表皮中表达量最高
