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1、,第三节热原检查法,热原（pyrogen）系指能引起恒温动物体温异常升高的致热物质。它包括细菌性热原、内源性高分子热原、内源性低分子热原及化学热原等。这里所指的“热原”，主要是指细菌性热原，是某些细菌的尸体及其代谢产物。大多数微生物都能产生热原，致热能力最强的是革兰氏阴性杆菌的产物，其次是革兰阳性杆菌类，革兰阳性球菌则较弱，霉菌、酵母菌、甚至病毒也能产生热原。它的化学结构是脂多糖和微量蛋白的复合物,热原的定义,热原与细菌内毒素的区别,热原物质包括了细菌内毒素，细菌内毒素是众多热原物质中的一种，也是最主要的一种。一般来说内毒素是热原,但热原不仅仅包括内毒素。不是每一种热原都具有脂多糖的结构，但所
2、有已知的细菌内毒素脂多糖都有热原活性。在药品生产质量管理规范（GMP）条件下，药品生产的质量控制一般可以接受的观点是：不存在细菌内毒素意味着不存在热原。,热原除具有很强的致热性外，还具有下列性质：耐热性：1802小时以上或25030min以上才能彻底破坏热原。因此，玻璃制品如生产过程中所用的容器和注射时使用的注射器等，均可用高温破坏热原。水溶性：热原能溶于水，可用大量无热原注射用水冲洗以除去热原。不挥发性：热原本身不挥发，但可随水蒸汽雾滴带入蒸馏水中，故用蒸馏法制备注射用水时，蒸馏水器应有隔离装置。滤过性：热原体积极小,直径150nm,可通过普通滤器进入滤液中。不耐强酸、强碱、强氧化剂：热原能
3、被盐酸、硫酸、氢氧化钠、高锰酸钾、重铬酸钾等所破坏。,热源的性质,热原反应：热原进入机体后的数分钟至1小时内,突然发冷、寒战、面色苍白、四肢冰冷、烦躁不安等症状。持续时间约0.51小时。寒战消失后,随即高热,但也有无寒战期而突然高热者。病人体温迅速上升,在24小时体温上升至高峰,一般在3940,严重者高达41以上,病人面色潮红、头痛、恶心、呕吐。严重者瞻妄、昏迷,甚至死亡。,热原的危害,热原检查法的定义,本法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定,试验用的注射器、针头及一切和供试品溶液接触的耐高温器皿,应置烘箱中用
4、250加热30分钟（英国药典2001h）不耐高温器皿可置于30双氧水中浸泡4h，再用细菌内毒素检查用水充分冲洗，60烘干备用,实验耗材去热原,实验动物的选择,抓取兔子的正确方法：一手抓持兔颈背部皮毛，一手托起兔臀部。在热原检查前12日，供试用家兔应尽可能处于同一温度的环境中，实验室和饲养室的温度相差不得大于3，在试验全部过程中，应注意室温变化不得大于3。应避免噪音干扰。整个试验操作过程应尽量轻柔，避免激惹动物，造成体温大幅波动，影响结果。家兔在试验前至少1小时停止给食并置于适宜的装置中,直至试验完毕。读取体温：一手拿住体温计尾部，使眼与体温计保持同一水平，然后慢慢地转动体温计，从正面看到水银柱
5、时就可读出相应的温度值，切记不可用手碰触水银球端静脉给药前需将供试品温热至38（美国药典372，英国药典38.5），注射要缓慢。,注意事项,1.试验前至少1小时停止给食并置于适宜的装置中，使其适应试验环境，饲养温度与环境温度相差3。2.每隔30分钟测量体温1次，一般测量2次（英国药典测4次，但前2次舍去），两次体温之差不得超过0.2,以此两次体温的平均值作为该兔的正常体温。当日使用的家兔，正常体温应在38.039.6的范围内，且各兔间正常体温之差不得超过1。两次体温的平均值作为兔的正常体温。2、测定其正常体温后15分钟以内，自耳静脉缓缓注入规定剂量（10ml/kg）并温热至约38的供试品溶液.
6、3.每隔30min按前法测量其体温1次,共测6次。4.以6次体温中最高的一次减去正常体温，即为该兔体温的升高度数，当动物升温为负值时，以0计算。,初 试,初试结果判断:,复试及结果判断:,传统热原检测方法的不足,内毒素法：,家兔法：,费用高 结果重复性差 使用活体动物实验,只能检测细菌内毒素 鲎（hu）资源日益匮乏,鲎（hu）亦称马蹄蟹。肢口纲（Merostomata）剑尾目（Xiphosura）海生节肢动物，共4种，见于亚洲和北美东海岸。虽又称马蹄蟹，但不是蟹，而与蝎、蜘蛛以及已绝灭的三叶虫有亲缘关系。鲎(horseshoe crab)是一类与三叶虫（现在只有化石）一样古老的动物。鲎的祖先出
7、现在地质历史时期古生代的泥盆纪，当时恐龙尚未崛起，原始鱼类刚刚问世，随着时间的推移，与它同时代的动物或者进化、或者灭绝，而惟独只有鲎从4 亿多年前问世至今仍保留其原始而古老的相貌,所以鲎有“活化石”之称。,蓝血的活化石-鲎,鲎具有很高的药用价值,，它的血液中含有铜离子，它的血液是蓝色的。这种蓝色血液的提取物“鲎试剂”，可以准确、快速地检测人体内部组织是否因细菌感染而致病；在制药和食品工业中，可用它对毒素污染进行监测。科学家也使用鲎血研究癌症。但是，对鲎抽血后，它们就被放生,随着各种新技术产品的出现及现有方法存在的问题，传统热原检测方法日趋落后，不适应于产品的热原检测。,外热原 人体（分泌内热原
8、）体温调节中枢 发热,新方法主要以应用动物来源或人源细胞模拟人体，通过检测内源性热原（主要为细胞因子，如IL-6、IL-1、TNF-）在体外进行热原检测。,新方法原理,细胞（分泌内热原）,国外对新方法的研究始于20世纪80年代，国际发达国家实验室，包括英国国家生物制品检定所NIBSC、德国国家疫苗及血清研究所PEI等，均对新的体外热原检测替代方法开展了研究。,新方法国外研究现状,2010版欧洲药典已收录了5种新体外热原检测方法：人新鲜全血IL-1法 人新鲜全血IL-6法 人冻存全血IL-1法 MM6细胞IL-6法 PBMC细胞IL-6法,不使用动物进行体内实验 能真实地模拟人体对热原的反应 能检测非内毒素热原 能定量或半定量 能被广泛地应用 操作简单可行,新方法优点,新方法国内研究现状,国内对新方法的研究与国际相比有一定差距，2010版中国药典未收录新热原检测方法。国家药典委员会已经启动了体外热原检查法的课题.,兔新鲜全血法 鼠新鲜全血法 人新鲜全血法 人冻存全血法 PBMC细胞法,已开展的研究方法,感谢聆听！,时间：2017年4月,
