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1、第五章微生物的生长繁殖与生存因子,主要内容,微生物的生长繁殖微生物的生存因子不利环境因子对微生物的影响微生物与微生物之间的关系菌种的退化、复壮与保藏,第一节 微生物的生长繁殖,一、微生物生长繁殖的概念微生物的生长:是细胞物质有规律地、不可逆的增加，导致细胞体积扩大的生物学过程。微生物的繁殖:微生物生长到一定阶段，由于细胞结构的复制与重建并通过特定方式产生新的生命个体，使生命个体数量增加的生物学过程。微生物的发育：微生物从生长到繁殖的生物学过程称为发育。世代时间（代时）：微生物两次细胞分裂之间的时间。世代时间随微生物的种类、培养条件的不同而不同。,二、研究微生物生长的方法,（根据投食方式）分为分
2、批培养（间歇式培养）、连续培养两种方法（一）分批培养方法：用一定量的培养基和保持一定的培养条件培养微生物的方法（一次性的投料和接种细菌）。用途：生理特性研究（细菌的生长）、生物发酵和生物治污。细菌生长描述：重量生长曲线、数量生长曲线,1、活细菌重量变化曲线,曲线：群体重量W(mg/l)时间t,细菌内源呼吸,及细菌大量死亡阶段,曲线t点切线斜率值=?,t重量增长速率,t,（1）增长速率上升阶段,提问：为什么培养初期细菌群体重量增长速率随时间不断增大？A.营养物丰富，细菌增殖；B.细菌在细胞内以糖原、油滴等形式储存营养物，细菌个体重量增大,（2）增长速率下降阶段,提问：为什么增长速率较前下降了？,
3、增长率下,降阶段,mg/,mL,0,时间,t,活,细,胞,重,量,营养物浓度（好氧细菌还包括氧气）下降,这些限制性因素还不是十分严重，细菌的代谢速度变慢，没有停止,代谢产物积累对细菌的某些酶产生抑制,（3）内源呼吸及死亡阶段,内源呼吸+毒物浓度更高（个体）瘦死（群体）死亡率大于出生率从曲线上反映为活细菌重量的进一步持续下降。提问：此时细菌的出生率是否为零呢？为什么？不是，利用死亡细菌的残体营养,(“化做红泥更护花或人吃人”),各种生物具有类似的规律实验室通常采用细菌的数量变化绘制生长曲线，虽然两种曲线在本质上是相同的，但数量曲线也有它自身的特点和用途。,2细菌数量生长曲线,概念：细菌接种到均匀
4、的液体培养基后，在不补充营养物质或移去营养物，保持整个培养液体积不变的条件下，以时间为横坐标，以细菌数为纵坐标，反映细菌在整个培养期间菌数变化的曲线称为生长曲线。一条典型的生长曲线主要包括停滞期（加速期）、对数期、（减速期）静止期和衰亡期四个时期。,稳定期,衰老期,细菌的数量很大，都是10的n次方，取对数作图时方便，010代表11010,总菌数,活菌数,（1）停滞期“万事开头难”,特征：,细,菌,停,数,滞,目,期,的,对,数,值,0,时间t,为什么会出现停滞期呢？,代谢活跃，个体体积、重量增大 对不良环境条件较敏感 不立即进行细胞分裂、增殖，数量不变甚至减少,岗前培训,适应环境（合成相应的酶
5、），营养储备（用于复制合成）,影响停滞期长短的因素：细菌的遗传特性；接种量；接种群体的菌龄；培养基的营养组分,提问：根据上述原因选择接种何种状态的细菌停滞期会较长？对数期的细菌静止期或衰亡期受损细胞富集培养基的细菌后三种,稳定期细胞基本耗尽了各种辅酶或其他细胞成分,受损细胞养伤修复,富集培养基细菌需要合成“自力更生”酶,在实际工作中如接种菌种以启动新的水处理设施，投加新鲜污泥时，接种的细菌不习惯于新环境，会出现或长或短的停滞期，停滞期的出现会增加操作时间，降低工作效率,采用处于高效菌群对数期的菌种、增大接种量、尽量保持接种前后所处的培养介质和条件一致等方法来缩短或消除停滞期。,提问：我们可以通
6、过哪些手段缩短停滞期呢？,（2）对数期（青年）,所有细菌均繁殖,故称对数期。（相当于重量法细菌曲线的增长率上升阶段）,细菌数目N增长率倍率的对数与时间成正比。,特征,平均世代时间（繁殖一代的时间）最短细菌群体的化学组分及形态、生态特性比较一致。细菌对不良环境的抵抗能力强。提问：细菌的代时与哪些因素有关？,细,菌,数,目,的,对,对,数,数,期,值,0,时间t,如大肠杆菌在20时其代时是35条件下的2倍；伤寒杆菌在含0.125的蛋白胨培养基中的代时为800min，而在含1.0时仅为40min。,繁殖速度最快,数目呈几何级数增长；,种类遗传,、个体健康情况(营养、环境条件),此时所有细菌在二分裂生
7、长,分别测定t0时刻与t时间细菌的数量N0与Nx,对数期细菌世代时间G计算,122223(22)2)24252n,Nx=N0*2n,Nx/N0=2n,N0N024 N02n(n=1、2、3),n繁殖代数,世代时间,（3）静止期（中年）,特征细菌生长率逐渐下降至零，出生率死亡率（相当于重量变化曲线中的增长率下降阶段）细菌总数达到最大值细菌开始积累贮存物质或形成芽孢,细,菌,缓,数,慢,目,期,的,对,稳定期,对,数,衰老期,数,期,值,0 t,时间,静止原因营养短缺代谢产物大量积累对菌体产生毒害,（4）衰亡期（老年）,特征细菌代谢活性降低，衰老并出现自溶死亡率出生率（相当于重量法的内源呼吸阶段）
8、衰亡期后期部分细菌可产生抗性提问：如何给细菌延年益寿呢？补营养、环保（去除环境毒物）,人类群体有类似规律吗？,如果把地球看作是封闭的间歇式培养基，人类看作是细菌，人口若不加控制，必将经历由于资源枯竭，污染物遍地而引发的大灭绝。自救节约、节育防止“营养物消耗过快”，环保防止“有害代谢物毒性抑制”。,（二）连续培养,概念：一方面连续进料，另一方面又连续出料。原理：进料=补足营养(“污染物”)出料=稀释菌浓度、毒物浓度它又分为两种：恒浊连续培养、恒化连续培养。,（1）恒浊连续培养,恒浊培养基浊度恒定（实质是细菌数量恒定）,新鲜培养基,光电池,光源,流速控制阀,出水,通过控制流速到达到浊度恒定应用：发
9、酵工业,反馈控制,（2）恒化连续培养,化？,新鲜培养基,流速控制阀,出水,应用：环境工程、生物工程、实验室研究（细菌生理特性研究、细菌的快速筛选等）。,流速恒定,进料营养物总量,目前,污水连续生物处理法均类似于恒化连续培养；（流速不完全恒定）,三细菌生长曲线在污(废)水微生物处理中的应用,不同的废水生物活性污泥处理法中，活性污泥微生物的生长状态不同；根据废水的水质情况可利用不同生长阶段的微生物处理废水。,不同生长阶段细菌在废水处理中的应用,细菌的生,长阶段,应用举例,特点,停滞期,无,连续化稳定操作中没有这一阶段,对数生长期,高负荷活性污泥法(大部分区域),静止期,生物吸附法,常规活性污泥法(
10、大部分区域),衰亡期,延时曝气法,污泥的厌氧消化,营养物浓度过低（B/C0.3），难以满足其他阶段细菌的生长需要,1:0.40.8BOD.d-细菌与降解BOD重量比,1:0.4以下,对数期,稳定期,衰亡期,平推流式活性污泥法,细菌生长必然维持在一个与水质环境相适应的阶段；提问：同一种方式中的细菌生长状态是否一成不变呢？随水质波动而波动毒害物波动(“冲击”)营养波动(“失衡”),提问：改善废水生物处理系统中效果的关键是什么？防止“冲击”、找出并改善限制因子,“失衡”是绝对的！总有限制性营养物控制生长。(按营养配比，相对贫乏的营养物),四、微生物生长量的测定方法,1、测定微生物总数（直接计数法）借
11、助显微镜观察测定,优点：快速缺点：不能区分细菌的死活 有四种方法,（1）染色涂片计数法,1视野菌液(ml)(0.01ml 1cm2)*视野面积(cm2),（2）计数器(血球计数板）测定法,0.1ml菌液,提问：数了100个小格中有90个细菌，样品中的细菌浓度是多少？(90个100)*400/0.0001ml=3600000=3.6106个/ml适用范围：测定个体较大的细菌或原生动物细菌个体若太小、过多，由于每一小格中细菌层层叠加，相互遮挡，难以准确计数。,数数细菌（或其他微生物或细胞）数目，（一般数100个小格），折算样品细菌浓度；,（3）比例计数法,比例样品菌液与等体积的血液混合，观测二者比
12、例,提问：如果平均每个视野中细菌数量/红血球的数量比例为5.5：1，则细菌数量=？5.5400万个/m l=2.2107个/mL样品,红血球数已知(男性400500万个ml，女性350450万个ml)，平均400万个/ml,（4）比浊计数法,浊细菌悬浮液的浊度,提问：如何定量二者关系呢？,细菌不完全透光，一定范围内菌溶液的混浊度与菌数量成正比,a、制标准曲线（ODNo）,b、测菌液浊度，查图表得出细菌数量,浊度仪或721分光光度仪,2、测定活细菌数(间接计数法),提问：前述方法中计数的不都是活菌，如何分辨菌死活？繁殖提问：细菌繁殖的可见现象是什么？产生菌落（固体培养基培养）、菌液混浊（液体培养
13、基培养）计数原理：一个细菌可繁殖成一个菌落或一群细菌.缺点：慢 分固体培养法和液体培养法,无菌水,（1）稀释平板计数法固体培养法,第一步：菌样巧妙稀释,得到不同稀释度（10-x）菌液,菌样被无菌水不同稀释倍率后平板培养图,各取1ml，均匀涂布于冷固体培养基平板上或与温热液态固体培养基混合冷却。,第三步：培养,稀释度过低，菌落密集无法计数,可以计数，但数量过多，费时费力,数量合适，统计计算，作为结果,数量太少，误差因素太大，不做计数,第二步：接种平板,每一个细菌会生成一个菌落,一般计数平板的细菌生长菌落数以30300个为宜。,第四步：计数,细菌数量=？细菌数量=数出的菌落数/稀释度例如：10-5
14、稀释度时菌落数为125个细菌数量=125/10-5=1.25107个/mL 平板计数法是采用最广的一种活菌计数法如国标法水中细菌总数的测定。注意：作空白及取平行样（23组）均值减小误差,平均,（2）稀释液体计数法,特点：液体培养、统计学查表计数又称MPN法（或最可能数法）Most Probable Number例如测定SRB（硫酸盐还原菌，厌氧）的数量提问：能用稀释平板法计数吗？为什么？一般不能，厌氧菌暴露在空气中不能生长（除非厌氧培养箱）,对这类菌可以利用它们生长时产生的硫化亚铁黑色特征进行深层隔氧液体培养，按MPN法进行计数。,a、稀释,b、稀释接种样品,在液体表面加一层无菌液体石蜡隔绝氧
15、气，,恒温37培养14天,记录变黑的试管情况,c、培养,1ml,+9ml,培养基,提问：为什么有些试管变黑有些没有？,稀释程度、取样概率,d、统计查表计算,根据不同稀释度变黑试管统计出数量指标三位数及其中最低稀释度（取变黑的管数最多、稀释度又最低的生长管数，为第一位数字，后面两个稀释度的生长管数为后两位数）提问：上例情况而言统计数量是几？,查表表MPN表,320 10-4,MPN三管法测数统计表,水中大肠菌群、铁细菌、硝化菌、亚硝化菌也用这种方法进行数量统计。,个菌/毫升,细菌最可能数通过其他精确的计数法，确定的各种数量指标时细菌数量的最可能值,上面例子中数量指标“320”对应的细菌最可能数为
16、9.5个菌/毫升，最低稀释度为10-4，折算出样品中菌浓度为？个菌/毫升。,（3）薄膜计数法,薄膜微孔滤膜（0.45um）,（2）滤膜培养,膜有菌面冲上,原理膜抽滤（细菌浓缩）+膜平板培养+计数,（3）统计计数提问：假如 测出250个菌落，抽滤了50ml自来水，自来水中菌浓度是多少呢？25050ml=5个/ml自来水样品中的细菌数量=菌落数抽滤样品的体积数,要求样品洁净如空气或饮用水。？堵孔、菌太多难以分散,提问：如何用活菌计数法测定较脏的水样？减少滤液体积、无菌水稀释,3、测定细胞质量,细菌数量=细菌群体重量/单个细菌的平均重量细菌个体的湿重10-1510-11g/个细胞，干重约为湿重的10
17、20。（1）干重法,方法：含菌水样在105110下进行干燥恒重（测水中悬浮物重量MLSS或MLVSS）。,悬浮物中绝大多数为细菌时,细胞数目=MLSS个体细菌的平均干重量,恒重,或,MLSS悬浮物（表示细菌重量）,除细菌外还有大量无机悬浮物时,W无MLVSS挥发性悬浮物MLSS W无=细菌群体的干重量细胞数目=MLVSS个体细菌的平均干重量,2h,MLSS,（3）有大量非细菌有机悬浮物时,提问：如何测定呢？不能用重量法，应改用其他方法。总体来说重量法方法误差较大，一般只作为菌数粗略估算如活性污泥测定（以重量MLSS、MLVSS间接表示细菌数量）,（2）细胞含N量法,大多数生物包括细菌，细胞内的蛋白质氮含量比较稳定，一般为蛋白质干重1516，平均为16。可通过测定蛋白质氮的含量来表示细菌的生长量。,（3）DNA含量法,同种细菌的DNA含量一致,可通过测定DNA的含量来表示细菌的生长量,少量纯细菌培养时细菌数量的测定。精确性非常高，对样品纯度以及仪器和人员的要求较高，,提问：当你需要测定某水样中细菌数量时，你该如何选择方法？,视要求、水样菌量、测试条件等等灵活选取,
