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1、第二章 沉淀法,沉淀法（溶解度法）是纯化生物大分子物质常用的一种经典方法优点：操作简单，成本低廉分类：盐析沉淀 有机溶剂沉淀 选择性沉淀,第一节 基本原理,原理：根据各种物质的结构差异性（如蛋白质分子表面疏水性基团和亲水基团之间的差异性）来改变溶液的某些性质（如pH、极性、离子强度、金属离子等），进而导致有效成分的溶解度发生变化。,一、盐析法原理：是蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随盐浓度的增高而上升（盐溶），但当盐浓度增高到一定数值时，其溶解度又逐渐下降，直至蛋白质析出（盐析）。原因：盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间相
2、互聚集并从溶液中析出。,第二节 沉淀的类型与操作,一般操作步骤（蛋白质分级沉淀时常用）,1）选择一定浓度范围的盐溶液（如0-25饱和度硫酸铵），使部分杂质呈“盐析”（沉淀）状态，有效成分呈“盐溶”（溶解）状态。2)经离心后得到上清液，再选择一定浓度范围的盐溶液（如25-60饱和度的盐溶液），使有效成分等物质呈盐析状态，而另一部分杂质呈盐溶状态，用离心法收集的沉淀物即为初步纯化的有效成分物质。,1.盐的分级沉淀,（1）盐类的选择 常选用：硫酸铵优点：a.溶解度大，对温度不敏感，当水温25时，硫酸铵的饱和溶解度（即每升溶剂可溶解盐的克数）为769克。当水的温为0时，其饱和溶解度679克。,b.分级
3、效果好，有些抽提液经过加入适量硫酸铵的一次性可除杂蛋白75%以上 c.有稳定蛋白质结构的作用，将2-3mol/L硫酸铵盐析的蛋白质置低温下保存一年，其性质没有变化 d.价格低廉，废液可肥田缺点：即得到的样品欲继续纯化时，需花一定时间脱盐,（2）硫酸铵盐析的操作,固体加入法：在溶液中逐步加入固体硫酸铵，加到一定饱和度时，蛋白质可沉淀出来。注意：控制加入的速度，在搅拌下、以少量多次方式缓慢地加入，待先加的硫酸铵溶解后再加入少量的硫酸铵。,饱和溶液加入法,是使蛋白质脱水沉淀比较温和的方法蛋白质溶液中逐步加入预先调好pH的饱和硫酸铵溶液，不同饱和度所需的硫酸铵量可用计算：V需加入硫酸铵溶液的体积（毫升
4、）；V0原来溶剂的体积（毫升）；S1原来溶液的百分饱和度；S2要求达到的百分饱和度；S3需要加入硫酸铵溶液的饱和度（一般用100%的）。,优点：比加入固体硫酸铵沉淀法温和。缺点：对于大体积样品不适用。因为硫酸铵溶液的大量加入，将导致样品溶液体积增加。,透析盐析法,将盛蛋白质溶液的透析袋放入一定浓度的大体积盐溶液中，通过透析作用来改变蛋白质溶液中的盐浓度。特点：盐浓度是以连续的状态变化，可以避免盐浓度局部升高产生的不良影响，分离效果好。缺点：只用于要求较精确、样品体积小的试验。,2盐析曲线的制作,用盐析法沉淀欲分离样品时所需盐浓度范围要通过实验确定。具体步骤：取一定体积已测含量的蛋白质或酶待分离
5、溶液，调节pH至稳定范围，分6-10次加入不同量的硫酸铵：第一次加硫酸铵到溶液出现微弱混浊状态时，静置一段时间，离心或过滤即得到第一个分级沉淀部分。接着以同样的操作加硫酸铵到上清液或过滤液中，则得到第二个分级沉淀部分。,如此连续进行，便可得到6-10个分级沉淀部分。然后将每个分级沉淀部分分别重新溶解于一定体积的适宜pH的缓冲液中，根据其蛋白质或酶含量和相对应的硫酸铵浓度之间的关系作图，即可得到典型盐析曲线。在此曲线基础上，参照分级试验方法，可找出有利于提高收得率和纯化倍数的精细盐析范围。,3.盐析的影响因子,（1）盐析常数（Ka）蛋白质在溶液中的溶解度和该溶液的盐浓度的关系为：溶解度（S，以m
6、g/ml表示）的对数值与溶液中盐的浓度（M）成反比例关系，可用公式表示：lgS-Ka M式中表示有效成分在水中溶解度的对数值；M表示克分子浓度；Ka表示有效成分在特定条件下的数值，即表示有效成分的溶解度降低的速率是随着盐浓度的增加而增加的。,Ka值大，则意味着有效成分溶解度降低的速率快。因此，对一种有效成分而言，Ka值越大，分级范围越窄。盐析效果就越好。某一蛋白质的Ka值：与蛋白质本身的性质有关 与溶液的pH、温度和盐的种类等有关,(2)盐的分级范围的差异性,当分离两种以上蛋白质时，若每一种蛋白质的Ka值都很大，而且盐析范围（盐离子强度）差异明显，则分离效果好；若Ka值很大，但盐析范围差异较小
7、，则分离效果不好。,(3)pH和盐浓度,溶解度与pH和盐浓度有密切关系。当这两种因子变动时，溶解度将发生明显的变化。选择适当pH的盐溶液，可提高对有效成分的盐析效果。另外，硫酸铵水溶液显酸性，为防止其对某些蛋白质的破坏，应及时用氨水调pH至中性或视有效成分的pH而定。,(4)蛋白质的纯度和浓度,蛋白质存在的形式和浓度不同，盐析范围和溶解度也不同。在混合的蛋白质溶液中，不同分子间的相互作用会发生共沉淀现象。蛋白浓度越高，这种现象越明显，盐析分离效果则越差。因此，一般控制样品液蛋白浓度在0.2-2为宜。,(5)其它,在溶液中加1mmo1/L的EDTA-Na2盐，以除去沉淀剂中带入的金属离子。或控制
8、加硫酸铵沉淀的时间，一般二小时左右。,4脱盐,常用方法：凝胶过滤法和透析法具体操作：是把待脱盐溶液装入有一定孔径的透析袋，扎紧袋口（袋内留适当的空间）。漂在水或适当的透析液中。要防止透析液从袋口进入，以免引起透析袋胀裂。盐离子和小分子物质将穿过半透膜由高向低进行扩散渗透，而蛋白质等则留在袋内。不断更新透析液，若用温和搅动的办法则效果较好；为了避免蛋白质或酶类破坏，在低温下进行。,透析时注意：,（1）透析袋的处理 新的透析袋用蒸馏水洗净，无漏洞时，即可使用。除去透析袋中所含盐类时，处理方法：将透析袋置500毫升含1mmo1/L EDTA-Na2的2碳酸氢钠溶液中煮沸10分钟，用干净镊子或戴橡皮手
9、套取出，蒸馏水煮沸、漂洗后，可使用。用过的透析袋同样处理后，能重复使用。保存：泡在蒸馏水中置低温（4）或泡在70的乙醇中保存。,（2）选用适当的透析液 一般选用：低离子强度的中性缓冲液对含有辅基的酶透析时，在透析液中宜加入适量的辅基或保护辅基的试剂。为了防止微生物生长，透析应在4进行或在透析液中添加0.02叠氮化钠。,(3)掌握透析时间 搅拌下进行，样品液与透析液体积之比以1:10较好，一般三小时。在静止状态下过夜进行时，则比例应扩大到1:20以上。,盐脱是否彻底，要经常检查：除去硫酸铵，可用10%氯化钡检查除去氯化钠，可用10硝酸银检查透析液中检测不出现硫酸钡或氯化银沉淀，即透析完成。,二、
10、有机溶剂沉淀法,有机溶剂能降低蛋白质溶解度的原因：（1）与盐溶液一样具有脱水作用（2）有机溶剂的介电常数比水小，导致溶剂的极性减小常用的有机溶剂：甲醇、乙醇和丙酮,用有机溶剂沉淀蛋白质，需加入的有机溶剂量，一般以体积为单位计算：V需加入有机溶剂的体积V0蛋白溶液的原始体积 S1蛋白溶液中有机溶剂的浓度(体积百分浓度)S2蛋白溶液中欲达到的溶剂浓度(体积百分浓度)如果使用的有机溶剂含量不是100而是95%，则公式中的100应改95，余此类推。,需要指出：,（1）低温下操作 由于有机溶剂加入水溶液时产生放热反应会引起蛋白质变性 有机溶剂预冷至-10，在低温下进行,（2）中性盐的作用,少量的中性盐能
11、增加蛋白质在有机溶剂中的溶解度，降低有机溶剂对蛋白质的变性作用，提高分级效果。若加入过多，可引起蛋白质析出，影响有机溶剂的分级作用。中性盐的离子强度在0.05以下时，能防止蛋白质变性。用有机溶剂沉淀蛋白质时，宜在稀盐溶液或低浓度缓冲液中进行。,（3）多价阳离子的作用,蛋白质和多价阳离子（如Zn2+和Cu2+等）能结合形成复合物，使蛋白质在有机溶剂中的溶解度降低。这对在高浓度溶剂中才能沉淀的蛋白质特别有益。例如，在某些蛋白质溶液中只要加入0.005-0.02nmol/L Zn2+，就可大大减少有机溶剂的用量，而将蛋白质沉淀出来。,三、蛋白质沉淀剂,碱性蛋白质 多价阳离子的碱性蛋白质，如鱼精蛋白，
12、除能有效地沉淀核酸类物质外，还能沉淀某些蛋白质。缺点：（1）反应不可逆，应用受到限制（2）在应用多价阳离子物质时，因其水溶液pH值为2-3，所以要小心地中和后，再加到蛋白质溶液中,2凝集素,植物中特殊的蛋白质，对糖蛋白中糖链的末端糖序列具有明显、特异的凝集力。例如，伴刀豆球蛋白与含有葡萄糖、甘露糖等分子的糖蛋白能发生特异的凝集沉淀作用，通过离心操作可把糖蛋白和一般蛋白质分开，获得的凝集素-糖蛋白复合物用单糖作抑制剂就能使其解离。优点：反应条件较温和，专一性强,3重金属,重金属盐如铅盐、汞盐作为蛋白质沉淀剂能使蛋白质或酶纯化。重金属会使蛋白质变性，因此控制在较温和的条件下进行，并要及时通过透析方
13、法把蛋白质和重金属尽快分开。,四、聚乙二醇沉淀作用,水溶性非离子型聚合物，可使蛋白质发生沉淀作用。沉淀作用较满意的聚合物是分子量在400-6000之间的聚乙二醇。优点：条件温和，不易引起蛋白质变性，沉淀较完全，应用范围广。缺点：易受各种因子如pH、离子强度、蛋白质浓度及聚合物分子量的影响。,五、选择性沉淀法,根据各种蛋白质在不同物理化学因子（如温度、酸碱度和有机溶剂等）作用下稳定性不同的特点，用适当的选择性沉淀法，即可使杂蛋白变性沉淀，而欲分离的有效成分则存在于溶液中（或者发生可逆性沉淀），从而达到纯化有效成分的目的。,原理：等电点、热变性、酸碱变性和特殊的可逆沉淀作用优点：选择性较强，方法简
14、单，种类较多缺点：应用范围较窄应用范围：各种生物大分子物质的沉淀,六、结晶,改变溶解度产生沉淀的方法蛋白质沉淀：晶体沉淀和无定形沉淀结晶过程是纯化过程。在提纯阶段，当某一纯蛋白质溶液的浓度达到较高（5%-30%）水平时，若条件适合，就能产生一定形状的结晶。当蛋白质溶液中混有杂质时，即使条件适合，也得不到整齐的结晶，或无结晶形成。用显微镜观察结晶的有无及形状，为判断提纯物质纯化程度的一种方法。,对难结晶的物质，有时采用加入少量“晶种”引子，或进行适当搅拌，或在容器壁上用玻棒轻轻摩擦等办法，对结晶形成有加速作用。,对难结晶的物质，有时采用加入少量“晶种”引子，或进行适当搅拌，或在容器壁上用玻棒轻轻摩擦等办法，对结晶形成有加速作用。,
