第四章：(酶工程)酶的提取与分离纯化ppt课件.ppt

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1、第四章 酶的提取与分离纯化预处理（pretreatment）：包括固液分离和细胞破碎（分离胞内产物）等。初步纯化（rough fractionation）（提取）：除去与目的产物性质差异很大的杂质。高度纯化（fine fractionation）（精制）：除去与产物性质相似的杂质。浓缩与干燥（concentration and desiccation）（成品加工）:使酶与溶剂分离的过程。,酶纯化的基本原则：建立一个方便灵敏的分析方法；选择有效的纯化方法，尽可能减少纯化步骤；常在低温（4）条件下进行纯化，以避免酶的变性。,第一节 细胞破碎（一）细胞壁组成 细胞壁的主要成分：细菌：肽聚糖(N-乙酰

2、萄糖胺，N-乙酰胞壁酸)酵母：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白质 真菌:多糖（几丁质和葡聚糖）,各种微生物细胞壁的结构与组成,细菌细胞壁的结构,酵母菌细胞壁的结构 M甘露聚糖；P磷酸二酯键；G葡聚糖,（二）细胞破碎的方法 机械法 物理法 化学法 生物法（酶解）,1.机械法：1）液体剪切：搅拌、匀浆。2）固体剪切：研磨，捣碎。2.物理法：1）超声波破碎法。2）渗透压突变法：高渗（蔗糖，高盐等）平衡后迅速转入低渗溶液或水中。3）冻融法：反复低温冰冻，室温融化。,3.化学法 应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细胞膜结构改变或破坏。1）有机溶剂处理：破坏膜磷脂结构，常用丙酮、丁醇、氯仿等。2）表面活性剂处理：常用

3、非离子型表面活性剂，如Triton X-100,Tween80等。,4.酶解法（enzymatic lysis）：外加酶法：根据细胞壁的结构和组成特点，选用适当的酶。自溶法（autolysis）:细胞结构在本身具有的各种水解酶作用下发 生溶解的现象。,第二节 酶的提取(extraction)把酶从生物组织或细胞中以溶解状态释放出来的过程，即将尽可能多的酶，尽量少的杂质从原料中引入溶液。,提取目标：a.将目的酶最大限度地溶解出来。b.保持生物活性。注意：温度升高，溶解度加大。但为防止酶失活，一般采用低温下（010）操作。,提取原则a.相似相溶。b.远离等电点的pH值，溶解度增加。,提取方法：（一

4、）盐溶液提取 常用稀盐（常用NaCl）溶液（盐溶），对酶稳定性好、溶解度大，最常用。（二）酸、碱溶液提取（三）有机溶剂提取,影响酶提取的因素：酶在溶剂中的溶解度 酶向溶剂中的扩散速度 温度 pH值 提取液的体积,第三节 沉淀分离（根据溶解度的不同）,使溶液中的溶质由液相转变为固相析出古老、实用、简单的初步分离方法,在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法：中性盐沉淀（盐析法）有机溶剂沉淀 选择性沉淀（热变性和酸碱变性）等电点沉淀 有机聚合物沉淀,（一）盐析沉淀法（改变离子强度）,1.基本原理（盐溶和盐析）向蛋白质或酶的水溶液中加入中性盐，可产生两种现象：1)盐溶（salting in）：低浓度的

5、中性盐增加蛋白质的溶解度。2)盐析（salting out）：高浓度的中性盐降低蛋白质的溶解度。,蛋白质的盐析,硫酸铵对马血红蛋白的溶解度的影响,离子强度,盐 析,盐溶,原因：高盐浓度下盐离子与蛋白质分子争夺水分子，除去蛋白质的水合外壳，降低溶解度而沉淀。不同蛋白质分子量、表面电荷不同，在不同盐浓度下沉淀，逐渐增大盐浓度，不同蛋白质先后析出，称分段盐析。,蛋白质分子表面的疏水区域和荷电区域,1）中性盐的选择 常用（NH4）2SO4，其突出优点：a.溶解度大b.分离效果好 c.不易引起变性 d.价格便宜,2.盐析用盐,2)盐浓度的表示 用饱和（溶解）度表示:溶液中饱和硫酸铵的体积 饱和度 溶液的

6、总体积,3)调整盐浓度的方式 a.饱和溶液法（添加饱和硫酸铵溶液）适用于：蛋白质溶液体积不太大，而达到的盐浓度又不太高时。配制饱和硫酸铵溶液,所需添加饱和硫酸铵的体积可按下式计算：S2-S1 V=V0 1-S2式中 V,V0分别为所需加入的饱和硫酸铵体积及原溶液体积S2,S1分别为所需达到的硫酸铵饱和度和原来溶液的硫酸铵饱和度,b.添加固体硫酸铵适用于：蛋白质溶液原来体积已经很大，而要达到的盐浓度又很高时。实际使用时，可直接查表（各种饱和度下需加固体硫酸铵的量）。,调整硫酸铵溶液饱和度计算表,盐析操作,低饱和度：饱和溶液滴加法。易于迅速混合均匀，一般终饱和度不超过40。高饱和度：固体盐添加法。

7、不会大量增加溶液体积。1）固体硫酸铵充分研细，温和搅拌中缓慢加入。2）冰箱中（4）放置过夜，待沉淀完全后高速离心。3）沉淀再溶解后可用超滤（ultrafiltration）、透析（dialysis）或层析（chromatography）方法脱盐。,3.盐析曲线的制作 如要分离一种新的蛋白质和酶，应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和度。蛋白质量(mg)或酶活力 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 硫铵 饱和度,4.离子强度和种类（介绍盐析常数）蛋白质溶解度与盐浓度之间的关系：,I：离子强度，I=1/2MZ2；M：离子浓度（mol/L）；Z：离子价数S：离子强度为I时的蛋白质的

8、溶解度（g/L）S0：离子强度为0时蛋白质的溶解度（g/L）Ks：盐析常数，是与蛋白质和盐种类有关的特性常数。Ks代表盐析效率，其含义是随着盐浓度的增加，蛋白质溶解度降低的速度，Ks越大盐析效果越好。,当温度一定时，S0对于某一溶质是常数，用表示，盐析方程式可改写为：log S=-Ks I 两种盐析法：Ks分级盐析法：在一定的pH和温度条件下，利用不同蛋白质Ks的不同，通过改变离子强度或盐浓度（即改变I值）的沉淀方法。分级盐析法：在一定离子强度下，通过改变溶液的pH及温度的沉淀方法。,（二）有机溶剂沉淀（降低介电常数）利用酶等蛋白质在有机溶剂中的溶解度不同而使之分离的方法。1.沉淀机理 降低溶

9、液的介电常数 部分地引起蛋白质脱水2.常用有机溶剂 丙酮乙醇甲醇，用量一般为酶液体积的2倍左右，终浓度为70%。,3.优缺点：优点：1）分辨率比盐析法高 2）沉淀不需脱盐 3）溶剂易蒸发，沉淀易离心缺点：1）容易引起蛋白质变性失活2)有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。,（三）等电点沉淀(isoelectric precipitation)1.原理 蛋白质在等电点时溶解度最低 不同的蛋白质具有不同的等电点 2.使用方法 单独使用较少（用于从粗酶液中除去某些等电点相距较大的杂蛋白），多与其它方法联合使用（如盐析法、有机溶剂法），因蛋白质在等电点时仍有一定的溶解度。,3.优点：1）大多数蛋白质的p

10、I都在偏酸性范围内 2）无机酸（如磷酸、盐酸、硫酸）价格较低4.缺点：酸化时，容易引起蛋白质失活,（四）有机聚合物沉淀法 1.作用机理：与有机溶剂类似，是发展较快的一种新方法。2.沉淀剂：常用聚乙二醇（Polyethyene glycol，简写 PEG）多用分子量为600020000的 PEG。3.优点：操作条件温和，不易引起生物大分子变性。沉淀效能高，使用少量的PEG即可沉淀相当 多的生物大分子。,（五）选择性变性沉淀法 选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白质变性沉淀而不影响所需蛋白质的方法。热变性 几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固，加热升高温度使杂蛋白变性沉淀而保留目的物在溶液中。pH

11、变性 等电点沉淀法是pH变性法中的一种变体。有机溶剂变性 使那些对有机溶剂敏感的杂蛋白变性沉淀。,举例：牛红细胞提取Cu，ZnSOD的生产工艺：,新鲜牛血,收集,除血浆离心,红细胞,浮选,2NaCl,干净红细胞,溶血,溶血液,去血红蛋白,乙醇、氯仿,上清,分级沉淀,丙酮,沉淀物,热变性,SOD粗酶液,超滤,浓缩液,柱层析,精制浓缩液,冷冻干燥,冻干粉,70,DEAEsephadex A50,第四节 离心分离一 基本原理1.离心力 Fc m r 2 m r（2 N/60）2 N为离心机每分钟转数（r/min）；Fc通常以相对离心力RCF（relative centrifugal force）表示

12、，即离心力F的大小相当于地球引力（重力常数g）的多少倍。一般用g（或数字g）表示。,RCF=m r（2 N/60）2/mg=1.12 10-5 N2 r 此公式描述了相对离心力与转速之间的关系通常：低速离心以每分钟的转数表示，如：4000r/min。高速离心（超速），常以相对离心力（RCF）表示，如：65000g。两者可换算或查测算图。,计算近似RCF的列线图,2.沉降系数（sedimentation constant）指单位离心力下颗粒的沉降速度,用S表示。对于某一具体的颗粒，S是定值。(1S=1013秒）常用S表示某些生物大分子、亚细胞及亚细胞器的大小，如16sRNA，蛋白质的沉降系数一般

13、在1 200之间。离心时间 lnr2lnr1,2,=St,二 离心机的种类 按离心机转速的不同，分为：常速（低速）高速 超速,离心机的种类,实验室离心机,温度类型：常温及冷冻超速离心机均为冷冻型。使用冷冻离心机时提前降温，预冷离心头。使用超速离心机时先抽真空。,离心的形式,角式及外摆式：外摆式一般为低速，角式由低速到超速均有。,角式离心机和离心头（转子）,角式离心头要配套，低温使用要预冷，操作注意稳、盖、旋紧。,离心机的大小：落地式及台式,小台式离心机,离心管,材质：玻璃，塑料强度：和离心速度相配大小：和转子配套高速超速管要加盖,离心机操作,平衡、定温、定速、定时。,三 常用离心方法 差速离心

14、法 密度梯度离心 等密度梯度离心,1差速离心（differential centrifugation）采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分批分离的方法。特点：用于分离大小和密度差异较大的颗粒。优点：操作简单。缺点：1）分离效果较差，不能一次得到纯颗粒。2）沉降的颗粒受到挤压。,差速离心分离示意图（a）离心前的悬浮液（b）（e）离心不同时间后颗粒的沉降情况,2密度梯度离心（density gradient centrifugation）样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降系数比较接近的组分得以分离的一种区带分离方法。常用的密度梯度溶液是蔗糖溶液。,特点：区带内的液相介质密度小于样

15、品物质 颗粒的密度。适宜分离密度相近而大小不同的固相 物质。,密度梯度离心示意图（a）离心前（b）离心后,Density gradient ultracentrifugation,密度梯度离心,步骤：A.形成密度梯度 B.加样 C.离心 D.收集样品,3.等密度梯度离心 又称沉降平衡离心（sedimentation equilibrium centrifugation）。根据颗粒的密度不同而进行分离。离心时，在离心介质的密度梯度范围内，不同密度的物质颗粒或向下沉降，或向上漂浮，达到与其相同的密度时不再移动，形成区带。,常用氯化铯（CsCl）作为梯度介质。特点：介质的密度梯度范围包括所有待分离物

16、质的密度。适于分离沉降系数相近，但密度不同的物质。,等密度梯度离心示意图（a）离心前；（b）离心后,沉降速度离心和沉降平衡离心的特点,总结：等密度梯度离心是一种测定颗粒浮力密度的静力学方法，关键在于选择氯化铯浓度，使之包括待分离物的密度范围。差速离心是一种动力学方法，关键在于选择适合于各分离物的离心力。密度梯度离心兼有以上两种方法的特点，关键在于制备优质的密度梯度溶液。,四 应用 根据不同离心目的，分为制备性离心：分离纯化和制备分析性离心：测分子量、沉降系数、密度、纯度（生化上P294）,第五节 过滤与膜分离 过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同形状物质分离的技术过程。非膜过滤：粗滤，部分微滤

17、 膜过滤：高分子膜,介质,一、非膜过滤 高分子膜以外的材料：滤纸，滤布，纤维，多孔陶瓷，烧结金属等1.粗滤（通常所说的过滤）截留直径大于2m的大颗粒，使固液分开。助滤剂：硅藻土，活性炭，纸粕,根据推动力的产生条件不同，过滤分为三种：常压过滤 加压过滤 减压过滤2.非膜微滤：微孔陶瓷，烧结金属作介质,二、膜分离 借助一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、形状、性质的颗粒或分子进行分离的技术。,（一）扩散膜分离 透析（dialysis）,溶质分子Y 从高浓度一侧通过膜向低浓度一侧移动,蛋白质透析,1.透析膜 商品透析膜大多制成管(袋）状。材料：纤维素衍生物。1）透析膜的预处理：目的：除杂质。2）透析袋

18、的保存：防腐剂冷藏。透析袋在使用前最好在EDTA-NaHCO3溶液中煮过，以除去生产过程中混入的有害物质，特别还应检查一下有无破损、泄漏处，这样才能装入待透析液，两头扎紧，进行透析。一般透析液需更换35次。透析袋使用完后，一般可用清水冲洗干净，再次检查是否完好，然后浸入75乙醇溶液中保存备用。,2.透析方法及装置,透析袋透析简单装置。A:透析夹，B:透析，C:透析示意图,3.用途 蛋白纯化中，除去无机盐等小分子物质。缺点：透析时间较长，透析后体积较大，浓度 较低，难于工业化生产。,（二）加压膜分离 根据所截留物质颗粒大小的不同，分为：,微滤(Microfiltration，MF)一种静态过滤，

19、随过滤时间延长，膜面上截流沉积不溶物，引起水流阻力增大，透水速率下降，直至微孔全被堵塞；,超滤(ultrafiltration，UF)一种动态过程，由泵提供推动力，在膜表面产生两个分力：一个是垂直于膜面的法向分力，使水分子透过膜面，另一个是于膜面平行的切向力，把膜面截流物冲掉。,超滤原理的示意图,利用超滤膜在一定压力下使溶液中大分子滞留，而小分子及溶剂滤过的方法。超滤法在蛋白质溶液除盐、浓缩及分离纯化中有广泛的应用。,通常用纤维素、聚砜等材料制成，使用时要注意膜的正反面。使用后要及时清洗，一般可用超声波、中性洗涤剂、蛋白酶液、次氯酸盐及磷酸盐等处理，使膜基本恢复原有通水量。如果暂不使用，可浸泡

20、在加有少量甲醛的清水中保存。,超滤膜,常规过滤(A)和超滤(B)的示意图,A,B,超滤浓缩装置,反渗透（Reverse osmosis，RO）,利用反渗透膜选择性地只能透过溶剂(通常是水)的性质，对溶液施加压力，使溶剂通过反渗透膜而从溶液中分离出来的过程。（无离子水制备；海水淡化）,渗透与反渗透,（三）电场膜分离（1）电渗析：在半透膜的两侧分别装上正、负电极。（2）离子交换膜电渗析：用离子交换膜代替一般的半透膜。应用：脱盐，海水淡化，纯水制备，从发酵液中分离柠檬酸、谷氨酸等带有电荷的发酵产物。,第六节 层析法,层析法也称色谱法，是1903年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。

21、将植物色素溶液通过装有CaCO3 吸附剂的柱子，然后用石油醚淋洗，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开。,色谱起源,色谱,组分,色素,石油醚,碳酸钙颗粒,用色彩（chroma）和图谱（graphs）组成色谱一词（Chromatography)。,层析法的基本原理,利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在流动相和固定相中的分布程度不同，并以不同的速度移动而达到分离的目的。mobile phase：携带样品流过整个系统的流体 stationary phase：静止不动的一相,层析法的分类,流动相有两种状态：*液体作为流动相*气

22、体作为流动相 固定相也有两种状态：*固体吸附剂作为固定相*以吸附在固体上的液体作为固定相按两相所处的状态分类：液相层析 液-固层析 液-液层析 气相层析 气-固层析 气-液层析,按层析过程的机理分类：吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异。分配层析：利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数 的不同。离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同。凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用 的不同。亲和层析：利用生物分子与配基之间专一而又可逆的亲和力。层析聚焦：将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析的特性结合在一起，实现组分分离。,按操作形式不同分类：柱层析：将固定相

23、装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。薄层层析：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定。,层析设备,层析装置：梯度混和器 蠕动泵 层析柱 监测仪 记录仪 收集器,记录仪,低温层析柜,层析操作,分离前：1）树脂预处理：凝胶溶涨。离子交换纤维素需作酸碱处理。2）装柱：重力沉降法，要求均匀，无气泡。3）平衡：层析柱使用前，须用缓冲液平衡至所需的pH值和离子强度。,层析操作,分离中：上样：体积尽可能小。平衡：用缓冲液使不被吸附的杂蛋白穿过。洗脱：连续梯度洗脱：连续改变缓冲液的pH或离子强度。阶梯式梯

24、度洗脱：分段地改变缓冲液的pH或离子强度。等温平衡洗脱：用平衡缓冲液直接进行扩展洗脱。同时进行分步收集和检测。分离后：再生，平衡，保存。,蛋白质定量-分光比色仪(A280)法 蛋白质分子中的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸残基（主要是色氨酸Trp和酪氨酸Tyr 的共轭双键）对紫外光有吸收，以色氨酸吸收最强，最大吸收峰为280nm。,在波长280nm具有吸光的氨基酸,紫外吸收法,平衡、吸附,盐梯度冲洗分管收集,蛋白测定制图,测A280,（一）吸附层析（adsorption chromatography）1.原理 利用固定相的固体吸附剂表面对不同组分吸附力的大小及洗脱液对它的溶解作用（解吸作用）的差异进行

25、分离。,吸附作用的强弱主要与吸附剂和被吸附物质的性质有关。吸附层析的关键是吸附剂和洗脱剂的选择。,2.吸附剂 吸附剂通过范德华力、静电引力、疏水作用等与待分离物质的极性官能团作用。1）吸附剂的选择：根据吸附能力强弱分为：弱吸附剂：蔗糖、淀粉 中等吸附剂：碳酸钙、磷酸钙、硅胶等强吸附剂：氧化铝、活性炭,吸附剂的选择根据相似相溶原则：极性强的吸附剂易吸附极性强的物质非极性的吸附剂易吸附非极性的物质。但为了便于解吸附，对于极性强的物质通常选用极性弱的吸附剂进行吸附。,2）吸附剂的性质：活性炭：常用的吸附介质。硅胶：常用的极性吸附介质。羟基磷灰石（HA）Ca10(PO4)6.(OH)2:微晶型的磷酸钙

26、制品，表面有Ca2+和PO43-两种带电基团；酸性和中性蛋白质可与Ca2+结合；碱性蛋白质可与PO43-结合。吸附原理是HA的Ca2+与蛋白质的负电荷基团作用。,3.洗脱剂要求：粘度小，纯度高，稳定性好，完全洗脱下所要分离的成分,易与目标分子分离。选择：具有较高洗脱能力的洗脱剂作为流动相。生物大分子一般选择中性盐溶液为洗脱剂。,4.应用 分离纯化生物大分子,（二）凝胶过滤层析 凝胶过滤（gel filtration）又称分子筛层析（molecular sieve chromatography）、排阻层析（exclusion chromatography）,是以各种多孔凝胶为固定相，利用溶液中各

27、组分的分子量不同而进行分离的技术。,1.基本原理 大分子物质不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；小分子物质可自由出入凝胶孔，流程长而后流出层析柱。按分子量有大小顺序流出层析柱。,凝胶对溶质的排阻程度可用分配系数Kd表示：Ve-Vo Kd=ViVo外水体积，层析柱内凝胶颗粒之间空隙的体积（ml）Vi内水体积，层析柱内凝胶颗粒内部各微孔体积的总和（ml）Ve某组分的洗脱体积，从加进层析柱到流出液中该组分出现高峰时的洗脱液体积（ml）,凝胶过滤柱色谱洗脱的三种峰.Kd=0时,即Ve=Vo,说明该组分分子量足够大，不进入微孔，最先流出。.Kd=1时,即Ve=Vo+Vi，说

28、明该组分能进入凝胶的全部内空隙，最后流出。.其它组分0Kd1,因分子大小而改变洗脱峰的位置。Kd小的先流出，Kd大的后流出。,分配系数Kd的意义：1)可定量地衡量各组分的流出顺序。2)判断分离效果，Kd差异大，分离效果好，Kd差异小，分离效果差。,2.凝胶的种类和性质 1)交联葡聚糖凝胶 商品名:Sephadex 型号 Sephadex G10至G-200 G 后的数字为凝胶吸水值的10倍。数字越大，交联度越小，孔径越大，分离范围越广。,葡聚糖凝胶层析介质的有关参数,2）琼脂糖凝胶 商品名:Sepharose（瑞典）;Bio-Gel A(美国）依靠糖链之间的次级键维持网状结构，琼脂糖密度越大，

29、网状结构越密集。,Sepharose及Bio-gel A 型号,3）聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel）商品名为Bio-Gel,型号从 Bio-Gel P2至P-300，P值越大，孔径也越大。以丙烯酰胺为单体，以甲叉双丙烯酰胺为交联剂聚合成的高分子聚合物。,3.操作：1）凝胶的选择和处理 根据相对分子质量范围选择相应型号的凝胶介质。将干胶悬浮于510倍的蒸馏水中，充分溶胀，抽气，装柱。2）柱的选择 采用L/D比值高的柱子，可提高分辨率，但影响流速。,3）加样 体积不能过多，不超过床体积的5，脱盐时可在10左右。4）洗脱 洗脱液与平衡时用的buffer一致。洗速不可过快，保持恒

30、速。5）胶的保存 洗脱完毕后，凝胶柱已恢复到上柱前的状态，不必再生处理。用0.02%NaN3防腐。,4.应用 1）脱盐)生物大分子物质的分离纯化 3）分子量的测定 4）溶液浓缩,LogM=k1-k2Ve,（Ve为洗脱体积）,先测得几种标准蛋白质的Ve，并以其分子量对数对Ve作图得一直线，再测出待测样品的Ve，查标准曲线即可确定分子量。,蛋白质的洗脱体积与其分子量有关,（三）离子交换层析（ion exchange chromatography，IEC）1.原理:根据待分离物质带电性质不同的分离 纯化方法。,1）离子交换剂：离子交换剂由载体、电荷基团和反离子构成。,如羧甲基纤维素离子交换剂组成 纤

31、维素OCH2COO-Na+载体 电荷基团 反离子,化学原料合成：树脂类物质 载体 天然材料制成：cellulose sephadex sepharose 阳离子交换剂:电荷基团（）,反离子（）电荷基团 阴离子交换剂:电荷基团（）,反离子（）如：DEAE-纤维素，CM-Sepharose,离子交换剂,-带有电荷基团的不溶性载体,-O-CH2CH2N-H,CH2CH3,CH2CH3,Cl-,载体,Diethylaminoethyl(DEAE),两种离子交换剂,阴离子交换剂：常用二乙氨基乙基，二乙氨基乙基2-羟丙基阳离子交换剂：常用羧甲基 CM CH2COO 磺丙基 SP C3H6SO3,DEAE

32、C2H4N+(C2H5)2HQAE C2H4N+(C2H5)2CH2CH(OH)CH3,离子交换葡聚糖,以Sephadex G-25,G-50为骨架，接入离子交换基团。DEAE（QAE）Sephadex A-25，A-50 CM（SP）Sephadex C-25，C-50 A：anion 阴离子 C:cation 阳离子,离子交换葡聚糖,离子交换剂的选择a.强、弱离子交换剂的选择：强型：适用的pH范围广，制备无离子水 弱型：适用的pH范围窄，分离生物大分子物质 b.阴、阳离子交换剂的选择：酶的稳定性若pI稳定，蛋白质带负电荷，用阴离子交换剂,2）蛋白质的电荷性质,pH 值如何影响蛋白质的电荷数

33、,2,4,6,8,10,12,14,0,系统 pH,+蛋白质带正电荷,蛋白质带负电荷,等电点,-,2.阴离子交换剂分离蛋白质的过程,平衡,吸附,去吸附,分离结束,再生,+,低盐,高盐,利用不同盐浓度将不同蛋白质洗脱下来,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,3.操作 装柱 上样 平衡 洗脱收集 再生1）上样：上样体积不十分严格。2）洗脱:增加溶液的离子强度 梯度洗脱法 改变溶液的pH值 3）再生：用0.5mol/LNaOH和0.5mol/L NaCl混合溶液或0.5mol/

34、L HCl处理。4.应用 制备纯化生物大分子,（四）疏水层析（Hydrophobic Interaction Chromatography,HIC）从分离纯化的机制看，属吸附层析类。利用疏水层析介质和蛋白质分子都具有一定的疏水性质，根据被分离成分与固定相之间疏水力大小的不同而进行分离。,大多数蛋白质具有较强的亲水性，但分子内部存在一个疏水核心，欲让蛋白质与疏水性固定相结合在一起，可以靠蛋白质表面的一些疏水补丁（hydrophobic patch），或让蛋白质发生局部变性（可逆），暴露出掩藏于分子内的疏水性残基。,原理:,在高盐浓度下，蛋白质发生局部可逆变性，被迫与疏水层析的固定相结合在一起，然

35、后通过降低流动相的离子强度，即可将结合于固定相的蛋白质，按其结合力大小，依次进行解吸附。,2.吸附剂 亲水性（如 Sepharose）基质固定相 疏水性（如硅胶、树脂）配体（疏水性基团）（苯基、辛基、烷基）,一些商品疏水层析介质,3.操作1）加样：样品溶液中补加适量的盐。2）洗脱：用降低盐浓度的平衡缓冲液洗脱。3）再生：除去固定相吸附的杂质，用水或 8mol/L 脲素溶液。4.应用 主要用于分离纯化大分子物质。,（五）亲和层析(Affinity Chromatography)由吸附层析发展起来的，是从复杂混和物中纯化蛋白质的最好方法。又称：功能层析（function chromatograph

36、y）生物专一吸附（biospecific adsorption）选择层析（selective chromatography）,1.原理 利用生物大分子间特异的亲和力来纯化生物大分子，如：抗原和抗体；酶和底物或辅酶或抑制剂；激素和受体；RNA和其互补的DNA等。,将待纯化物质的特异配体通过适当的化学反应共价的连接到载体上，待纯化的物质可被配体吸附，杂质则不被吸附，从层析柱流出，变换洗脱条件，即可将欲分离的物质洗脱下来，实现分离提纯。,+,C,C,C,配基,蛋白质,1.配基固相化,2.亲和吸附,固体载体,3.解吸附,2.可被应用的基质（载体）：（按性能优劣排序）琼脂糖凝胶、聚丙稀酰胺凝胶、葡聚糖凝

37、胶、纤维素。最常用的是琼脂糖，Sepharose 1B到10B,3.配体的选择 一对可逆结合的生物分子中与载体相偶联的一方称配体。如抑制剂，底物，抗体，辅酶等。优良配体须具备的条件：1）与待纯化的物质有较强的亲和力。2）具有与基质共价结合的基团。,目的产物与相应的配基,4.偶联（亲和吸附剂的制备）配体一定，改造载体（基质）1）基质活化：不同的载体活化需要不同的活化剂。常用：溴化氰（CNBr）、环氧氯丙烷、1,4-丁二醚、戊二醛、高碘酸盐、苯醌等。,溴化氰法是最早使用且最常用的活化方法。如用CNBr 作用于葡聚糖和琼脂糖的糖羟基,2）引入连接臂（space arm）又称手臂（spacer）“接臂

38、”的目的：克服影响配基与生物大分子的结合的空间障碍。“接臂”的途径：常用二胺化合物（丁二胺、乙二胺、己二胺）。目前带有各种手臂的系列载体已有商品供应。如：AH-Sepharose 4B,常用手臂,5.操作：1）层析前：制备亲和层析剂 选择根据欲分离物质特性 配基 选择根据配基分子大小及基团特性 载体2）洗脱：能削弱酶和亲和吸附剂间的相互作用。包括：非专一性洗脱和专一性洗脱,偶联,亲和层析剂,非专一性洗脱：改变温度 改变pH值 改变离子强度专一性洗脱：竞争性洗脱剂（半抗原、抑制 剂、底物类似物）被吸附物质结合竞争性地与 配体结合,6.应用1）纯化大分子物质如：纯化糖蛋白用凝集素（能可逆性地结合碳

39、水化合物的蛋白质），Lectin-Sepharose 4B2)研究酶的结构与功能：分离有生物活性与失去生物活性的蛋白质。,该法是在等电点聚焦方法基础上发展起来的，其分离纯化蛋白质的依据是等电点的差异和离子交换行为。蛋白质按其等电点在pH梯度环境中进行排列的过程叫做聚焦效应。pH梯度的形成(由多缓冲剂和多缓冲交换剂形成)是聚焦效应的先决条件，如果一种蛋白质加到已形成pH梯度的层析柱上时,由于洗脱液的连续流动，蛋白质将迅速地迁移到与它等电点相同的pH处。从此位置开始，该蛋白质将以缓慢的速度进行吸附、解吸附，直到被洗出。,（六）层析聚焦（Chromatofocusing）,层析时的聚焦效应示意图,层

40、析聚焦的操作过程：1.选择适宜的多缓冲液离子交换剂和多缓冲液溶液2.pH梯度溶液的形成例：PBE94阴离子交换剂：起始buffer平衡到pH=9，再用pH=6 buffer流过层析柱3.蛋白质的层析聚焦 层析介质pH pI Pr+下移 层析介质pH pI Pr-与柱结合4.洗脱过程：pH下降，Pr+下移；pH pI，Pr-与柱结合，不断重复洗脱-吸附-再洗脱，Pr按pI大小而被分离5.再生：同步骤2,第七节 电泳分离,电泳（electrophoresis,EP）：指带电粒子在电场中向着与其所带电荷性质相反的电极方向移动的过程。电泳技术是根据各种带电粒子在电场中迁移速度的不同而对物质进行分离的实

41、验技术。,一、电泳的基本理论 1.原理:,在一定pH条件下（用buffer），不同大小、形状及带电颗粒在电场中的移动速度不同（用迁移率表示），各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。,+,-,影响迁移率的因素：1）颗粒性质：Q越大、r 越小、形状越接近球形，v 越快。2）电场强度：E越高，v越快。3）溶液性质：pH值：离pI越远，v越快。（用buffer保持恒定）离子强度：离子强度越高，v 越低。原因：离子氛（ionic atmosphere）。通常，缓冲液离子强度在0.02-0.2之间。4）电渗：在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。应避免用高电渗物质作支持介质。,自由界面电泳：又称移动

42、界面电泳（moving boundary electrophoresis,MBEP），指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。区带电泳:（zone electrophoresis,ZEP）指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。,2.电泳的分类,按支持介质种类的不同，区带电泳可分为：纸电泳：用滤纸作为支持介质，多用于核苷酸的定性定量分析。醋酸纤维素薄膜电泳：医学上，常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白，优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电泳分辨率高。以上两种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子筛效应，主要靠被分离物的电荷多少进行分离。,琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分析。琼脂糖

43、凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。分辨率较高。聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质。,3.电泳常用设备（1）电泳仪：为电泳提供稳定直流电源的装置。常压电泳仪（600V）高压电泳仪（3000V）超高压电泳仪（30000V50000V）（2）电泳槽：自由界面电泳槽 管状电泳槽 板状电泳槽（3）附属设备：,水平板式电泳槽,垂直板式电泳槽,二、聚丙烯酰胺凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。,1.凝胶

44、制备 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（acrylamide，简称Acr）和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺（methylane bisacrylamide，简称Bis）在催化剂和加速剂作用下聚合的。并且可以通过改变丙烯酰胺浓度和交联剂浓度而制成不同孔径的凝胶。,CH2=CH,C=O,NH2,CH2=CH,C=O NH CH2 NH C=O CH2=CH,-CH2-CH-CH2-CH-nCH2-CH-C=O C=O NH2 NH CH2 NH C=O-CH2-CH-CH2-CH-nCH2-CH-C=O C=O NH NH2,丙烯酰胺,N,N-甲叉双丙烯酰胺,聚丙烯酰胺,聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有

45、两种：1）化学催化系统：AP-TEMED 催化剂：过硫酸铵（ammonium persulfate，AP）加速剂：TEMED（N，N，N，N-四甲基乙二胺）2）光催化系统：核黄素光（TEMED）催化剂:核黄素（维生素B2）引发剂:光 TEMED的存在，可加速聚合。,.,聚丙烯酰胺凝胶：丙烯酰胺N,N甲叉双丙烯酰胺聚合而成,凝胶的机械强度、弹性和透明度粘着度取决于凝胶总浓度（T）和交联度（C）。T=C=凝胶浓度越大（小），孔径越小（大），可分离分子量较小（大）的颗粒。Acr与Bis的重量比应在30左右。,凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系,Acr（g）+Bis（g）,V（ml）,X100%,Acr

46、（g）+Bis（g）,Bis（g）,X100%,聚丙烯酰胺凝胶浓度参考表,2.分离效应 PAGE根据其有无浓缩效应，分为：连续电泳（continuous electrophoresis）采用相同孔径的凝胶和相同的缓冲系统不连续电泳（discontinuous electrophoresis）采用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系 电荷效应不连续PAGE 分子筛效应 浓缩效应,连续PAGE,1）电荷效应:分离胶中，蛋白质表面净电荷不同，迁移率不同。2）分子筛效应：大小和形状不同的样品分子通过一定孔径的分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。3）浓缩效应：使样品在浓缩胶中被浓缩成一条窄带，然后再

47、进入分离胶进行分离。,不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳,系统的不连续性表现在以下几个方面：1.凝胶由上、下两层凝胶组成，两层凝胶的孔径不同，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。2.缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液，而分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。因此，在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即样品的浓缩效应，凝胶的分子筛效应和电荷效应，提高了分辨率。,8.3,8.3,8.9,6.7,聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图(A为正面,B为剖面)(1)样品缓冲液pH6.7(2)浓缩胶pH6.7(3

48、)分离胶pH8.9(4)电极缓冲液pH8.3,三、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）简称SDS PAGE。是目前测定蛋白质亚基相对分子量（relative molecular mass,Mr）的一种最好的办法。,SDS-PAGE separates proteins,1.原理：SDS是一种阴离子去污剂，带有大量负电荷，与蛋白质结合后使蛋白质所带负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异。SD

49、S破坏蛋白质氢键、疏水键，巯基乙醇使二硫键打开，引起蛋白质构象改变，使蛋白质SDS复合物形状近似椭圆形，短轴相同（1.8nm），长轴与蛋白质分子量成正比。因此，蛋白质SDS复合物(SDS-denatured protein)在凝胶中的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影响，只与椭圆棒长度（蛋白质分子量）有关。,两者关系：蛋白质的迁移率与分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bXMW：分子量；X：迁移率；k、b均为常数 将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据其相对迁移率即可在标准曲线上求得分子量。,2.操作：（SDS-

50、PAGE及PAGE，即变性及非变性）1）准备：贮存液制备；玻璃板（管）洗净干燥2）制胶:（变性：buffer 中加0.4%SDS）a.分离胶：根据待分离样品的分子大小选择一定浓度的分离胶（查表），配制分离胶溶液：Acr:Bis=29:1，分离胶buffer,TEMED,AP,水 迅速倒胶，加水使液面平坦，室温0.5h聚合完全。b.浓缩胶：用浓缩胶buffer。插上梳子。,3）样品制备：a.PAGE:样品样品缓冲液（蔗糖或甘油指示剂溴酚蓝）b.SDS-PAGE:样品样品缓冲液（SDS，甘油，巯基乙醇，溴酚蓝），煮沸25min，以除去亚稳态聚合。4）加样及电泳：拔掉梳子，胶上留下凹槽，加样，倒入电