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1、风湿病诊断 实验室检查及其他特殊检查,一般性检测：常规血、尿液、肝肾功能检查免疫功能检查：免疫球蛋白、补体、T细胞亚群特异性检查血清自身抗体、HLA检测、关节液等影像学检查Xray，MRI,超声 等关节镜与滑膜活检病理检查：,Noninflammatory on leftInflammatory on right,自身抗体与分类命名,自身抗体（autoantibodies）：各种原因造成B细胞产生针对自身组织成分的抗体。生理性（亲和力、滴度、阈值），病理性。分类：按照自身抗体在体内分布分为器官/组织特异性抗体和非器官/组织特异性抗体。按照基质不同分为细胞特异性抗体和非特异性抗体等等。细胞抗体主
2、要为非器官/组织特异性抗体，组织抗体主要为器官/组织特异性抗体。命名：以抗体在细胞和组织位置命名（胞浆、核、核仁、线粒体），以靶细胞和靶组织命名等等。以患者名字命名（Sm、Ro）以疾病名字命名（SS-A、Scl-70）以抗原的化学性质命名（RNP、DNA）以抗原的部位命名（Anti-mDNA）。,自身抗体检测方法免疫荧光法（immunofluorescence,IF)酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)放射免疫法(radioimmunoassay,RIA)被动血凝法(passive hemagglulination,PHA)颗粒凝集法
3、(particle agglutination,PA)对流免疫电泳法(countercurrent immunoelectrophoresis,CIE)免疫双扩散法(agar gel double immunodiffusion,ID or DID)免疫印迹法(immunoblotting,IB)免疫沉淀法(radioimmuno precipitation assy,RIP)斑点酶免疫渗透试验(dot immunoenzyme filtration assy,DIEFA)斑点金免疫结合试验(dot immnuogold filtration,DIGFA),间接免疫荧光法,原理,荧光显微镜下A
4、NA的染色型别,均质型：与抗组蛋白和抗DNA有关斑点型：与抗ENA有关周边型：与抗dsDNA有关核仁型：4-6sRNA着丝点型：在SD及CREST中出现,ANA：均质型,EUROIMMUN,抗核抗体,ANA：斑点型,EUROIMMUN,抗核抗体,ANA：核膜型,EUROIMMUN,抗核抗体,Westernblot HEp-2 cell extract,免疫印迹法检测ENA,原理,国内现状,自身抗体的测定不普遍欠规范对其意义了解尚少缺乏研究,自身抗体测定准确率欠佳的原因分析,1.测定方法不规范 底物选择(鼠肝、Hep-2);试验方法(IIF、ELISA、IB)2.试剂(盒)标准化问题 厂家不同，
5、质量参差不齐3.技术人员专业水平 严格的培训；操作方法及结果判定的差异,表1 放置4 1d、3d、5d、7d、14d时血清APF转阴率Table 1 Lost of positive rate of APF after serum had been separately stored for 1,3,5,7,14days at 4,a P0.01 vs controls,表2 室温分别放置1d、2d、3d、5d、7d时血清APF的转阴率Table 2 Lost of positive rate of APF after serum had been separately stored for
6、1,2,3,5,7days at room temperature,a P0.01与对照组转阴率的比较值,2、抗原底物在不同温度保存不同时间对血清APF的检出率影响 将抗原片于4保存至3天时已出现APF的检出率的丢失（10%），无统计学意义；到5天后已有35%的检出率的丢失，具有统计学意义（P0.05）；放置7天后检出率的丢失为40%，统计学意义显著（P0.01）；放置14天检出率的丢失已有一半（见表3）。而在-20下保存2周内检出率无变化。,表3 4时 抗原底物保存时间对血清APF的检出率影响Table 3 Influence of time of antigenic substrate b
7、e stored on the occurrence of APF in serum,a P0.05 vs controls,b P0.01 vs controls,ANA检测的意义,有助于疾病的诊断，如抗Sm是SLE标记抗体；抗ScL-70 是SD的标记抗体，抗Jo-1是PM/DM的标记抗体观察疾病活动度和治疗反应研究发病机理,几种核抗原分子特性,几种核抗原分子特性,抗核抗体新概念（FANA）传统定义：顾名思义是指抗细胞核抗原成分的自身抗体的总称 狭义定义 现代定义：是指抗细胞内所有抗原成分的自身抗体的总称。对ANA的理解已不再局限于核成分，而是指抗核酸(nucleic acid)和核蛋白（
8、nucleoprotein)抗体的总称 广义定义 靶抗原分布：细胞核 细胞核、细胞浆、细胞骨架、细胞分裂周期,ANA由来,中性粒细胞,DNP(DNA-Histone)+抗DNP+补体,均质体,LE细胞,LE细胞：并非SLE特有，PM、SD、RA、SS等结缔组织病，药物过敏，慢活肝等亦可阳性。抗DNP取代LE细胞的检测,+,抗核抗体的分类,1.抗DNA抗体,抗双链DNA(dsDNA)抗体抗单链DNA(ssDNA)抗体抗左旋DNA(z-DNA)抗体,2.抗组蛋白抗体,总组蛋白抗体（AHA）H1、H2a、H2b、H3、H4,3.抗非组 蛋白抗体,抗可溶性核抗原(ENA)抗体：Sm、RNP、SSA、S
9、SB、Scl70、Jo-1、pM-1、PCNA、RANA、Ku、Mi-1、-2抗体、DNP抗体等。,抗着丝点抗体(ACA),4.抗核仁抗体:抗5rRNA、核小体、U3nRNP、Nor-90抗体。,5.抗其它细胞成分:线粒体、中心体等。,抗核抗体,类风湿因子（Rheumatoid Factor）,抗人或动物的IgG的FC片段抗体。其本身是免疫球蛋白，因此，RF有IgG、IgM、IgA型等。RF无种族和种属特异性与DNP及半抗原（二硝基苯）有交叉反应。7S IgM(IgG)-RF主要参与关节外症状的免疫复合物形成，且与疾病活动性有关,如何评价类风湿因子,是诊断RA的标准之一，不是唯一标准，并非RA
10、特有作为血清阴性脊柱关节病区分标准正常人2%阳性，老年人可达5%阳性RF与其他蛋白、半抗原有交叉反应多种结缔组织病（SLE，SD，SS，PM/DM）感染疾病（SBE，TB，hepatitis）,肝硬化，弥漫性肺纤维化，结节病等均可阳性病后半年才产生，有关节外表现者，滴度高。持续高滴度RF预示疾病严重，预后差,类风湿关节炎的自身抗体,名 称,敏感性(%),特异性(%),类风湿因子RA33/36抗体Sa抗体抗角蛋白抗体抗核周因子抗CCP抗体抗CB10抗体抗BiP抗体,50-70 25-45373338-6260-707270,8693.678-9787-9270-909670-8892,自身抗体与
11、风湿病,62.3,74.3,84.3,40,50,60,70,80,90,RF,CCP,RF/CCP,敏感度（%）,不同抗体检测的敏感度,聚丝蛋白抗体群,不同抗体在RA诊断中的意义,聚丝蛋白抗体群,系统性红斑狼疮的自身抗体,抗 体 敏感性(%)特异性(%),抗核抗体(ANA)dsDNA抗体抗Sm抗体膜DNA抗体核小体抗体U1RNP抗体SS-A 抗体SS-B 抗体抗心磷脂抗体类风湿因子PCNA抗体组蛋白抗体核蛋白抗体,809599949287-9470407530955050,99702578855025-351520-4025530-8058,自身抗体与风湿病,抗双链DNA抗体（短膜虫免疫荧光
12、法 1:5）,抗组蛋白抗体（酶联免疫吸附法X2SD),系统性红斑狼疮 50%其他结缔组织病23-30%服异烟肼12月以上53%服苯妥因钠6月以上18%服他巴唑6个月0活动期SLE 90.2%阳性,抗H1 H2A H2B H2A-H2B H3 H4系统性红斑狼疮+长期服异烟肼+类风湿关节炎+SLE以IgG型抗组蛋白抗体为主，而长期服烟肼及RA病人以IgM型为主,抗组蛋白抗体（免疫印迹法）,几种ENA的由来及同义词,Sm：病人名：SmithRNP:u1RNP或nRNP Nuclear RibonucleoproteinSSA:RO Sjogrens syndrome ASSB:La,Ha,Sjog
13、rens syndrome BJo-1:病人JohnScL-70:Scleroderma,常见结缔组织病的抗核抗体的阳性率,ANA dsDNA Histone Sm n RNP SSA SSB ScL-70 Jo-1 着丝点 核仁SLE 90（62）50（25）40 39 10 0 0 0 6SS 50 15 30 0 14（75）（59）0 0 0 9SD 75 5 27 0 12 19 5 30 0（20）（39）PM/DM50 13 0 5 0 0 0(20)0 10RA 23 10 23 0 0 20 5 0 0 0 15+,+有指端硬化ANA 1:40（+），抗dsDNA30%(或1
14、：5）（+）,磷脂抗体（Phospholipid antibody）,多见于SLE（70%），SS、白塞病、自身免疫性血小板减少、真性红细胞增多、免疫性血管炎、习惯性流产、恶性肿瘤、多发性硬化、传染性疾病、肾上腺出血和Addison病均可阳性,抗磷脂抗体检测,包括：狼疮抗凝物；抗心脂抗体，梅毒血清试验假阳性。抗磷脂抗体还有抗磷脂氨酸（Anti-phosphotidyl serine）和抗磷脂酸（Anti-phosphtidil acid）抗体等。,抗磷脂抗体检测,磷脂基因中具有抗原性：心磷脂、磷脂碱、酰丝氨酸、酰肌醇脂和酰乙醇脂等2GP1（载脂蛋白）与磷脂结合，使其改变表面结构，暴露中被识别的
15、抗原决定簇，而呈现磷脂抗体特性。2GP1是必需的辅助因子，测2GP1可能比测ACL更有意义。,干燥综合征的自身抗体,自身抗体 阳性率(%),ANA抗SSA抗体抗SSB抗体 抗a-胞衬蛋白抗体抗M3受体抗体 类风湿因子ANCA抗M2抗体 ACA抗RNP抗体,60-8050-7030-60 65-8792 60-8010-251327,自身抗体与风湿病,其他风湿病的自身抗体,硬皮病(PSS)皮肌炎/多肌炎(DM/PM)血管炎 抗磷脂抗体综合征 混合性结缔组织病(MCTD),Scl-70抗体抗着丝点抗体(ACA)抗核抗体(ANA)PM-1抗体Jo-1抗体抗核抗体(ANA)抗中性粒细胞胞浆抗体(ANC
16、A)抗内皮细胞抗体(AECA)抗磷脂抗体(Acl)狼疮抗凝物质 U1RNP抗体(70kd)抗核抗体(ANA),自身抗体与风湿病,抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA),靶抗原：中性蛋白酶3（PR3），髓过氧化物酶（MPO），杀菌/通透性增高蛋白（BPI），丝氨酸蛋白酶，人白细胞弹性蛋白酶（HLE），乳铁蛋白（LF），组织蛋白酶G，葡萄糖醛酸酶，溶菌酶,抗中性粒细胞胞浆抗体（Anti-Neutrophil Cytoplasmic Antibody,ANCA）,cANCA(PR3蛋白酶)中性粒细胞胞浆内荧光染色，其抗原是中性粒细胞颗粒内的和单核细胞溶酶体的丝氨酸蛋白酶，此种抗体主要与Wegeners肉芽
17、肿相关，且与疾病活动性相平行，结节性多动脉炎也可阳性。,抗中性粒细胞胞浆抗体（Anti-Neutrophil Cytoplasmic Antibody,ANCA）,pANCA（MPO）指核周染色，并非周边型核抗体。其抗原是胞浆内髓过氧化物酶，弹力蛋白酶及某些成分，此种抗体与特发性新月体肾小球肾炎相关，且与疾病活动度相平行。显微镜下多动脉炎，结节性多动脉炎也与之有关,类风湿关节炎 抗CCP抗体、BiP抗体、AFA、抗GPI抗体、抗CB10抗体 系统性红斑狼疮 抗膜DNA抗体、抗核小体抗体、Hu抗体、SmD1抗体 干燥综合征 抗M3抗体、抗a-胞衬蛋白抗体、抗b-胞衬蛋白抗体 其他 AECA、抗S
18、p100抗体、抗Calpastatin抗体、抗a-enolase抗体,新发现的自身抗体,自身抗体与风湿病,RA实验室及特殊检查,类风湿因子（RF）RF分RF-IgG RF-IgA RF-IgM，胶乳凝集法测出的主要是IgM型RF，ELISA法可进一步检出其它型临床意义：类风湿关节炎（阳性率70%）其它自身免疫性疾病（SLE、干燥综合症等）可阳性慢性活动性肝炎、某些感染性疾病（传染性单核细胞增多症、结核病感染性心内膜炎等）也可出现阳性,RA实验室及特殊检查,RA早期诊断指标抗CCP抗体抗MCV抗体抗角蛋白抗体（AKA）以上抗体中两项同时阳性者91.3%可确诊RA,抗聚丝蛋白抗体群,抗聚丝蛋白抗体
19、群研究回顾,聚丝蛋白抗体群,Novel exciting antibodies,in Rheumatoid Arthritis,对应抗原,颊黏膜前聚丝蛋白部分去磷酸化产物,聚丝蛋白的核心抗原多肽衍生物,抗聚丝蛋白抗体群,食道上皮前聚丝蛋白及其中/酸性异构体,纯化聚丝蛋白,聚丝蛋白抗体群,抗P68抗体 新的类风湿关节炎特异性抗体,抗BiP抗体 新的类风湿关节炎特异性抗体,以HeLa细胞为底物，分别加入待测血清和FITC标记的山羊抗人IgG,各在室温下孵育1小时，然后在荧光显微镜下观察（4010),图为抗BiP抗体阳性的荧光核型,P68,抗P68抗体在各种风湿性疾病中的阳性率,抗P68抗体在RA的
20、敏感性和特异性,敏感性为 67.76%特异性为 91.28%,BiP,抗P68抗体和其他自身抗体敏感性及特异性的比较,类风湿关节炎,抗P68抗体在血清阴性RA患者的阳性率,类风湿关节炎的新抗原(1),类风湿关节炎的新抗原(2),类风湿关节炎的其他抗体,抗核周因子抗RA33/抗RA36抗Sa抗体6磷酸葡萄糖异构酶（6GPI）。,核小体结构如图所示,抗核小体抗体和其他抗体的敏感性和特异性比较,阳性例数,敏感性,%,特异性,%,AnuA,37,67.3,97.4,dsDNA,25,45.5,95,Sm,15,27.3,99,AHA,18,32.7,30,DNP,15,27.3,80,AnuA,Anu
21、A与dsDNA的关系,N AnuA(+)AnuA(-)阳性率%dsDNA(-)30 17 13 56.7 dsDNA(+)25 20 5 阳性率%27.8,AnuA,统计学上差异显著（r=0.322,p=0.016）,AnuA与SLEDAI评分的关系,AnuA,抗细胞膜DNA抗体(mDNA)新的系统性红斑狼疮特异性抗体,以Raji细胞为底物抗mDNA抗体核型,抗mDNA抗体在不同疾病的阳性率,注：SLE与各组比较P值均0.01,cmDNA,抗mDNA抗体和其他抗体的比较,cmDNA,抗mDNA抗体在血清阴性SLE中的阳性率,cmDNA,2023/1/11,临床常用免疫学检查,67,ENA多肽
22、7项是目前临床最多应用于风湿病检查的项目,类风湿因子72抗核抗体92抗SSA80抗SSB40%抗线粒体20抗甲状腺抗体50抗唾腺管抗体30抗着丝点抗体12抗胞忖蛋白抗体抗M3抗体,SS的B细胞活化-多种自身抗体,a-胞衬蛋白多肽抗体在CTD的阳性率,a-FA,a-胞衬蛋白多肽抗体与其他自身抗体的敏感性和特异性的比较,a-FA 54 73 88.7SSA抗体 3851.3 64.7SSB抗体 917.9 85ANA 2743.6 42.6,抗体类别 阳性例数 敏感性（%）特异性（%）,a-FA,a-胞衬蛋白与其他化验指标的关系,a-FA,抗M3蛋白抗体 干燥综合症的特异性抗体,抗M3受体抗体在S
23、S及对照组的阳性率,M3,SS患者血清抗M3受体抗体与其他自身抗体的比较,M3,M3受体抗体在血清阴性SS患者的阳性率,M3,SSc的自身抗体,在SSc 的病程早期就有广泛的免疫系统活化95%SSc病人ANA阳性,某些自身抗体对SSc及其亚型有特异性：抗着丝点抗体-lcSSc(包括CREST)抗拓扑异构酶抗体（anti-Scl70）、抗-RNA 聚合酶III-dcSScAnti-U1 RNP、Pm/Scl、Ku-重叠综合征（SSc、SLE、多肌炎）,一些临床表现与相应抗体出现有相关性：ILD-anti-Scl70指端坏死-抗着丝点抗体肺动脉高压-抗着丝点抗体、anti-U3 RNP/fibri
24、llarin、anti-Th/To肾危象：anti-RNA 聚合酶III,抗内皮细胞抗体：诱导内皮细胞分泌黏附分子 诱导内皮细胞凋亡Anti-fibrillin-1 刺激成纤维细胞合成胶原抗成纤维细胞抗体 刺激成纤维细胞合成胶原Anti-PDGF受体抗体：结合到成纤维细胞，刺激胶原合成Anti-MMP3 抗体 抑制细胞外基质降解，促进纤维化,肌炎的自身抗体,IIM的血清学分型,Dept of Rheumatology,新的肌炎特异性抗体Anti-SAE(anti-SUMO-1)Anti-MDA5(anti-CADM-140)Anti-TIF1-(anti-155/140)Anti-SMNAnt
25、i-NXP2,袁凯，卢昕中华风湿病学杂志2013,四、ANCA相关性血管炎,ANCA相关性血管炎,是否仅有ANCA即可诊断WG的？不能，因为治疗毒性大，多患者确诊仍然需要精确病理ANCA高滴度是否提示病情活动？不能在大组病例调查，病情活动时ANCA增高在个体病人ANCA与病情活动不相关，不能用于指导治疗,AIH相关抗体,I 型 ANA SMA(抗平滑肌抗体)II 型 抗LKM1(抗肝肾微粒体抗体1)III型 抗SLA(可溶性肝脏抗原),AMA亚型抗体种类及其疾病相关性,结 论,认识自身抗体测定的意义 开展必要的自身抗体检测 强调自身抗体测定的规范化 加强专业培训和技术支持,自身抗体检测的质量保证,建立全面的质量管理体系 国际国内标准（WHO、IUIS、CDC）实验室的建立与临床医生的交流合作（sensitivity and specificity of autoantibody test，accumulating information on epidemiology of autoantibodies）自身抗体检测的敏感度和特异性（阳性阴性对照，result further confirmation、two level determination，免疫荧光模式、滴度等等）,
