《分子克隆技术ppt课件.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《分子克隆技术ppt课件.ppt（47页珍藏版）》请在三一办公上搜索。
1、分子克隆技术,限制性内切酶,特定的识别序列，46个碱基对在识别序列内固定位置切割，5-端磷酸基因，3-端羟基基团切割后形成粘性或平滑末端,C A T C G A C G A A T T C,G T A G C T G C T T A A G,G A A T T C T G C C A G G T,EcoRI酶切位点,双链切开,C T T A A G A C G G T C C A,C A T C G A C G,A A T T C,G,C T T A A,G A C G G T C C A,A A T T C T G C C A G G T,G,DNA连接酶,形成新的DNA双链,G T A G
2、 C T G C T T A A,A A T T C T G C C A G G T.,C A T C G A C G,G A C G G T C C A.,.G T A G C T G C T T A A,限制性内切酶和DNA连接酶,质 粒,细胞内独立于染色体外的环状DNA，能自我复制其上基因可借助宿主细胞的转录、翻译系统得以表达分子200050000bp,pGEM-T vector map,Sub-cloning construction of recombinant pCIA-P insertion of A-P DNA fragment into plasmid pCI,构建质粒的特点
3、,Ori区：复制起点Par区：保证质粒均匀分布于子细胞多克隆区：人为构建，便于克隆操作选择因子：含特定基因，如耐抗生素基因，使克隆后便于挑选,接 合,在适当的条件下，雄性菌和雌性菌混合时形成配对的雄性-雌性菌，并有遗传物质的单向转移。雄性菌：含F性因子，染色体外环状DNA,转 化,外源DNA能进入细胞内并通过整合至宿主DNA中或独立复制保存于宿主细胞内。,转 录,利用噬菌体为媒介，将供体DNA转移到受体菌内的现象，能在自然状态下发生。,分子克隆常用技术,DNA电泳基因转移核酸杂交聚合酶链反应PCR,DNA电泳,可分离不同分子量的DNA,对临床菌株的第二次PCR 扩增产物电泳图谱分析 Lane
4、17:临床菌株S.sobrinus;Lane 814:临床菌株 S.mutans.,核酸杂交,原理：在一定条件下（温度、pH值等）DNA双股螺旋可解开并分离在一定条件下，两股游离的互补的核苷酸可自行配对形成双股,Southern Blot,电泳、转移、杂交确定分子量,斑点杂交,目标序列的存在目标序列的量,聚合酶链反应PCR,细菌形态生化反应免疫反应分子生物学方法-分子探针杂交-RFLP-PCR,唾液在与龋病相关微生物检测中的应用,与龋病相关微生物的定量检测方法,在人类口腔中检出率很高茸毛链球菌可能比变形链球菌与龋损活跃性之间的关系更密切,变形链球菌和茸毛链球菌,唾液在与龋病相关微生物检测中的应
5、用,套式PCR快速检测人类唾液中变形链球菌和茸毛链球菌.谭海平，边专，樊明文，陈智，范兵.中华口腔医学杂志，2003，38：223-226,唾液在与龋病相关微生物检测中的应用,套式PCR（Nested PCR）,5,3,Template,Outer primer2,Outer primer1,The first PCR,5,3,Inter primer2,Inter primer 1,Next template,The second PCR,5,3,The second PCR product,本套式PCR的引物是分别根据变形链球菌gtfB基因和茸毛链球菌gtfI基因设计的内、外两套引物（ou
6、ter primer,inter primer）,gtfB gene of S.mutans,Outer primer thp4,Outer primer thp3,The first PCR,Inter primer thp8,Inter primer thp7,Outer primer thp6,gtfI gene of S.sobrinus,Outer primer thp5,The first PCR,Inter primer thp10,Inter primer thp9,The second PCR,The second PCR,抽提细菌染色体DNA（Igarashi et al.
7、1996）-细菌-唾液PCR反应过程 第一次PCR反应 预变性:94 4min 变性:94 1min 退火:51 1min 30 cycles 延伸:72 2min 最后延伸:72 5min 第二次PCR反应,a b c d e f g hLadder 1 2 3 4 5 6 7 8,选择外引物行第一次PCR后扩增产物电泳图谱分析以变链菌组(Mutans Streptococci)染色体 DNA为模板 Lane 1:S.cricetus AHT;2.S.rattus BHT;3.S.mutans Ingbritt;4.S.sobrinus OMZ176;5.S.mutans LM-7;6.S.
8、mutans OMZ175;7.S.sobrinus 6715;8.S.downei Mfe28.,MW(Kb)2.0 1.0 0.25 0.1,0.75 0.5,a b c d e f g h Ladder 1 2 3 4 5 6 7 8,选择内引物行第二次PCR后扩增产物电泳图谱分析 Lane 1:S.cricetus AHT;2.S.rattus BHT;3.S.mutans Ingbritt;4.S.sobrinus OMZ176;5.S.mutans LM-7:6.S.mutans OMZ175;7.S.sobrinus 6715;8.S.downei Mfe28.Marker:DL
9、2,000 Ladder,MW(Kb)2.0 0.75 0.5,1.0,0.25,0.1,Ladder 1 2 3 4 5 6,第一次PCR的灵敏度 变形链球菌S.mutans Ingbritt 的数量 Lane1:108 CFU;Lane 2:107 CFU;Lane3:106CFU;Lane 4:105 CFU,MW,(Kb),2.00.75 0.5,1.0,0.25,2.0 0.5,Ladder 1 2 3 4 5 6,1.0 0.75,0.25,MW(Kb),第二次PCR的灵敏度 变形链球菌S.mutans Ingbritt 的数量 Lane 1:104 CFU,Lane 2:103
10、CFU,Lane1.chromosomal DNA from S.mutans Ingbritt;2.chromosomal DNA from S.sobrinus 6715;3.saliva sample from subject A;4.saliva sample from subject B;5.saliva sample from subject C.,利用PCR直接从唾液样本中检测变形链球菌S.mutans和茸毛链球菌S.sobrinus(图A)利用外引物(图B)利用内引物,Real Time PCR,在PCR反应体系中加入能结合到扩增产物上的荧光物质，并通过Real Time PC
11、R检测系统对PCR反应过程中的荧光信号强度进行实时监测，最终对实验数据进行分析处理的方法适应于定量,Real Time PCR应用,基因表达分析（mRNA）SNP分型基因拷贝数变化（DNA）转基因食物的定量分析,Real Time PCR原理（一）,PCR每进行1个循环，DNA呈2倍的指数关系增长，不久到达平台期。起始 的DNA量越多扩增产物便越早达到阈值，也就是扩增曲线越早起峰。将已知浓度的标准品梯度稀释进行Real Time PCR，就会按照起始DNA量由多到少的顺序等间隔得到一系列曲线。,Real Time PCR原理（二）,再由Ct值（达到阈值时的循环次数）与起始模板量的对数值之间存在的线性关系，就可以制作成下图所示的标准曲线。未知浓度的样品与标准品相同，也可以得到Ct值，将Ct值代入标准曲线，就可以求出未知浓度样品的起始模板量。,分子克隆的主要步骤,基因文库的建立目的基因的筛选目的基因的分析,原核生物基因文库的建立,提取细胞DNA限制性内切酶酶切DNA片段连接至质粒或噬菌体转化宿主细胞（大肠杆菌）,目的基因的筛选,核酸杂交免疫学检测,目的基因的分析,DNA序列启动子分析推测蛋白质一级结构推测蛋白质二级结构,
