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1、,生物显微技术进展,组织学和细胞生物学进展细胞生物学专题,主 要 内 容,五、电子显微镜样品制作技术,一、显微技术发展简史,透射电子显微镜,扫描电子显微镜,光学显微镜,一、显微技术发展简史,生物显微技术是指在显微镜的观测范围内用生物材料作实验对象的专门技术。主要包括生物的组织、细胞化学，生物切片技术，显微观察，绘图测量及显微摄影技术，显微注射、切割、挑离等操作技术，还包括显微镜及相关设施的使用和保养。1665年，从英国物理学家罗伯特虎克发现细胞开始，产生了显微技术。罗伯特虎克：第一位显微技术学家。,1.生物显微技术的概念,一、显微技术发展简史,2.生物显微技术的发展,我国伟大科学家墨子早在二千
2、多年前就研究了放大和缩小的作用，即研究了放大的基本原理。中国人戴眼睛已有一千多年的历史，是世界上最早的。因此可以说显微镜是中国人最早发明的。公元1世纪初，在罗马哲学家的笔记中，大自然打磨的奇妙石头被称为“放大器”（magnifier）或“点火石”（burning glasses）。,一、显微技术发展简史,荷兰人詹森于1590 年制造了第一台由二块透镜组成的复式显微镜。,一、显微技术发展简史,1610年前后，意大利的伽利略和德国的开普勒在研究望远镜的同时，改变物镜和目镜之间的距离，得出合理的显微镜光路结构，当时的光学工匠遂纷纷从事显微镜的制造、推广和改进。,一、显微技术发展简史,17世纪中叶，英
3、国的罗伯特胡克（用自己制造的显微镜观察软木切片，“细胞”）和荷兰的安东尼冯列文胡克（制造了只有一片凸透镜的显微镜，放大了300倍）都对显微镜的发展作出了卓越的贡献。,一、显微技术发展简史,1695 年惠更斯设计成功二片式目镜，这就是至今仍采用的惠更斯目镜。17001750 年制成了透射光显微镜，利用平面和凹面反光镜使光线自下往上进行照明。17501800 年发明消色差透镜，制造了具有粗调及微调的调焦机构，并出现了聚光镜，载物台上标本可借助螺杆进行移动。1886年蔡司打破一般可见光理论上的极限，他的发明阿比式及其它一系列的镜头为显微学者另辟一新的影像天地。19001950 年出现了波长=275
4、纳米的紫外光显微镜，利用它观察生物标本对紫外线的吸收性，并提高分辨率。,一、显微技术发展简史,一、显微技术发展简史,1938年，德国工程师Max Knoll和Ernst Ruska制造出了世界上第一台透射电子显微镜(TEM)。,Max Knoll(1897-1969)Ernst Ruska(1906-1988),一、显微技术发展简史,一、显微技术发展简史,1952年，英国工程师Charles Oatley制造出了第一台扫描电子显微镜(SEM)。,一、显微技术发展简史,1982年，诺贝尔化学奖授予卓越的电镜应用者英国的分子生物学家克卢格（A Klug）。1986年，瑞典皇家科学院将诺贝尔物理学奖
5、授予电子显微镜的发明者德国科学家恩斯特 卢斯卡（Ernst Ruska，1906-1988）；授予扫描隧道显微镜（STM）的设计者德国物理学家宾尼希（Gerd Binnig，1947-）和瑞士物理学家罗雷尔（Heinrich Rohrer，1933-）。,一、显微技术发展简史,时至今日，按照各种科学领域及研究对象的不同要求，利用不同的光学原理，已设计制造出多种多样的显微镜。,一、显微技术发展简史,一、显微技术发展简史,3.生物显微技术发展的方向,技术上将更快地向定量显微术方向发展；在仪器上不论是光学显微镜还是电子显微镜，都将从单一功能的仪器向多功能组合的大型仪器发展；在操作上将在更大程度上引入
6、电子学技术，从而向更高的自动化操作发展；图象分析技术将迅速地在显微技术中广泛的应用；设法解决在超微结构水平上作活体的观察。,一、显微技术发展简史,二、普通显微镜和特殊光学显微镜,1.普通显微镜,1）普通光学显微镜的结构,普通光学显微镜由3部分构成，即：照明系统，包括光源（普通钨丝灯或LED灯）和聚光器（孔径光阑和聚光镜）；光学放大系统，由物镜和目镜组成，是显微镜的主体，为了消除球差和色差，目镜和物镜都由复杂的透镜组构成；机械装置，用于固定材料和观察方便。,二、普通显微镜和特殊光学显微镜,1 目镜2 镜筒3 镜臂4 粗调焦螺旋5 细调焦螺旋6 镜座7 物镜转换器8 物镜镜头9 载物台10 聚光器
7、11 标本推进器12 光源,二、普通显微镜和特殊光学显微镜,被观察物体AB位于物镜的前方，被物镜作第一级放大后成一倒立的实象AB。然后此实像再被目镜作第二级放大，成一虚象AB,人眼看到的就是虚像AB,。,2）普通光学显微镜的成像原理,二、普通显微镜和特殊光学显微镜,对任何显微镜来说，最重要的性能参数是分辨率，而不是放大倍数。分辨率是指区分开两个质点间的最小距离。这两个质点之间的距离取决于光源波长A，物镜镜口角(标本在光轴的一点对物镜镜口的张角)和介质折射率N，它们之间的关系是：,式中：N=介质折射率；=镜口角（标本对物镜镜口的张角）。镜口角总是要小于180，所以sina/2的最大值必然小于1。
8、,镜口率Nsin/2,二、普通显微镜和特殊光学显微镜,3）普通光学显微镜的基本概念,分辨率：能够把两个点分辨开的最小距离。人们肉眼的分辨率一般只有0.2mm，光学显微镜的分辨率为0.2m，而电子显微镜可达0.2nm，扫描隧道显微镜的分辨率更高。放大倍数：显微镜经多次成像后最终所成像的大小相对原来物体大小的比值。显微镜的总放大倍率为：物镜放大倍率目镜放大倍率。有效放大：对于某一显微镜来说，在其分辨能力之内的图像放大。此时的图像放大不失图像表面的细节。无效放大：在显微镜分辨能力以外的图像放大。只是放大了图像轮廓，不能放大和分辨图像的表面细节。可见光照明的显微镜分辨率的极限值约为200 nm，一般人
9、正常眼的分辨率为0.2mm，使用光学显微镜可以使我们分辨清楚细胞的微细结构细节提高了1000倍，这正是光学显微镜的极限放大倍数，如果再追求更大倍数也只能是空放大（无效放大），并不能使细节更为清晰。,二、普通显微镜和特殊光学显微镜,景深：又称焦点深度，指在要求成一副清晰像的前提下，像平面不变，景物沿光轴前后移动的距离。焦长：景物不动，像平面沿光轴前后移动的距离。色差：又称色像差。可见光不是单色光，它是由波长范围400至700nm的一系列不同波长的光（即不同颜色的光）组成的复合光，不同波长的光在通过透镜时的折射率不同。这样物方一个点，在像方则可能形成一个模糊色斑。球差：是由于透镜表面为球面而产生的
10、像差故而称为球差，或 当透镜孔径较大时，由光轴上一物点发出的光束经球面折射后不再交于一点，这种现象叫做球面像差，简称球差。,二、普通显微镜和特殊光学显微镜,4）不同放大倍数下的组织,二、普通显微镜和特殊光学显微镜,二、普通显微镜和特殊光学显微镜,二、普通显微镜和特殊光学显微镜,二、普通显微镜和特殊光学显微镜,二、普通显微镜和特殊光学显微镜,二、普通显微镜和特殊光学显微镜,2.特殊光学显微镜,1）荧光显微镜,荧光显微镜是利用紫外光或蓝紫光照射被观察样品，使样品中的荧光物质产生荧光，显微镜成像系统借此来显示样品中产生荧光成分的分布、结构和数量。荧光显微镜用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分
11、布及定位等。荧光显微镜技术是目前在光镜水平对特异蛋白质等生物大分子定性定位的有力的工具。荧光显微镜技术包括免疫荧光技术和荧光素直接标记技术。常用绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)基因与某种蛋白基因融合，在表达这种融合蛋白的细胞中，便可直接观察到该蛋白的动态变化。,二、普通显微镜和特殊光学显微镜,特点：光源为紫外线，波长较短分辨力高于普通显微镜；有两个特殊的滤光片；光源前的用以滤除可见光，目镜和物镜之间的用于滤除紫外线，用以保护人目。照明方式通常为落射式。即光源通过物镜投射于样品上。,二、普通显微镜和特殊光学显微镜,二、普通显微镜和特殊光学显微镜,2）激光共聚
12、焦扫描显微镜,普通荧光显微镜下，许多来自焦平面以外的荧光使观察到的图像反差和分辨率降低，当所观察的荧光标本稍厚时，传统荧光显微镜一个难以克服的缺点就显现出来：焦平面以外的荧光结构模糊、发虚。激光共焦点扫描显微镜以激光作为光源，采共轭聚焦原理和装置，对样品进行断层扫描和成像，进行无损伤观察和分析细胞的三维空间结构。激光共聚焦扫描显微镜的分辨率可以比普通荧光显微镜的分辨率提高1.4-1.7倍。所谓共聚焦是指物镜和聚光镜同时聚焦到同一个小点，即它们互相共焦点。改变焦点可获得一系列细胞不同切面上的图像，经叠加后便可重构出样品的三维结构。激光共焦点扫描显微镜在研究亚细胞结构与组分等方面的应用越来越广泛。
13、,二、普通显微镜和特殊光学显微镜,二、普通显微镜和特殊光学显微镜,利用免疫荧光标记和离子荧光标记探针，该技术不仅可观察固定的细胞、组织切片，还可以对活细胞的结构、分子、离子及生命活动进行实时动态观察和检测，膜电位等生理信号及细胞形态的变化，成为形态学、分子细胞生物学、神经科学、药理学、遗传学等领域中新一代强有力的研究工具。,二、普通显微镜和特殊光学显微镜,3）暗视野显微镜,暗视野显微镜的聚光镜中央有挡光片，照明光线不直接进入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。可观察4200nm的微粒子，分辨率比普通显微镜高50倍。,二、普通显微镜和特殊光学显微镜
14、,二、普通显微镜和特殊光学显微镜,4）相差显微镜,光线通过不同密度的物质时，其滞留程度也不同。密度大则光的滞留时间长，密度小则滞留时间短。相差显微镜可将这种光程差或相位差，转换成振幅差。相差显微镜与普通光学显微镜最主要的不同点是在物镜后装有一块相差板，偏转的光线分别通过相差板的不同区域，由于相差板上部分区域有吸光物质，所以又使两组光线之间增添了新的光程差，从而对样品不同密度造成的相位差起夸大作用。最后这两组光线经过透镜又会聚成一束，发生互相叠加或抵消的干涉现象,从而表现出肉眼明显可见的明暗区别。由于反差是以样品中的密度差别为基础形成的，故相差显微镜的样品不需染色，可以观察活细胞，甚至研究细胞核
15、、线粒体等细胞器的动态。,二、普通显微镜和特殊光学显微镜,相差显微镜照明原理,二、普通显微镜和特殊光学显微镜,二、普通显微镜和特殊光学显微镜,5）偏光显微镜,偏光显微镜和普通显微镜不同的是：其光源前有偏振片（起偏器），使进入显微镜的光线为偏振光，镜筒中有检偏器（一个偏振方向与起偏器垂直的的起偏器），这种显微镜的载物台是可以旋转的，当载物台上放入单折射的物质时，无论如何旋转载物台，由于两个偏振片是垂直的，显微镜里看不到光线，而放入双折射性物质时，由于光线通过这类物质时发生偏转，因此旋转载物台便能检测到这种物体。用于检测具有双折射性的物质，如纤维丝、纺锤体、胶原、染色体等等。,二、普通显微镜和特殊
16、光学显微镜,二、普通显微镜和特殊光学显微镜,6）倒置显微镜,倒置显微镜组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。,三、光镜切片制作技术,切片法,徒手切片法石蜡切片法冰冻切片法组织化学制片,涂片法压片法离析法整体装片法,非切片法,三、光镜切片制作技术,1.非切片法制片,1）整体封藏法,一般是体积很小或自身为一薄片的低等动物如无脊椎动物的水螅、草履虫等。或脊椎动物的胚胎材料：如鸡胚、蛙胚等。也可取下某一动物体的某部分器官制成封片的，如昆虫的翅、鸟的羽毛、鱼的鳞片等。,鲨鱼的盾形鳞片,姜片吸虫,三、光镜切片制作技术,2）涂
17、片法,用于液态组织，如血液，精液和唾液。,三、光镜切片制作技术,3）铺片法,用于很薄的组织，如肠系膜。,三、光镜切片制作技术,4）压片法,一些柔软的材料可夹在玻片或盖片间进行压碎或压开，经染色后进行观察。,三、光镜切片制作技术,1.切片法制片,1）徒手切片法,准备：显微镜、镊子、解剖针、刀片、培养皿、载玻片、盖玻片、绸布或纱布、染料。切片：23 cm的材料一段，用左手大拇指或食指夹住材料，上方突出于手指23 mm，不宜太高，否则材料容易摇动。右手以拇指和食指拿稳刀片即可切片。切片时为了避免材料干枯，应使材料的切面和刀刃上保持有水，呈湿润状态。每切23片后，移入盛有清水的培养皿中。如果切面倾斜，
18、应立即纠正。过于柔软的器官，例如幼嫩的叶片，需用胡萝卜根或马铃薯块茎等作为支持物，将要切的材料夹于其中，然后进行切片。选择比较完整的切片进行染色和封片。,三、光镜切片制作技术,2）石蜡切片法,石蜡切片技术是显微技术上最重要最常用的一种方法，优点在于（1）应用范围广，几乎适用于所有的植物材料；（2）能切成极薄而且连续的切片，较清楚地显现细胞、组织的细微结构；（3）切片可以长期保存，便于以后观察比较。石蜡切片技术的整个过程较复杂，可大体概括为：取材固定脱水透明浸蜡包埋 修块切片粘片脱蜡复水 染色 脱水透明 封片,三、光镜切片制作技术,三、光镜切片制作技术,取材：根据观察目的不同，选用合适的新鲜材料
19、，要求“精而小”,不在于“大而多”，应注意：取材的代表性。材料新鲜，大小在0.51厘米，有利于固定液的透入。刀片锐利，立即固定，如不能即刻固定，须尽量防止变干、损伤。详细记录日期、采集地点、标本名称、取材部位、固定液种类。固定：用一定的化学溶液（固定剂）在尽可能保持细胞生活结构的情况下迅速杀死组织的过程。为保存新鲜组织的微观结构，尽快将组织浸入到酒精，甲醛，苦味酸，Bouins 液或Zenkers液等固定剂中。脱水：用浓度逐渐升高的酒精(70100%)将组织中的水完全置换出来。,三、光镜切片制作技术,透明：用二甲苯完全置换出酒精。二甲苯是应用较广的一种透明剂，透明力强，但缺点是材料在其中停留过
20、久，容易发生收缩、变脆、变硬，常用氯仿（三氯甲烷）代替二甲苯。透明主要目的在于使组织中的脱水剂（酒精或丙酮）被透明剂所替代，使石蜡能顺利地进入组织，或增强组织的折光系数有利于光线的透过，并能与封藏剂混合进行封藏，便于显微镜的观察。浸蜡：在6062时，用液态石蜡完全置换出二甲苯。室温时石蜡凝固成固态，内含待切组织。浸蜡应在恒温箱中进行,恒温箱的温度要适宜，太高，会使材料收缩，太低，石蜡会冻结而不能透入组织。,三、光镜切片制作技术,包埋：把透足石蜡的材料包埋在石蜡里成为一定的形状以便切片。,三、光镜切片制作技术,修块与固着：将包埋好的材料切割成小块，每个小块包含一个材料。然后按需要的切面将蜡块切成
21、梯形，切面在梯形的上部（注意上部矩形的对边平行）。用烧热的蜡铲将梯形的底部固定在木块上。,三、光镜切片制作技术,切片:用切片机将组织切成m厚的蜡片，然后将其放到温水上，待其完全展开后，裱到有粘附剂的载玻片上。,三、光镜切片制作技术,粘片、展片、烤片：在预先洗净并干燥的载玻片上涂上一小滴粘贴剂（用量绝不可多），用洗净的手指反复涂匀，然后加12滴3福尔马林或蒸馏水，用镊子轻轻将蜡片放在液面上，将此载玻片放在45左右的温台上，至蜡片受热慢慢伸直展平为止，用解剖针调整蜡片在载玻片上的位置，吸去多余水分，置入30温箱中烘干，时间约需24h。染色封片：苏木精：细胞核染成蓝色。伊红：酸性染料，主要使细胞质和
22、细胞外基质中的成分着红色，细胞浆的良好燃料。,三、光镜切片制作技术,染色封片：染色方法视材料不同而选择。下面以植物制片中最常用的番红与固绿对染的方法为例，说明从脱蜡、染色至最后封藏的全部制片程序（均在染缸中进行）。,三、光镜切片制作技术,为了保护细胞蛋白质的活性或脂肪成分的存在，在制作切片时，不能选择石蜡等作为包埋剂，此时可以利用冷冻使组织达到制作切片所需要的硬度。冰冻切片是一种在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度，然后进行切片的方法。优点：保存酶活性，抗原保存好，免疫组化应用较多。缺点：形态不如石蜡切片，要求有冰冻切片机。,3）冰冻切片法,三、光镜切片制作技术,新鲜组织和已固定的组织均可作冰
23、冻切片。防止组织中冰晶形成（速冻或液氮）。应视不同的组织选择不同的冷冻度。冷冻箱中冷冻度的高低，主要根据不同的组织而定，不能一概而论。如：切未经固定的脑组织，肝组织和淋巴结时，冷冻箱中的温度不能调太低，在-10-15左右，切甲状腺、脾、肾、肌肉等组织时，可调在-1520左右，切带脂肪的组织时，应调至-25左右，切含大量的脂肪时，应调至-30。,三、光镜切片制作技术,通过生物化学的方法在原位产生不溶解的有颜色的反应产物，来显示微细结构的位置，然后用显微镜观察，如PAS 反应。待测结构或化学物质被看作抗原(Antigen)，通过非常敏感和专一的免疫反应使抗原和被标记的抗体(Antibody)结合，
24、然后显示标记物，在原位产生不溶有色的反应产物，最后用显微镜观察。,4）组织化学法,三、光镜切片制作技术,放射自显影(Autoradiography):给细胞所要代谢的物质分子上标记放射性物质如 I125等，间隔照相，从而追踪该物质代谢途径。,免疫组化常用试剂,四、电子显微镜,电子显微镜是利用电子与物质作用后，所产生的电子散射信号来显示细胞内部和表面微细结构、晶体结构，微细组织，化学成份和电子分布情况的电子光学装置。它以电子波作为光源，电磁场作为透镜，用荧光屏将肉眼不可见的电子束成像在人们眼前。在真空系统中，高速电子照射样品时，一部分入射电子与样品物质中的原子核外电子发生碰撞，引起入射电子方向和
25、能量发生改变，形成所谓散射现象，样品中不同结构和区域电子的致密程度不同，引起的散射程度也不同，所以穿过样品的出射电子束是不均匀的，束内电子密度各处互有差异，当其投射到荧光屏上形成可见光图像时，该图像就会显示出样品的结构信息。,1.电子显微镜概述,四、电子显微镜,调控通过电磁场线圈的电流就可以调控磁场强度，从而改变电子偏转角度大小，即改变电子束聚焦的焦点，因此电镜改变放大倍数是通过调节通过磁透镜电流大小来实现的，不需要像光镜那样要更换不同倍数的镜头。根据电镜的电子束照射样品的方式不同、利用电子散射信号方式不同和对电子束加压的不同，可以将电子显微镜分为多种类型，细胞生物学常用的有透射电子显微镜(T
26、ransmission electron microscope,TEM)和扫描电子显微镜（Scanning electron microscope,TEM）。,四、电子显微镜,2.透射电子显微镜,原理：与光学显微镜相似，不同的是透射电子显微镜用电子束作为光源，用电磁场作透镜。电子束投射到样品时，可随组织构成成分的密度不同而发生相应的电子散射，如电子束投射到质量大的结构时，电子被散射的多，因此投射到荧光屏上的电子少而呈暗像，电子照片上则呈黑色，称电子密度高。反之，则称为电子密度低。,四、电子显微镜,中性粒细胞（透射电镜）,四、电子显微镜,四、电子显微镜,电子枪：是发射电子的照明光源。聚光镜：是把
27、电子枪发射出来的电子会聚而成的交叉点进一步会聚后照射到样品上。物镜：成一次像，决定透射电镜的分辨本领，要求它有尽可能高的分辨本领、足够高的放大倍数和尽可能小的像差。通常采用强激磁，短焦距的物镜。放大倍数较高，一般为100300倍。中间镜：成二次像，弱激磁的长焦距变倍透镜，020倍可调。投影镜：短焦距强磁透镜，最后一级放大像，最终显示到荧光屏上，称为三级放大成像。,四、电子显微镜,真空系统：由机械泵、油扩散泵或离子泵、联动控制阀门、真空排气管道、空气过滤器和用于真空度指示的真空测量规等组成。供电系统：透射电镜需要两部分电源：一是供给电子枪的高压部分，二是供给电磁透镜的低压稳流部分。机械系统：包括
28、电镜座、标本室、磁屏蔽外壳、镜筒、制冷系统和控制台等。,四、电子显微镜,使用注意事项：（1）透射电镜及其附属设备中有高压电、低温、高压气流、电离辐射等危险因素，因此不正确的使用有可能造成仪器损坏，甚至造成人身伤害。（2）请勿用透射电镜观察磁性样品，磁性样品有可能给电镜造成严重伤害。（3）严禁用手直接触摸样品杆把手以外的部分，尤其是样品杆顶端的任何部位。（4）电镜样品台红灯亮时不要插入或拔出样品杆，样品台回零之前不要插入或拔出样品杆。（5）任何机械操作都不要太用力（包括装卸样品，插拔样品杆，操作旋 钮、按钮等）。,四、电子显微镜,应用：主要用于观察组织和细胞内的亚显微结构、蛋白质、核酸等大分子的
29、形态结构及病毒的形态结构。是区别细胞凋亡与细胞坏死的最可靠的办法。,四、电子显微镜,线粒体,新型冠状病毒,四、电子显微镜,3.扫描电子显微镜,四、电子显微镜,扫描电镜成像并非来自光源电子束本身，类似激光扫描共聚焦荧光显微镜，成像来自荧光，而非光源的激发光。高能电子束与样品成分的原子核和电子发生碰撞，使样品表面产生二次电子发射、背反射电子、吸收电子、X射线、俄歇电子、阴极发光等物理信号，二次电子发射量是被选用作成像的信号，二次电子发射量随样品表面形貌而变化，包含着此时刻光源电子束照射样品表面此点形貌信息。,四、电子显微镜,在扫描电镜中，二次电子检测器一般是装在入射电子束轴线垂直的方向上。,四、电
30、子显微镜,四、电子显微镜,四、电子显微镜,电子光学系统：电子枪、电磁透镜信号检测系统：二次电子探测器、光电倍增管图像显示和数据处理系统：CRT扫描系统：偏转线圈、扫描波发生器真空系统：机械泵、油扩散泵、阀门等电源：高压电源、真空系统电源等放大倍数：扫描电镜二次电子像的放大倍率由屏上图像的大小与电子束在样品上扫描区域的大小的比例决定：M=像的大小/扫描区域的大小。,SEM的基本结构,四、电子显微镜,应用：主要用来观查组织、细胞表面或断裂面的超微结构及较大的颗粒性样品的表面形态结构。,红血球,可以用计算机将黑白照片处理成彩色,五、电子显微镜样品制作技术,1.透射电子显微镜样品制备,透射电子显微镜样
31、品制备主要是超薄切片和染色技术。由于电子易散射或被物体吸收，故穿透力低，必须制备更薄的超薄切片（通常为50100nm）。超薄切片与常规石蜡切片制作原理相似，即先使用固定剂将组织和细胞固定，使其尽量保持原来生活状态的结构，然后经过脱水、浸透、聚合、包埋和切片制成超薄切片，但两种切片所用固定剂和包埋剂等有所不同。,五、电子显微镜样品制作技术,通常以戊二醛和锇酸固定样品，以环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式推进样品切片，切片厚度50100nm。,莱卡超薄切片机,五、电子显微镜样品制作技术,五、电子显微镜样品制作技术,五、电子显微镜样品制作技术,五、电子显微镜样品制作技术,染色技术：一般采用重金属
32、盐染色，以增大反差。利用细胞微细结构和成分对重金属盐的结合和吸附特性不同，对透射电镜样品进行染色处理，即所谓的电子染色。,TEM显示胰腺腺泡细胞内部结构,五、电子显微镜样品制作技术,负染技术：负染就是用重金属盐（如磷钨酸、醋酸双氧铀）对铺展在载网上的样品进行染色；吸去染料，样品干燥后，样品凹陷处铺了一薄层重金属盐，而凸的出地方则没有染料沉积，从而出现负染效果。,肌动蛋白纤维的负染电镜照片,五、电子显微镜样品制作技术,2.扫描电子显微镜样品制备,制备扫描电镜样品的总要求：在不损伤样品原始结构状态的情况下，保证样品的体积和表面积不发生改变，充分暴露样品表面的微细结构。生物样品的特性：含水量高 质地
33、柔软 导电性差 二次电子产率低 对热、电子束等敏感,五、电子显微镜样品制作技术,扫描电镜生物样品要求：不含水份 具有较高的二次电子发射率 良好的导电性 耐热性 最大限度的保持样品的形貌,五、电子显微镜样品制作技术,扫描电镜样品常规制备的操作程序：,五、电子显微镜样品制作技术,冰冻蚀刻：亦称冰冻断裂，标本置于-100C的干冰或-196C的液氮中，进行冰冻。然后用冷刀骤然将标本断开，升温后，冰在真空条件下迅即升华，暴露出断面结构，称为蚀刻。蚀刻后，向断面以45度角喷涂一层蒸汽铂，再以90度角喷涂一层碳，加强反差和强度。然后用次氯酸钠溶液消化样品，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜。复膜显示出了标本蚀
34、刻面的形态，在电镜下得到的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构。,五、电子显微镜样品制作技术,五、电子显微镜样品制作技术,酵母细胞冰冻蚀刻电镜照片,五、电子显微镜样品制作技术,样品制备技术的协同发展：表现样品的二维超微结构、应用广泛的超薄切片术；显示表面超微结构、立体感较强的扫描电镜样品制备技术；呈现生物膜的断裂面超微结构的冷冻蚀刻技术；用于细胞内化学成分的定性和定位研究的电镜细胞化学技术；进行细胞内抗原（抗体）的定性和定位研究的免疫电镜技术；探测细胞内大分子合成、运输动态过程的电镜放射自显影技术；研究病毒和生物大分子等悬浮材料的负染术.,六、生物显微技术的应用,胰岛,小肠绒毛,1.形态观察（正
35、常与病理状态）,六、生物显微技术的应用,六、生物显微技术的应用,DC的超微结构,心肌闰盘,六、生物显微技术的应用,SEM显示肠绒毛,六、生物显微技术的应用,SEM显示巨噬细胞表面,精子进入卵子的瞬间,六、生物显微技术的应用,SEM显示血凝块,SEM显示镰刀形红细胞,六、生物显微技术的应用,2.电镜细胞化学技术,电镜细胞化学是从光镜组织化学的基础上发展起来的一种超微结构技术，是利用特定的化学显色反应，形成高电子密度、不溶性的反应产物沉淀在细胞原位，借助电子显微镜进行超微结构的原位分析。主要用于研究细胞内各种成份在细胞超微结构水平的分布情况，以及这些成份在细胞活动过程中的动态变化，以阐明细胞的化学
36、和生化功能以及各种细胞成份在生理、病理情况下与细胞结构和功能等之间的关系。,六、生物显微技术的应用,免疫电镜技术是免疫化学技术与电镜技术结合的产物，利用抗原抗体反应的高度特异性，在分子水平上检测某些具有抗原性的物质，并观察它在细胞内的定位的一种方法。目前免疫电镜技术主要包括酶免疫电镜技术，免疫铁蛋白技术和免疫胶体金技术，此外还有抗体杂交技术、凝集素电镜标记技术和铁蛋白-抗铁蛋白电镜复合物技术。,2.1 免疫电镜技术,六、生物显微技术的应用,（1）酶免疫电镜技术,酶免疫电镜技术是将酶作为抗原或抗体的标记物，利用酶的高效率的催化作用对其底物的反应形成不同的电子密度产物，借助于电子显微镜观察，证明酶
37、的存在，从而对抗原进行定位。,结果判定：在已知阳性、阴性样品成立的前提下，出现高电子密度的颗粒，即指示抗原抗体的存在。,先通过冰冻切片或震动切片获得厚切片，漂洗后的厚切片可按免疫组化步骤进行标记染色，显色后再进行锇酸后固定以及电镜包埋切片处理。,六、生物显微技术的应用,（2）胶体金免疫电镜技术,利用胶体金在碱性环境中带负电荷的性质，使其与抗体相互吸引从而将抗体标记。再以金标记的抗体与待检抗原相互结合，由于金颗粒的电子密度高，电镜观察到金颗粒的位置，即抗原所在。,优点：胶体金能稳定并迅速地吸附蛋白，而且蛋白的生物活性不发生明显的变化；金颗粒具有很高的电子密度，在电镜下金颗粒清晰可辨，易精确定位；
38、不仅可以用于透射电镜的超薄切片观察，也可以用于扫描电镜对细胞表面的抗原、受体进行标记定位观察；胶体金标记物易于制备，而且可以根据需要制备不同大小的胶体金，因此可以进行免疫电镜的双重标记；根据抗原抗体反应部分结合金颗粒数量的多少，可进行粗略的免疫细胞化学定量研究。,六、生物显微技术的应用,血小板表面胶体金标记GPIb单抗 9000,六、生物显微技术的应用,（3）免疫铁蛋白技术,铁蛋白分子量78万，含铁量高具有颗粒大，电子密度高，散射力强，分辨率高等特点，可用于细胞膜表面抗原的定位。铁蛋白免疫电镜技术是以铁蛋白标记抗体，再以铁蛋白抗体与待检抗原作用。通过电镜检查，观察到铁蛋白抗体所在的位置，即抗原
39、所在。结果判定：在已知对照样品成立的前提下，凡是出现黑色的铁分子颗粒即表示抗原的存在，判定阳性(+)，否则判为阴性()。,六、生物显微技术的应用,2.2 电镜酶细胞化学技术,原理：（1）水解酶,（2）氧化还原酶,六、生物显微技术的应用,常见酶的电镜细胞化学：,（1）酸性磷酸酶：是一种水解酶，常存在于溶酶体和高尔基体上，常被看作是溶酶体的标记酶。,酸性磷酸酶在溶酶体和高尔基体中阳性反应 15000,六、生物显微技术的应用,（2）碱性磷酸酶：水解酶，主要位于细胞膜，在小肠上皮微绒毛和肾小管上皮刷状缘部位特别明显，是细胞膜的标志酶之一。,碱性磷酸酶在肾小球足细胞表面和红细胞表面中表达 24000,六
40、、生物显微技术的应用,（3）葡萄糖6磷酸酶：水解酶，是内质网的主要标志酶。（4）焦磷酸硫胺素酶：水解酶，是高尔基体很重要的标志酶之一。（5）琥珀酸脱氢酶和细胞色素氧化酶：存在于线粒体中，定位于线粒体内膜和嵴。,六、生物显微技术的应用,琥珀酸脱氢酶在心肌细胞线粒体中阳性反应 30000,六、生物显微技术的应用,细胞色素氧化酶在心肌细胞线粒体中阳性反应 6000,六、生物显微技术的应用,（6）髓过氧化物酶：主要分布于白细胞，定位于粒细胞和单核细胞的内质网、核膜、高尔基体和细胞质颗粒中，是粒细胞和单核细胞的标志酶。,髓过氧化酶染色，白血病早幼粒细胞核膜、高尔基体、内质网及胞浆颗粒阳性反应 15000,
