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1、1,第3章 转座子与遗传重组,2,第一节 转座子第二节 遗传重组,本章内容,3,第一节 转座子,一、转座子的分类和结构特征二、转座子转座的机理和效应三、常见转座子简介,4,一、转座子的分类和结构特征,1944年Avery证实DNA负责物质的转化，确立了DNA是遗传物质的地位。,5,1952年，Hershey,A.D.和Chase.M 用噬菌体感染实验彻底证实了DNA是遗传物质。,6,一般认为基因在染色体上的位置是固定不变的，所以遗传学家才能利用遗传作图将基因定位在染色体的某个位置。,可是这种不变是相对的。,7,二十世纪40年代有科学家发现有些基因在染色体上的位置不是固定的，可以到处移动！可是这
2、个思想与人们当时对基因的认识相差太大，以至于一直过了30多年，人们才理解！,8,1951年麦克林托克（Barbara McClintock）提出跳跃基因学说。,1983年81岁的她因发现可移动遗传物质获诺贝尔生理学和医学奖。此时距离她刚发现时已经三十多年了。,9,芭芭拉麦克林托克1902年出生于美国康涅狄格州，1923年在康奈尔大学本科毕业，4年后获得植物学博士学位。从事植物遗传学研究。1944年成为美国国家科学院第3位女院士，1945年又被选为美国遗传学会第一位女会长。,10,1951年，在冷泉港的学术研讨会上，麦克林托克做了题为染色体结构与基因表达的报告，公开了她六年辛勤努力的研究成果跳跃
3、基因学说，她指出：玉米的染色体中含有跳跃基因，会在染色体上移动，并可在不同染色体间转位，并对其他基因产生影响。,11,在1956年冷泉港的学术研讨会上，麦克林托克再次阐述她的跳跃基因学说与相关的机制，而结果却是更多的奚落、批评与攻击。她发现自己的成果很难被其他人理解，于是她决定不再发表文章和做报告，只继续着自己的研究。,12,1967年Shapiro等才在大肠杆菌中发现了转座因子（transposable element）。随后越来越多的发现印证了她的理论，她的工作才渐渐受到重视和认同。1983年她获得了诺贝尔生理学和医学奖。,13,http:/www.cshl.edu/,Cold Sprin
4、g Harbor Laboratory,14,http:/www.cshl.edu/,Cold Spring Harbor Laboratory,15,冷泉港实验室（The Cold Spring Harbor Laboratory，缩写CSHL），是一个非盈利的私人科学研究与教育中心，位于美国纽约州长岛上，建于1890年。被称为世界生命科学的圣地与分子生物学的摇篮，名列世界上影响最大的十大研究学院榜首；不仅如此，冷泉港实验室依山傍水，风景优美，还是国际生命科学的会议中心与培训基地。,16,转座子是细胞内的可移动遗传因子（mobile genetic element）,指可以在基因组中从一个位
5、点移动到另一位点的DNA片断。,在原核生物和真核生物中均有发现，由于结构、移动机制、分布、移动自由度、自主水平等的不同可分为多种类型。,1 转座子的概念,17,复制型转座,非复制型转座,逆转录转座子,DNA转座子,以RNA为中间体,2 转座子的分类,18,非复制型转座，转座时，转座子DNA作为一个整体，从原来的供体位置被切割下来，然后转移到染色体的另外一个位置。,复制型转座，转座时，原来的转座子DNA不从原来的位置被切割下来，而是在转座的过程中原来的转座子DNA进行复制，并转移到染色体的另外的地方，原来的拷贝“原件”没有发生位移。,逆转录转座子：先将转座的片段转录成RNA，再将RNA反转录成c
6、DNA，插入到宿主染色体中。,19,非复制型转座cut-and-paste,复制型转座copy-and-paste,20,3 转座子的结构特征,第一类：最简单的转座子,不含有任何的宿主基因，所以常常被称为插入序列（insertional sequence,IS），这种插入序列在细菌中是染色体或质粒DNA的正常组成部分。,21,一般来说一个细胞内的IS序列常常不到10个,IS的结构一般是这样的：DNA的两个末端是反向重复序列（又称倒置重复序列），中间有一个基因，编码一个与转座有关的转座酶。除此之外，IS序列中没有其他基因。,22,第2类 复合转座子(composite transposon),是
7、比较复杂的转座子,带有一些抗药性基因或其他的宿主基因，转座子的两端多数是高度同源的或相同的IS序列（反向重复区）（少数是正向重复序列）。,23,或者说IS序列插到某个功能基因的两端就产生了复合转座子。复合转座子中的IS序列不能单独自由移动，只能和复合体一起移动。大多数情况下，这些复合转座子的移动转座能力由这些IS序列决定和调节。,24,若干复合转座子的结举例,25,TnA转座子的末端没有IS序列，而是一个38 bp的反向重复序列，体积一般较大，长度在5000 bp以上，转座子带有3个基因，其中一个编码-内酰胺酶(AmpR)，其他两个是转座作用所必须的转座酶和解离酶。,第3类 TnA家族,26,
8、所有的转座子具有的共同特点,1、两端具有末端反向重复序列2、转座后靶位点重复是正向重复3、编码一些与转座有关的蛋白4、可以在基因组中移动,27,二、转座子转座的机理和效应,主要搞懂几个问题：1、为什么转座子会转移？2、为什么插入位点两端都有同向重复序列？为什么不同转座子末端的同向重复序列长度不同？,28,转座时有一个普遍的特征就是受体分子中有一段很短（312 bp）、被称为靶序列的DNA会被复制一次，插入的转座子就位于两个重复的靶序列之间。,这种靶序列的同向重复序列是由于某种限制型内切酶的切割造成的。,29,转座子插入产生正向重复序列,30,转座子插入产生正向重复序列,正向重复,正向重复,31
9、,不同的转座子的靶序列长度不同，但同一转座子的靶序列是相同的，如IS1的两端有为9 bp的靶序列，IS2为5 bp。,32,在非复制型转座中只有转座酶参与。在复制型转座中，转座酶（transposase）作用于原来的“原件”，而解离酶(resolvase)作用于复制的转座子。,转座有两种方式：复制转座和非复制转座,33,复制转座的基本过程,目前有多种模型解释复制转座发生的过程，基本上都是在1979年由Shapiro提出的模型上修改而来的，也称为对称模型。,34,转座的效应,(1)转座引起插入突变 引起基因突变或造成基因调节区突变。,(2)转座产生染色体畸变，当复制转座发生在原有位点附近时，往往
10、导致转座子两个拷贝之间的同源重组，引起DNA的缺失或倒位。,35,如果同源重组发生在两个正向重复区之间，结果会导致重复区之间的DNA缺失；,36,如果重组发生在两个反向重复区之间，则会引起重复区之间的DNA倒位。,37,(3)转座子可引起生物进化 转座可以引起基因的新组合，产生一个操纵子或表达单元，也可以产生一些具有新的生物学功能的基因和新的蛋白质分子。,38,精确外切和不精确外切,这两个术语是用来描述转座子移动时，原来转座子位点处的DNA序列变化情况。如果转座子的所有序列都被转走，原来 位点处的DNA序列没有发生其他变化，称为精确外切。,如果转座子移动时，还遗留一些序列或带走一些转座子额外的
11、序列，则称为不精确外切。,39,一般来说，精确外切的情况比较少，大多是不精确外切，因此转座的结果大多会引起基因突变，只是突变的程度不同。,40,三、常见转座子简介,原核细胞中的转座因子(1)插入序列（IS）(2)类插入序列：(3)复合转座子(4)TnA家族,真核细胞中的转座因子玉米中的转座子系统,41,(1)插入序列（IS）是最简单的转座子，原核细胞中的IS有许多成员，两端都有反向重复序列，中间的编码区长度为1000 bp左右，只编码转座酶。,原核细胞中的转座因子,42,(2)类插入序列：这类转座子不单独存在，而是存在于复合转座子的两端。经过修饰，已经不能够单独移动了，只能和复合转座子的其他成
12、分一起移动。结构和IS类似，如IS10R、IS50R等。,43,(3)复合转座子比IS长的多，中心区域编码抗生素基因或其他宿主基因。两端的组件由IS和类IS组成，有的两端组件相同，有的不同，有的反向相反，有的方向相同，有的两个组件均有功能，有的只有一个有功能。,44,(4)TnA家族这类家族长度约为5000 bp，两端具有反向重复(IR)而不是IS。中部的基因不仅编码抗性基因，还编码转座酶和解离酶。这是一种复制型转座子。末端反向重复长度是38 bp，产生的靶位点是5 bp的正向重复。,45,目前在真核的多种生物体内都发现有转座子存在，有的还相当活跃。如果蝇、玉米、线虫、水稻、金鱼草等。人的基因
13、组内也有。,真核细胞中的转座因子,46,玉米中的转座子系统Ac/Ds系统 Spm系统等,玉米中的转座子两端同样具有末端反向重复序列，转座后在靶位点产生的正向重复序列。,47,玉米中的控制因子可以分为2类：自主性因子和非自主性因子。自主性因子就是具有自主剪切和转座的功能，非自主性因子是自主性因子的缺失突变体，已经不能再自发的剪切和移动了。但是当基因组中存在与非自主性因子属于同一家族的自主性因子时，在自主性因子中的转座酶的协助下，也可以发生转座。但是不同家族之间不能协助转座。,48,Ac是自主转座子，长度为4563 bp，含一个开放阅读框，编码长度为807个氨基酸的酶。转座子的两端有11 bp的反
14、向重复序列，转座后在靶位点产生的正向重复为8 bp,已知所有的Ds都是由Ac序列突变缺失而成的，不同的Ds中DNA的缺失情况不同，但是两端的末端重复序列是都存在的并且是完整的，所以只要存在转座酶，就可以重新使Ds恢复转座。,49,50,51,逆转录转座子,逆转座子与前面叙述的DNA转座子不同，逆转录转座子转座时先将自身的DNA序列转录成RNA，然后再反转录成DNA，插入宿主基因组中。,逆转录转座子在插入位点两侧也有正向重复序列，这点与DNA转座子类似，这也是所有转座子的共同特征。,52,酵母中的Ty元件是逆转录转座子,与细菌的转座子类似：具有末端重复序列，重组位点产生重复，但它编码反转录酶，可
15、产生RNA。,53,在人类基因组中发现一种长度较长的重复序列，因为分布不集中而称为长散布元件（long interspersed nuclear elements,简称LINES），现在发现，他们都属于逆转录转座子，占人类的基因组序列的的17%。,人基因组中也含有逆转录转座子序列,54,LINES,长散布元件，长度6100 bp，人的基因组中有3500个全长的拷贝以及数万个残缺不全的拷贝。,55,还有一类是逆转录转座子类型是短散布元件(SINES)重复序列以及Alu重复序列。,短散布元件不含有反转录酶等基因，本身无法主动转座，要其他同类的转座子协助。,人的Alu重复序列在基因组中有30万拷贝，
16、与7SL RNA有关，认为最初的Alu是由7SL RNA偶尔经过反转录而插入基因组中形成的。,56,逆转录病毒,逆转录病毒的遗传物质是RNA。,在感染细胞时，逆转录病毒首先将RNA逆转录为DNA，然后将DNA插入细胞基因组中。,57,大多数逆转录病毒造成的疾病都是比较慢性的，有些病毒虽然不直接导致疾病，但可以导致癌症，有些病毒可以将其基因插入细胞基因组内而不导致疾病。在人类进化的过程中有许多逆转录病毒将它们的基因插入人的基组中并成为人基因组中的一部分。,58,逆转录病毒可以分为三类,（1）致瘤病毒 可以导致癌症如白血病等，它们含有致癌基因，已发现至少35种致癌病毒能在禽类和老鼠身上造成恶性疾病
17、,（2）慢病毒 可以导致慢性病如艾滋病等（3）泡沫病毒 不导致疾病,59,由于逆转录过程比较不稳定（与RNA转录酶的特点有关），因此逆转录病毒的变异过程比较快。这使研究针对逆转录病毒的免疫抗体的过程非常困难。,大多数针对逆转录病毒的治疗方法主要是针对病毒的逆转录过程。但由于病毒迅速的变异过程病毒往往会很快就产生对药物的阻抗。,60,逆转录病毒的生活周期包括一个与转座类似的过程，即将自己的基因组RNA反转录成DNA插入宿主基因组中，同时和一般的DNA转座子一样，会在插入位点产生一个正向的重复序列。,61,逆转录病毒的DNA序列插入宿主基因组的后果,（1）逆转录病毒自己变成内源性病毒(前病毒)而保
18、留在宿主的基因组中；,（2）插入位点的序列偶尔会与逆转录病毒的基因组序列结合并一起转座到基因组中的新位点；,（3）携带宿主基因片段的反转录病毒再次感染其他细胞时会将此基因一并带入并可能会给细胞带来新的特性。,62,第二节 遗传重组,一、遗传重组的类型和意义二、同源重组三、位点特异性重组四、遗传重组的应用,63,一、遗传重组的类型和意义,“种瓜得瓜，种豆得豆”遗传“一母生九子，个个都不同”变异,基因组具有稳定性又有变异性，基因组在保持其稳定的同时还维持了其变异的特征，在两者之间维持了很好的平衡。,64,DNA变异有两条途径，突变和遗传重组，它们都会引起遗传物质的改变进而引起蛋白质的改变，最终通过
19、自然选择得以保存并遗传下去。,DNA分子内或分子间发生的遗传信息的重新组合，叫做遗传重组，或叫基因重排。,狭义重组是指DNA分子内的断裂并重新连接而造成的基因重新组合的过程。,65,突变只能使基因组在小范围内变动，不会产生大的变化，只有通过重组才能使基因组的变化加大，增加进化的潜能。重组使有害和有利的突变不断发生组合，从而除去有害的基因突变，保留有利的突变，使生物体对变化的境有对应能力。,66,重组首先在细胞的水平上被观察到。,它涉及到真核细胞减数分裂中同源染色体之间的交换。,随后又在分子水平上观察到细菌的结合、转导和转化均与重组有关。,67,遗传重组不仅仅发生在代与代之间，个体基因组也可以发
20、生重排，使基因的表达发生改变，在同一个个体的细胞之间产生遗传基因的多样性，如抗体的产生等。,重组不仅仅发生在减数分裂和体细胞的核基因中，也发生在线粒体基因组、叶绿体基因组、噬菌体整合过程中以及转座子的转座中等。,68,所有的有机体都有一些基因重组的机制，说明重组对于物种生存的重要性。,重组是遗传物质变异的来源之一，可以使不利基因合有利基因分离，提供一种使有利基因得以保存，有害基因得以清除的方式，同时在DNA的修复中也起重要作用。,所以重组在生物学中处于中心位置。,69,重组可以直接改变基因组的遗传组成，所以大家十分关注它的分子机制。根据重组机制的不同可以分为四种类型：,同源重组 位点特异性重组
21、转座重组 异常重组,重组方式的划分也是人为的，每一种重组发生时，都会或多或少的同时涉及到几种机制。,70,研究基因重组在理论和实践都有重要意义,理论上：研究细胞活动机制，揭示大自然奥秘。,实践中：通过研究重组机制，发明基因定点突变技术，获得转基因动物，以及进行基因治疗等。,71,2007年度诺贝尔生理或医学奖由美国犹他大学医学院的马里奥-R-卡佩奇（Mario R.Capecchiand）、英国卡迪夫大学医学院的马丁-J-伊文思（Martin J.Evans）和北卡罗莱纳大学医学院的奥利弗-史密西斯（Oliver Smithies）三人赢得该奖项。,72,2007年度诺贝尔生理或医学奖得主,7
22、3,获奖理由：他们用胚胎干细胞在小鼠特定的基因修饰技术中的重大发现（for their discoveries of principles for introducing specific gene modifications in mice by the use of embryonic stem cells）基因修饰技术主要是“基因打靶”(gene targeting)技术。,74,二、同源重组(homologue recombination),又叫普遍重组或一般性重组(general recombination),这是一种细胞内最常见的重组类型，发生在DNA的同源序列之间，真核生物减数分
23、裂时的染色单体之间的交换、某些低等真核生物和细菌的转化、转导、结合，噬菌体的重组，以及DNA的复制修复等均与这种重组有关。,75,染色体的联会发生在减数分裂时,76,减数分裂中的同源染色体配对和交换发生在第一次减数分裂前期,77,在减数分裂时，同源染色体的配对和交换发生有相同或几乎相同的顺序的两个DNA节段之间。通常这两个节段是同源染色体的两个相应区域；但是交叉也可发生在非相应区域的同源片段之间。,78,a 在交换区域有相同或相似的序列。,同源重组的特点,b 双链DNA分子之间互补碱基进行配对。减数分裂中，两个双链的DNA分子通过链互补的碱基对被维系在一起，叫联会,79,c 在同源重组中有多种
24、酶参加，保证双螺旋的断裂、修复、连接、重组体的释放等。,d 形成异源双链区 在重组部位，配对的双链是来源于不同的DNA分子形成的，这个部分称为异源双链（hetero duplex），或称杂种DNA。,80,任意两个同源性DNA片段在细胞内均可能发生重组。,重组时，两个同源双链DNA分子必须紧密接触，相对应的DNA方能交换，这称为联会(synapsis)。重组时，两个DNA片段必须有一个发生断裂或有一段单链缺失（称“空隙”gap）。许多引起DNA损伤的因素，如UV照射、X辐射和诱变剂等均可使DNA发生断裂，引发重组。,81,同源重组的分子机制,（1）Holliday 模型 1964 年由Robi
25、n Holliday 提出。（2）双链断裂模型 1983 年 Jack Szostak 和 Franklin Stahl 提出,82,Holliday 模型,Holliday模型用来解释有相同或相近序列的两条同源双链分子之间的重组，也可以适用于具有有限同源区的两条不同的分子，或含有两个相互同源区域而可以自我重组的单个分子。,83,同源重组的过程,将要发生重组的两个DNA分子必须首先对齐。,在对应的同一部位的两个单链产生断裂,84,断裂产生的单链游离末端彼此交换，每一条链同另外的DNA分子的互补序列配对形成一个异源双链（heteroduplex）。,85,然后末端彼此连接产生一个十字结构，叫做H
26、olliday连接体（junction）,4条染色单体通过一个点连接在一起,86,Holliday连接体是一个动态的结构，可以因为两条链的旋转而发生改变。Holliday 连接体及异构体的构象之间的转变是不需要能量的。,87,在一些酶和其他蛋白的作用下，Holliday连接体还可以沿着DNA链通过氢键的断裂形成而发生左右移动，这叫分支迁移(branch migration).,88,89,分支迁移的结果增加了异源双链的长度。一般长度为几个kb。,迁移的起点可以是任意位置，方向可以是双向的，但是一般只有沿着一个方向才能进行有效的重组。,90,通过分支迁移，某条单链上相当长的一段可从一条双螺旋上转
27、移到另一条上去，形成大段的杂种双链DNA。分支迁移的速度一般为30 bp/秒。,因此从原来的DNA断裂处开始，DNA链可以在两条双螺旋之间进行交换相当长的距离。从原始配对区由于分支迁移向邻近区域延伸，将两个染色体中有遗传差异的位点也包括进去，这样的重组才有意义。,91,但最终这两条DNA链彼此要分开，这个过程称为“拆分”，就是连接2个DNA分子的Holliday连接体分开，使它们重新成为两条独立的双螺旋。,Holliday连接体在蛋白和酶的作用下，进行重排而改变链的彼此关系（这一步叫做Holliday连接体的分离或离析）。有两种结果完全不同的重排方式。,92,一种结果是以上下方向切开Holli
28、day连接体(垂直分离)，这种切割发生在整个过程一直保持完整的一对同源链上，至此所有的4条链全部发生过断裂,93,经过重新组合，释放出来的2条重组分子，每一条是由一条DNA分子与另外一条DNA分子的组合，其中含有一段异源双链区。这种重组叫做交互重组，结果有大片段的DNA交换发生。,94,另外一种切割方式是水平切割，发生在重组过程中已经被切开一次的一对同源链上，原来保持完整的2条同源链仍然保持完整。,95,最后释放出来的2条DNA链中，有一条链没有发生变化，另一条链发生了一段异源双链区的交换。,结果所发生的只是小片段DNA链在两个分子之间的交换。这个不能称为重组。,96,97,Holliday模
29、型特点,Holliday模型又叫做双链入侵模型，因为该模型中，每一个DNA分子有一条链入侵到另外一个DNA分子中。,但是本模型要求重组时两个DNA分子要并排对齐，而且必须在同一个部位几乎同时产生断裂，以分别产生一个单链。这个要求对于细胞来说太高，无法解释为什么会同时同地出现断裂。,98,目前认为这个模型在解释异源双链的最初起源方面是不正确的，但是其中提出的“Holliday连接体”和“支链迁移”两个概念则被保留下来继续使用。,99,双链断裂模型,1983年利用高灵敏技术在酵母中所做的实验发现，酵母中的同源重组的发动是由一条DNA分子双链断裂而引起的。,后来在细菌和噬菌体和低等真核生物中也发现这
30、种双链断裂开始的同源重组。更多的试验表明，同源重组的启动是由于双链断裂，而不是单链断裂。,100,Szostak,J.W.,Orr-Weaver,T.L.,Rothstein,R.J.,and Stahl,F.W.(1983).The double-strand-break repair model for recombination.Cell 33,25-35.,101,双链断裂模型认为，重组发生于一个DNA分子的两条链均被切断，细胞中的一种II型DNA拓扑异构酶将被切断的DNA分子连接起来确保不会彼此完全脱离。,每一端中有一条链被核酸外切酶修剪，结果末端形成有大约500bp左右的3端突出结
31、构。,102,其中的一个以单链入侵的方式侵入同源的DNA分子，寻找同源的序列。,断裂的链被DNA聚合酶延长，结果也会形成Holliday 连接体，沿着异源双链区域移动。,103,这里，被剪切的DNA延伸时是以未被切除的DNA一方的对应区域为模板的。同样，这里的Holliday连接体也会以某种方式被解开，从而产生重组。,104,双链断裂模型,105,SpoII 是一种拓扑异构酶，双链断裂后，它将双链连接起来，防止分开。,106,双链断裂模型目前得到实验数据的支持，在酵母体内已经发现了类似与大肠杆菌重组时的各种蛋白的同源蛋白。目前认为，生物体内的一般性重组都是由双链断裂发动的，减数分裂也是由双链断
32、启动的。,但是也有的遗传学家认为在高等的动物体内，DNA双螺旋反复经常性的断裂不大可能的，因此该模型也不能解释所有的现象，有待进一步完善。,107,进行同源重组至少要有多长的同源序列呢？,实验证明如果同源顺序短于75bp，则重组频率大降低。这个长度要比两条互补的单链形成双链所需的长度（约10bp）要长得多。,108,同源重组中所需要的酶的种类和功能,目前发现大肠杆菌中有几个不同的重组系统，分别称为RecBCD，RecE和RecF途径。,其中最重要的是RecBCD途径，当这个系统不能工作时由RecE系统代替，而当RecE途径不能发挥作用时就由RecF途径取代，确保细胞内的重组能够进行。,109,
33、参与同源重组的酶有很多，如RecA、RecB、RecC、RecD、RecF、RecO、RecR、RuvA、RuvB、RuvC等等。,其中最重要的是RecA，参与各种途径的重组系统。,首先在大肠杆菌中发现这些酶，随后在其他 的不同生物中均发现了这些酶的同源基因。,110,RecA主要功能是促进DNA单链与同源双链分子发生链的交换，使DNA配对、Holliday中间体的形成，分支移动等得以产生。,当RecA与DNA单链结合时，数千RecA单体协同聚集在单链上，形成螺旋状纤丝。,111,RecA蛋白分子质量为38 000，它与单链DNA结合形成螺旋纤丝。此复合物可与双链DNA作用，部分解旋以便阅读碱
34、基序列，迅速寻找与单链互补的序列。,互补序列一旦被找到，单链与双链中的互补链配对，同源链被置换出来。交换沿单链5-3方向进行，直至交换终止，在此过程中由RecA水解ATP提供能量。,112,RecA蛋白的功能,113,单链DNA上覆盖RecA蛋白形成的粗丝,114,任何部位的单链DNA均可借助RecA与同源双链DNA进行链的交换。,115,RuvA RuvB RuvC的功能,由于DNA分子具有螺旋结构，在持续进行链的交换时需要两DNA分子发生旋转。RecA能够介导单链绕入另一DNA分子，一旦Holliday中间体形成，即由RuvA和RuvB蛋白促进异源双链的形成。,116,RuvA蛋白能够识别
35、Holliday联结体的交叉点，RuvA四聚体结合其上形成四方平面的构象，使得分支点易于移动，RuvA还帮助RuvB6(或8)聚体结合在双链DNA上，位于交叉点上游。,RuvB是种解螺旋酶，通过水解ATP而推动分支移动。RuvAB复合物的移动速度约为10-20bps。,117,RuvA与交叉点结合,RuvB与双链DNA结合,RuvC分开连接体,118,RuvA四聚体与交叉点结合,119,RuvA,RuvB 与 DNA 结合形成的复合物,120,同源重组最后由RuvC将Holliday联结体切开，并由DNA聚合酶和DNA连接酶进行修复合成。RuvC是一种核酸内切酶，特异识别Holliday联结体
36、并将其切开。,RuvC识别四核苷酸ATTG，此序列因而成为切开Holliday联结体的热点，并决定结果是片段重组还是拼接重组。,121,RuvC与交叉点结合,122,RuvA RuvB RuvC的功能,123,在人鼠酵母等真核生物内发现有多个RecA蛋白，其中rad 51是最重要的一个。该基因突变造成双链断裂积累，并且无法形成正常的联会复合物，但此蛋白质不能在体外与单链DNA形成纤丝，表明原核生物与真核生物的同源重组机制可能有所不同。,124,三、位点特异性重组,位点特异性重组不依赖于DNA顺序的同源性（虽然也可以有很短的同源序列），而依赖于能与某些酶相结合的DNA序列的存在。这些特异的酶能催
37、化DNA链的断裂和重新连接，它们能发动位点特异性重组。,125,位点特异性重组广泛存在于各类细胞中，起着十分特殊的不同的作用。它们的作用包括某些基因表达的调节，发育过程中程序性DNA重排，以及有些病毒和质粒DNA复制循环过程中发生的整合与切除等。,126,常见的位点特异性重组的例子,1、噬菌体的整合 2、沙门氏菌的相转变3、抗体的产生（DVJ重组）,127,1、噬菌体的整合（integration）,噬菌体侵染大肠杆菌后有2条途径,128,溶源途径中，噬菌体DNA整合进入大肠杆菌 染色体的过程就是一个位点特异性重组的过程。,129,整合的位点叫做att，在噬菌体和大肠杆菌中均有。他们有一个15
38、bp的序列相同，当噬菌体基因组进入到细菌基因组后，att位点就有2个，分别位于噬菌体基因组的两端，所以还可以再次发生位点特异性重组，只是结果相反，将噬菌体的DNA从细菌的基因组中剪切下来，从而噬菌体进入裂解循环。,130,整合的位点称为att，当噬菌体基因组进入细菌基因组后，att位点就有2个。,131,这个过程需要一个整合酶(integrase)参加，整合酶可将DNA在整合位点切开，也形成一个单链末端，形成Holliday 连接体结构，最后进行拆分，将噬菌体的DNA与细菌的基因组连接在一起，完成整合。,132,这种交换是可逆的，原先存在的DNA顺序全部被保存下来，并无丢失；,噬菌体和细菌的D
39、NA之间有一段很短的同源序列，重组交换必须通过其中的一个特定的核苷酸进行。,的整合作用有两个特点,这两个特点也是位点特异性重组的共同特点。,133,如果前病毒受到诱导，则整合作用将被逆转，此过程称为切出（excision）。切出后，细菌和噬菌体DNA恢复至原来完整状态。,前病毒受到诱导时产生一种蛋白质，称切出酶（excisionase）。切出酶和整合酶一起催化前病毒DNA两端的杂种att位点之间的重组，促使反应向反方向进行。,134,135,136,如果两个正向重复序列之间发生位点特异性重组，就导致中间的DNA缺失。,2、鼠沙门氏伤寒杆菌的相转变,137,如果两个反向重复序列之间发生位点特异性
40、重组，就导致中间的DNA序列的倒位。,138,有些生物正是利用这种重组倒置来控制基因的表达。因为DNA的一正一倒两种排列法可以相应地表达两种不同的蛋白质，细胞就可根据需要作出选择。,139,鼠沙门氏伤寒杆菌（Salmon ellatyphimurium）,140,有2种鞭毛蛋白,hin基因长度970bp，编码重组酶，基因的两端有14bp长度的反向重复序列。,141,其他的例子,（1）噬菌体Mu的尾蛋白即由其可倒置的DNA节段gin所控制，从而决定了侵染不同大肠杆菌的能力。,（2）锥虫（trypanosomes）的表面抗原更是千变万化，用以逃脱宿主免疫系统的攻击，这也是通过一系列DNA重排达到的
41、，其复杂程度有点类似于抗体基因的结构。,142,143,3、抗体的产生（DVJ重组）,脊椎动物和人的淋巴细胞在其成熟过程中抗体基因的重排，是有关基因重排研究中一个最重要的实例。按照克隆选择学说，每一个浆细胞只能产生一种或几种抗体，无数由淋巴细胞分化而来的浆细胞就能产生无数种类的抗体分子。,144,抗体的结构重链(H)轻链(L)可变区(V)恒定区(C),抗体分子分别由三个独立的基因族编码，其中两个(和)编码轻链，一个编码重链。,145,小鼠的和和重链分别位于第6、16和12号染色体上。决定轻链的基因族上分别有L、V、J、C四类基因片段。L代表前导片段(leader segment)，V代表可变片
42、段(variable segment)，J代表连接片段(joining segment)，C代表恒定片段(constant segment)。,决定重链的基因族上共有L、V、D、J、C五类基因片段，其中D代表多样性片段(diversity segment)。在J和C片段之间存在增强子(enhancer)。,146,抗体基因可通过倍增和歧化来增加其数量，在种系中基因数目有较大变动，因此难于确定。,147,小鼠链基因V片段数异常少，可能是其在过去曾遭剧变而丢失大部分的V片段。轻链的恒定区只1个，但链每个J片段都与其本身C片段相连。,148,重链基因除V片段、J片段外，还有1030个D片段，并有多个
43、恒定区(C片段)以决定抗体的效应功能，即抗体的类型和亚类型。小鼠IgH的基因恒定区存在8个C片段。人的IgH的基因恒定区C片段依次为：C、C、C3、C1、C1、C2、C4、C、C2(其中和是两个无活性的假基因)，它们分别相当于免疫球蛋白IgM、IgD、IgC3、IgG1、IgAl、IgG2、IgG 4、IgE和IgA2。,149,除淋巴细胞外，所有细胞免疫球蛋白基因族的结构都是相同的，称为种系结构，只有骨髓干细胞在分化为成熟B淋巴细胞的过程中才出现免疫球蛋白基因的体细胞重排(somatic rearrangement)。利根川进(Tonegawa S)揭示了抗体基因重排机制，获得1987年诺贝
44、尔生理学和医学奖。,150,在B细胞分化过程中，首先出现免疫球蛋白基因位移，然后才进行重排。,重排具有严格的顺序，第一次重排发生在前B细胞中，最先由编码免疫球蛋白重链的基因族片段参与重排，使在种系中相互分离的片段经重排后连接在一起，称为V-D-J连接。,其间，D片段与J片段先连接，接着V片段加到D-J上，形成V-D-J复合体。,151,免疫球蛋白重链基因的重排(V-D-J连接),152,重排中选择的片段是随机的，片段之间序列在重排中被删除。,重链重排后接着是轻链链基因重排，形成V-J复合体。只有链基因重排失败，才发动链基因重排，故抗体中大部分轻链是链，链只占少部分。淋巴细胞在繁殖过程中还发生体
45、细胞突变，以增加抗体的多样性。,153,免疫球蛋白轻链基因的重排(V-J),154,由于淋巴细胞是二倍体，因而H链、链和链都有两个等位基因族，然而重排表现出等位基因排斥(allelic exclusion)，即两个等位基因中只发生一个等位基因重排。二者之中何者重排是随机的，但只要一个等位基因发生重排，另一等位基因即受到抑制，不再发生重排。,155,轻链基因重排还表现出同型性排斥(isotypic exclusion)，即链和链基因只有一种轻链基因发生重排。,重链(IgH)基因的V-D-J重排和轻链基因的V-J重排均发生在特异位点上。,156,4、等位基因之间的重组,基因转换-等位基因在减数分裂
46、之后出现的基因序列交换的现象，称为基因转换，是由同源重组引起的。,以子囊菌类的真菌为例说明基因转换的含义和发生的机理。,157,四、遗传重组的应用,1转基因或基因敲除,基因重组技术已在动物、植物和微生物等领域得到广泛的应用，通过该技术可将外源基因精确整合到宿主细胞染色体某一特定位点上，也可对某一位点的基因进行准确的修饰、加工和剔除，在不影响原基因结构元件的情况下，可使外源基因得以正常表达，从而使生物具有某种新的性状，并能遗传给后代。,158,1974年Jaenisch和Minti首先将SV40病毒DNA注入到小鼠胚胎的囊胚腔，得到一个带有外源基因的小鼠。1980年，Gordon等采用受精卵原核
47、显微注射法，首次成功地将疱疹病毒TK基因和SV40和DNA片段导人小鼠的基因组，产生可转化的小鼠，Gordon等称其为“转基因小鼠”(transgenic mice)。,159,将小鼠基因组中特定内源基因定点突变，便可得到“基因剔除小鼠(gene knock out mice)；将小鼠基因组中特定内源基因进行定向重组，便可得到“基因替换小鼠”(gene knock in mice)。转基因小鼠、基因剔除小鼠和基因替换小鼠统称为“基因工程小鼠”(genetically engineered mice)。,160,基因工程小鼠为人们研究肿瘤的发生、发展及治疗提供了一个重要工具。在癌基因、抑癌基因的
48、研究中取得了丰硕的成果，并为潜在致癌源的测试、抗癌治疗及抗癌药的筛选开拓了新途径。,161,转基因动物的应用还有：生产药用蛋白 建立人类疾病的转基因动物模型，如肝癌模型、老年痴呆症模型、高血压模型。生产可用于人体器官移植的动物器官 提高家畜产量,162,在转基因植物中，现已有的转基因植物有转基因棉花、大豆、马铃薯、烟草、玉米、花生、菠菜、田椒、小麦等。,163,2.转基因技术应用于疾病治疗,应用基因工程技术将外源性基因或特定核酸序列片段导入靶细胞，促使转入基因适度表达，并通过纠正机体基因缺陷、调节基因表达功能达到基因治疗和预防疾病的目的，也称为基因治疗。,164,近年来随着对某些疾病基因水平的
49、研究进展，转基因技术应用范围日益扩大，主要应用于恶性肿瘤、遗传性疾病、烈性传染病等发病机制、治疗与预防研究。,165,3基因打靶(gene targeting),基因打靶是利用活细胞染色体DNA可与外源DNA的同源DNA序列发生重组的性质，进行定点修饰，改造染色体上某一目的基因的技术。,“打靶”就是对靶基因进行直接作用，主要指通过同源重组诱发突变或改建,166,基因同源重组与DNA重组概念不同，DNA重组是通过人工酶解和连接组建新的DNA片段的过程。基因同源重组是基因转染方法，把人工组建的与靶基因同源的片段整合到受体细胞的基因组中使之与靶基因发生同源重组而整合在一起。,基因打靶技术是新兴的分子生物学技术，具有定位性强、打靶后的基因随染色体DNA稳定遗传的特点，是一种理想的修饰和改造生物遗传物质的方法。,167,基因打靶技术的应用：改造生物，培育新的生物品种。用于基因治疗。在基础学科中的应用。如对胚胎干细胞进行打靶修饰，观察基因在发育中的作用,
