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1、,Chaper4DNA测序及基因组测序策略,结构基因组学的核心内容之一是基因组测序。随着人类基因组图谱的完成,人类基因的定位克隆、鉴定分析直至全基因组测序均取得了突破性进展,测序策略的成熟、测序方法的改进、自动测序仪的广泛应用、计算机数据分析系统的扩展以及测序分析能力的提高,大大推进了大规模DNA测序的进程。,DNA测序的基本方法链终止法测序化学降解法测序自动化测序1非常规DNA测序,1、链终止法测序(the chain termination method1)基本原理1977年 Sanger提出了“终止法”。其反应体系包含单链模板、引物、4种dNTP和DNA聚合酶,分四组进行,每组按一定比例
2、加入一种2,3双脱氧核苷三磷酸,它能随机掺入合成的DNA链,一旦掺入合成即终止,于是各种不大小片段的末端核苷酸必定为该核苷酸,经变性胶电泳,可从自显影图谱上直接读出DNA序列,dNTP OHPP-P-ICHOHDMA聚合酶P一口口ooH口口口口口口口合日日PP口口口口口0参入0口口口口口口q日日合P路止PP-PP口口了口口姍0班 Klenow*段0H-口口口口口口q口合PdeNT参入P口口口口而0口口口口口口口日日PP一口画KLenow序段0H口口口口口口口口口口P,2)技术路线与要求制备单链模板克隆于质粒中DNA用碱或热变性BM13克隆单链D将单链模板与一小段引物退火噬粒克隆DNADPCR产
3、生单链DNAA高酶活性加入DNA多聚酶B无53外切酶活性4种脱氧核苷酸C无35外切酶活性ddATP/ddcTP/ddGTP/分别加入少量4种双脱氧核苷酸dP的3碳原子连接的是氢原子,不是羟基将4种反应产物分别在4条泳道电泳根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列,引物链模板链将反应分为4组,每组均加入有放射性标记的4种dNTPdCTP.dGTP.dTP,dmP每组分别加入各自的A组G组组dNTP如組加入dTPdP+ddTTPaAmT趾H:F如果遇到 ddNTPDNA合成c终止于是在各组中产生长短不同的以该坦dNTP结束的DNA片段长片段在上反应结東,迸行凝胶电泳A然后用胶片对其曝光短片段在
4、下5显影然后自胶片上自下而上于的排好字母顺序,这个序列就是DNA53的碱基顺序,化学降解法测序(Maxan和 Gibert于1977年发明1)基本原理:在选定的核苷酸碱基中引入化学基团,再用化合物处理,使DNA分子在被修饰的位置降解,)技术路线将双链DNA样品变为单链每个单链的同一方向末端都用放射性同位素标记,以便显示DNA条带分别用不同方法处理,获得只差一个核苷酸的降解DNA群体电泳读取DNA的核苷酸顺序,3)Maxam-Gilbert法所用的化学技术先用限制性内切酶把DNA切成10200bp的测序材料;用碱性磷酸化酶处理该片段,消除5末端上的磷酸;在5oH端标记32P,用多核苷酸磷酸激酶催化;标记片段变性为单链;用特异的化学试剂作用于不同的碱基进行修饰,然后用哌啶切断反应碱基的多核苷酸链,紧接着用四组不同的特异反应可以使末端标记的DN切成不同长度的片段生一组其末端都是该特异碱基的长度不等的DNA片段经电泳和放射性自显影后,从4个反应系统统一阅读,待测DNA的全部核苷酸序列就可直接读出,
