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1、1/21/2023,微生物控制常识,1/21/2023,国外消毒行业状况,美国的消毒产品主要是含氯化合物、过氧化物、季铵盐化合物欧洲的消毒产品主要是酚类化合物、醛类化合物、季铵盐化合物，限制使用过氧化物，禁止使用含氯化合物日本只使用含氯化合物、过氧化物，氧化电位水，允许使用季铵盐,1/21/2023,国内外消毒产品的差异,消毒技术标准不一样区分消毒产品的方法不一样使用过程的控制不一样,1/21/2023,国家对消毒药品或器械的管理,根据中华人民共和国传染病防治法、中华人民共和国传染病防治法实施办法和消毒管理办法的有关规定，在中华人民共和国境内生产、经营、使用和检验消毒产品的组织，医疗卫生机构以
2、及传染病疫源地和其他一切需要消毒的场所，所使用的消毒药品或器械必须经中华人民共和国卫生部批准，并按批准使用的范围和方法在消毒中使用。中华人民共和国卫生部规定消毒药、械按其性能特点，可在物体表面、环境、水体、织物等范围内使用。所有消毒药、械的许可批件均可按产品名称或批件号在卫生部官方网站上查询。,1/21/2023,消毒和灭菌的区别,消毒是指将传播媒介上的病原微生物清除或杀灭，使其达到无害化。灭菌是指将传播媒介上一切微生物全部清除或杀灭，特别是抗力最强的细菌芽孢。,1/21/2023,消毒剂的效能划分,高效消毒剂：指可杀灭一切细菌繁殖体（包括分枝杆菌）、病毒、真菌及其孢子等，对细菌芽孢（致病性芽
3、孢菌）也有一定杀灭作用，达到高水平消毒要求的制剂。中效消毒剂：指可杀灭分枝杆菌、真菌、病毒、及细菌繁殖体等微生物，达到消毒要求的制剂。低效消毒剂：指仅可杀灭细菌繁殖体和亲脂病毒，达到消毒要求的制剂。,消毒剂（Disinfectant）：能够破坏有害细菌（但不是孢子）生长的一类化学或物理试剂。由于其毒性而通常仅作用于非生命物质。杀菌剂（Antiseptic）：能够破坏微生物并且适用于皮肤消毒（低毒性的）的一类化学物质。抑菌剂（Bacteriocide):使细菌致死抑菌（Bacteriostatic）:抑制任何细菌的增长杀孢子剂（Sporicide）:使孢子致死杀真菌剂（Fungicide）:杀死
4、真菌的试剂熏蒸（Fumigation）:用消毒剂的蒸气进行消毒的过程。通常用于封闭的环境如房间或隔离箱灭菌（Sanitisation）:降低微生物污染水平的过程，可以通过化学试剂或物理过程（如：氯，加热，紫外灯）实现这一过程,消毒剂的基本定义,1/21/2023,各种微生物对消毒剂的抵抗力,目前认为，微生物对消毒因子的敏感性，从低到高的排列顺序为：1.亲脂病毒（有脂质膜的病毒），例如乙肝病毒、流感病毒等2.细菌繁殖体3.真菌4.亲水病毒（没有脂质包膜的病毒），例如甲型肝炎病毒、脊髓灰质病毒等5.分枝杆菌，例如炭疽杆菌芽孢、龟分枝杆菌等6.细菌芽孢，例如炭疽杆菌芽孢、枯草杆菌芽孢等7.朊病毒（感
5、染性蛋白质）,1/21/2023,常规的消毒手段,1.低热消毒法（巴斯德消毒法）：至今国内外仍然广泛应用于对牛奶、对血清或者是对一些医疗器械的消毒。2.热力灭菌：在所有的可利用的消毒灭菌方法中，热力灭菌是一种应用最早，效果最可靠，使用最广泛的方法，热可以灭活一切微生物，包括细菌繁殖体，真菌，病毒和抵抗力最强的芽孢，并且加热时温度越高，杀伤力越大。因此，热力灭菌不仅广泛应用于医学消毒灭菌，而且工业灭菌上也深受重视。3.过滤灭菌：以物理阻留的方法，去除介质中的微生物，主要用于液体和气体物质的洁净消毒处理。如微孔滤膜除菌4.微波杀菌：紫外线等5.化学消毒：次氯酸钠，碳酸，乙醇，臭氧，环氧乙烷等,安全
6、、低残留，对设备或表面尽可能无腐蚀性，对产品无毒，无污染宜与常规使用的清洁剂相容，水中溶解度高符合需要控制微生物的类型和数量本身及其使用浓度的溶液稳定水的硬度，有机物或其他物质对其消毒效力影响小。,消毒剂选择的一般原则,浓度：并非浓度越高消毒效力越好，应按照供应商提供的信息配制合理的消毒剂浓度污染程度：包括生物负荷及类型 pH：不同类型的消毒剂有不同的最佳pH使用范围温度：通常消毒剂效力虽温度升高而增加，但也有例外，如次氯酸不适合于高温使用水的硬度或金属离子：一些消毒剂的效力会因金属离子或硬水而下降配方：许多消毒剂的乙醇溶液消毒效力会非常高。螯合剂和缓冲盐也可以提高消毒剂的效力接触时间：保证充
7、分的接触时间确保消毒剂效力,影响消毒剂效力的主要因素,消毒剂在选择时应根据抗菌谱选择安全性高，低毒的产品消毒剂的效力会受到溶液浓度，pH值，生物污染水平，接触表面材质等多种因素影响,小结,1/21/2023,从2010版GMP看,无菌更衣与除菌过滤要求,1/21/2023,无菌更衣,1.新版GMP对无菌更衣的要求2.无菌更衣过程3.人员培训与确认,1/21/2023,各环节降低污染的措施,人、机、料、法、环五方面,1/21/2023,人员,洁净区内的人数应当严加控制，检查和监督应当尽可能在无菌区生产的洁净区外进行。,1/21/2023,生产管理,当无菌生产正在进行时，应当特别注意减少洁净区内的
8、各种活动。应当减少人员走动，避免剧烈活动散发过多的微粒和微生物。由于所穿工作服的特性，环境的温湿度应当保证操作人员的舒适性。来自人员的污染占整个生产污染的比例？,1/21/2023,人员,第二十三条 应当按照操作规程更衣和洗手，尽可能减少对洁净区的污染或将污染物带入洁净区。,1/21/2023,从新版GMP看除菌过滤工艺及验证,1/21/2023,灭菌方法,基本要求第八章设备第四十一条过滤器应当尽可能不脱落纤维。严禁使用含石棉的过滤器。过滤器不得因与产品发生反应、释放物质或吸附作用而对产品质量造成不利影响。第四十二条进入无菌生产区的生产气体（如压缩空气、氮气，但不包括可燃性气体）均应经过除菌过
9、滤，应当定期检查除菌过滤器和呼吸过滤器的完整性。生物制品附录第二十五条管道系统、阀门和呼吸过滤器应当便于清洁和灭菌。宜采用在线清洁、在线灭菌系统。密闭容器（如发酵罐）的阀门应当能用蒸汽灭菌。呼吸过滤器应为疏水性材质，且使用效期应当经验证。第四十七条 培养基宜在线灭菌。向发酵罐或反应罐中通气以及添加培养基、酸、碱、消泡剂等成分所使用的过滤器宜在线灭菌。,1/21/2023,第七十五条 非最终灭菌产品的过滤除菌应当符合以下要求：,（一）可最终灭菌的产品不得以过滤除菌工艺替代最终灭菌工艺。如果药品不能在其最终包装容器中灭菌，可用0.22m（更小或相同过滤效力）的除菌过滤器将药液滤入预先灭菌的容器内。
10、由于除菌过滤器不能将病毒或支原体全部滤除，可采用热处理方法来弥补除菌过滤的不足。（二）应当采取措施降低过滤除菌的风险。宜安装第二只已灭菌的除菌过滤器再次过滤药液，最终的除菌过滤滤器应当尽可能接近灌装点。（三）除菌过滤器使用后，必须采用适当的方法立即对其完整性进行检查并记录。常用的方法有起泡点试验、扩散流试验或压力保持试验。（四）过滤除菌工艺应当经过验证，验证中应当确定过滤一定量药液所需时间及过滤器二侧的压力。任何明显偏离正常时间或压力的情况应当有记录并进行调查，调查结果应当归入批记录。（五）同一规格和型号的除菌过滤器使用时限应当经过验证，一般不得超过一个工作日。,风险,设计,完整性,验证,时限
11、与反复使用,不同灭菌工艺的无菌保证能力,灭菌工艺选择的决策树,产品是否可以121湿热灭菌15分钟,产品是否可以湿热灭菌F08分钟，达到SAL106,产品处方是否可以通过微生物滞留过滤器过滤,（四）使用无菌组分配制和灌封,（一）使用高压灭菌锅12115分钟,（三）无菌过滤和无菌加工结合使用,否,是,否,是,否,是,（二）使用湿热灭菌F08分钟,除菌过滤的风险,过滤前料液的生物负荷过滤器的选择风险与验证困难过滤工艺的操作与控制过滤系统的设计与灭菌验证,应该在什么时候做完整性测试?,灭菌前？灭菌后，过滤前使用前？过滤后？,什么时候检测完整性？,FDA对无菌过滤工艺的指南正常情况下,滤器应在过滤前，即
12、组装好后，且灭菌后执行完整性检测.非常重要的是:在过滤后对滤器进行完整性检测,从而查看滤器是否泄漏和膜已破损.一般认为过滤前后的常规性完整性检测是现行GMP的要求.EU GMP对于已灭菌的滤器的完整性检测应该在使用前和使用后立即执行,例如泡点,扩散流及压力保持试验.,测试起泡点的方法,冲洗,加压,增加压力直到连续起泡在下游出现,扩散流测试方法,上 游 压 力,压缩空气,水浸入法测试,0,2.6,bar,0,10,20,Time(min.),装上干的滤芯,在上游充满水,加压并保持,测量压力衰减,压力导致折叠式滤膜进一步压缩现象是有一定的水流,完整性测试失败处理措施,为什么要进行完整性测试?,除菌
13、工艺需要：滤器性能过滤线的设计与滤器灭菌完整性测试标准的确定法规要求及贸易需要出口认证（FDA，COS,EDMF）SFDA检查,法规中认可的两类完整性测试方法,灭菌方法,第七十五条 非最终灭菌产品的过滤除菌应当符合以下要求：（五）同一规格和型号的除菌过滤器使用时限应当经过验证，一般不得超过一个工作日。,其他章节中对过滤的要求,设备,第四十一条 过滤器应当尽可能不脱落纤维。严禁使用含石棉的过滤器。过滤器不得因与产品发生反应、释放物质或吸附作用而对产品质量造成不利影响。,过滤器析出物评估,在注射剂管理委员会的15及26号报告中描述了过滤器析出物评估方法。了解析出物水平有利于：决定过滤器预先冲洗体积
14、决定过滤器能否用于小体积过滤（无法冲淡和稀释析出物）直接灌装（这时第一瓶的析出物含量最高）考虑使用两种方法：_在实际药物中的析出物 _用溶剂来模拟，检测析出物,设备,第四十二条 进入无菌区生产区的生产用气体（如压缩空气、氮气，但不包括可燃性气体）均应经过除菌过滤，应当定期检查除菌过滤器和呼吸过滤器的完整性。,无菌工艺模拟试验-培养基灌装,主要内容,1.培养基灌装的技术要求2.培养基灌装的实施要点3.结果解释和偏差调查,1.培养基灌装的技术要求,欧盟灭菌工艺决策树,是,否,药液除菌过滤及无菌灌封,否,否,是,是,采用F08的湿热灭菌，以达到SAL10-6,无菌工艺模拟试验定义,无菌工艺模拟试验P
15、rocess Simulation Testing（PST）培养基灌装 Media Fill采用培养基代替药品进行无菌灌装对无菌工艺进行验证。此模拟工艺称之为“培养基灌装”。,进行培养基灌装的目的,验证一个无菌工艺 对无菌工艺过程无菌保证水平的综合评估（设备、人员、操作、灭菌过程、生产环境等）对无菌操作人员进行资格确认确认进行重大变更后对无菌工艺的影响作为问题调查的手段综合反映生产线整体的无菌保证情况，无体现具体某批产品或某个产品的无菌性,培养基灌装试验的频率,初始验证：每班次连续做3批验证随后每半年针对不同班次/工艺进行一次再验证所有日常操作人员每年都必须参加至少一次培养基灌装验证空气净化系
16、统、设备、生产工艺及人员重大变更后，应当重复进行培养基模拟灌装试验,培养基灌装试验的频率,影响无菌灌装过程中无菌保证水平的重大变更需要进行培养基灌装判断：灌装层流改造胶塞进料装置变更终端无菌过滤器改变位置灭菌程序变更,培养基灌装批量,培养基灌装容器的数量应当足以保证评价的有效性。批量较小的产品，培养基灌装的数量应当至少等于产品的批量批次量5000瓶，通常500010000瓶手工灌装 VS 隔离器无菌生产工艺跨班次生产，大批量生产,灌装速度、瓶子尺寸、灌装量,原则速度慢，产品暴露时间长；速度快，有时造成较多的干扰瓶子大（包括敞口大小），灌装速度慢尽量按产品实际灌装体积或更多，体积应能充分接触所有
17、表面、并足够支持微生物生长举例：多规格的瓶子-最慢的速度，最大的瓶子规格;最小的瓶子规格，最快的速度单一规格的瓶子 正常或略慢速度,49,最长允许的灌装时间（如考察操作人员疲劳操作风险）有代表性的正常性操作活动的数量、种类和复杂性，非常规的干扰和各类突发事件（如维修、灌装中断等）冻干过程生产线速度和模具的规格,最差条件挑战,50,人员数量及其活动，换班，休息，更衣等具有代表性数量的无菌操作（如添加容器，密封件，无菌原料成分）或者转移设备无菌连接和拆卸取样操作各个工艺步骤的最长持续时间挑战,最差条件挑战,51,应当根据产品的剂型、培养基的选择性、澄清度、浓度和灭菌的适用性选择培养基TSB或FTM
18、（澄清）某些情况下应该考虑使用厌氧性培养基应该进行促菌生长实验标准菌株环境分离菌,培养基选择,52,在20-25条件下培养7天(培养真菌)，30-35下 7天(培养细菌)确保其内壁和瓶塞充分接触培养基培养基促生长试验应由有资质的人员进行检查无缺损的瓶均应该培养，任何不作培养的瓶子都应说明不作培养的原因要进行物料平衡计算,培养及读数,2.培养基灌装的实施要点,培养基灌装的先决条件,洁净室/设备的验证状态确认经过重大维修或变更后进行了生产线的运行确认或性能确认参与培养基灌装的人员接受了培训无菌操作洁净室行为微生物基础知识培养基灌装方案明文规定的工艺过程及最差条件,培养基灌装方案设计,分析工艺流程，
19、确定风险因素绘制流程图通过分析确定可能造成产品污染的风险因素,灌装时间干扰活动（时间、次数、种类包括停机、维修、调整）冻干过程设备装配（如灌装前的装机）人员数量及其活动无菌操作（如各种无菌部件操作、产品转移）,不同班次轮换，着装更换生产中出现的无菌管道连接无菌样品取样灌装速度重量检查容器密闭性（大小、种类、与设备匹配程度）某些特殊操作（如进行清洁前的操作）,灌装过程流程图,灌装部件装配,管道排液,正式灌装,灌装量检查,添加胶塞,处理倒瓶,人员进出,班次轮换,设置灌装参数,停机维修,环境监测,收集转移,冻干压塞,暂存压盖,人员操作 人员操作时间 时间,风险因素,灌装速度灌装时间长短干扰操作及次数
20、人员数量停机操作,转移操作 时间 暂存位置时间 时间,干扰操作,任何进入A级区的操作都为干扰操作，应包括所有类型的干扰操作 常规的（灌装线装配，称量调节，加胶塞，处理倒瓶，取样，环境监测）非常规的（设备故障，灌装线堵塞，轨道调节，拆卸/替换破损的部件）数量：干扰的次数应该不少于正常生产时发生的次数,人员,人数：模拟无菌区可能容纳最多的人数活动：最多换班次数，不同时间段（日班和中夜班），进行正常操作 频率：无菌区工作人员至少每年参与一次成功的培养基灌装,环境监控和微生物限度控制,制定环境监测计划，综合形成书面方案如何制定环境监测计划其他一些因素的考虑方案的批准制定培养基灌装过程的微生物负荷的监控
21、计划,便于偏差调查,环境监控方案,应用风险评估的方法确定关键监控点给产品构成最大风险的位置，如产品暴露位置、直接接触表面人员按实际需要选择合适的监测方法空气浮游菌沉降菌接触碟/棉签法合理制定控制标准体现全面监控、动态监控,风险点-产品暴露区域 瓶子裸露区灌装站区域胶塞裸露区,至冻干机,例如：在左、中、右各设置一个连续粒子监测点在灌装站左右设置两个浮游菌取样点在左、中、右各设置一个沉降菌取样点在轨道、灌装针头、胶塞盘各处设置多个表面取样点可以参考ISO14644,63,文件记录：过程控制检测和实验室检测结果环境和人员监测结果设备功能（批报警记录，过滤器完整性测试）人员干扰操作、偏差、中断等-发生
22、时间和持续时间培养基报废记录生产线清场记录过程录像,培养基灌装过程记录,64,无菌生产区域管道系统冻干机过程中的培养基泄漏培养基的撤出和报废培养基灌装过程/灌装前不得故意设计不具代表性的大清场、消毒应当采取措施保证验证不能对生产造成不良影响,培养基灌装结束后的清场和清洗,培养基灌装的接受标准,培养基模拟试验的目标是零污染，应当遵循以下原则：灌装数量少于5000支时，不得检出污染品；2.灌装数量在5000至10000时：(1)有1支污染，需进行调查，并考虑重复培养基灌装试验(2)2支污染，需进行调查，进行再验证3.灌装超过10000支时：(1)1支污染，需进行调查(2)2支污染，需进行调查，进行
23、再验证4.发生任何微生物污染时，均应进行调查。,培养结果阳性调查,当培养基灌装出现阳性结果时，不管是否符合合格标准，都必须进行调查，科学评估工艺的可靠性以及上市产品可能存在的风险。发现任何阳性结果样品均属应进行调查。分离到的微生物应鉴别到种。调查过程中应详细分析可能的产生阳性结果的原因。对于超出标准的结果，应当在调查清楚原因后再次进行培养基灌装。,培养结果阳性调查,在明确纠偏行动前，需考虑暂停生产。在工艺重新确认前的产品不得放行。在本次培养基灌装之后生产的到下一次成功的培养基灌装之间的产品都需要被进行回顾，评估其无菌失败的风险。在该次培养基灌装和上一次成功的培养基灌装之间的产品也需要被进行回顾
24、，评估其无菌失败的风险。必要时，需制定纠偏和预防性措施，并进行工艺的重新确认。,污染调查举例,发现污染瓶的调查应该从人、机、料、法、环各个方面进行调查。（1）生产环境监测数据（粒子、浮游菌、沉降碟等）（2）对人员的监测结果（3）高效过滤器的完整性检测数据（4）层流台性能数据（气流流速、压差记录等）（5）生产房间监控数据（空气流向、工作台面气流方向速度）（6）人员培训情况，操作资质和能力（7）干扰模拟的执行情况（8）无菌室生产用具和其他相关物品的灭菌储存情况,污染调查举例,（9）微生物鉴定结果，以帮助确定来源（10）清洁消毒流程的执行情况（11）设备仪器的校验结果（12）生产前后产品过滤器的泄露
25、测试数据（13）生产过程发生的偏差（14）设备的CIP/SIP的情况（15）生产线和培养基灌装的历史数据分析,污染调查举例,根据调查分析确定可能引起污染的原因，针对性制定有效措施。所有调查行动、改进措施和结果都应当形成正式文件记录。,培养基灌装失效,培养基灌装试验结果被认作无效的情况不应该频繁发生，更不能直接将失败的培养基灌装结果视为无效在符合明确的书面规程要求的情况下才能做出试验无效的判定，此时，应给出支持文件并充分说明理由，并且在实际生产中遇到类似情况时也应同样处理。失效=无测试注意:如果不可接受的情况发生，最好先停止培养基灌装，再判断是否是失效.,培养基灌装失效,以下是可能造成培养基灌装失效结果的问题:培养基促生长试验失败在无菌生产区域的物理条件发生问题(例如断电、HEPA发生泄漏)培养基灌装过程中一些违反规程的操作，这些操作可能造成批生产中止/报废培养基灌装可能因为上述的任何一个或所有类似其他原因造成失效,这些问题可能造成灌装的中止或失效。但是，培养基灌装中止的事件需要有详细的说明记录。,培养基灌装是对无菌工艺过程无菌保证水平的综合评估，目标是零污染。,谢 谢！,
