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1、疟原虫检验技术,重庆市疾病控制中心地寄所 课件责任人 蒋诗国 2010年9月,血涂片检查疟原虫是诊断和鉴定疟原虫种别的主要方法，也是疟疾流行病学调查的重要部分，血涂片制作和染色的好坏足以影响检查的结果，必须把握好“三关”。,玻片清洁。清洁的玻片无油脂，无划痕，无灰尘，玻片上有油迹，使厚血膜容易脱落，薄血膜涂布不均匀。在用手指持玻片时，只能夹持玻片的两侧边缘，不要接触玻片的表面，以避免手指上的油污染玻片。,一、玻片清洁,新的载玻片先用热肥皂水洗涤，再用清水冲洗，然后用软而洁净的毛巾擦干待用。,(一)新的载玻片的洗涤,5%的肥皂水煮沸法：将洗衣肥皂削成小片，加水配成约5%的肥皂水，煮沸后将玻片一张
2、一张地平放进肥皂水内，微火煮约一刻钟，然后灭火待肥皂水稍冷后，将洁干毛巾擦净后待用。,(二)使用过的载玻片的清洁方法有两种：,清洁液浸泡法：,清洁液配制如下：重铬酸钾 80g浓硫酸 100ml水(清净水)1000ml,配制时须先将重铬酸钾研细放入水中，慢慢加温到全部溶解为止，然后缓缓加入浓硫酸，待溶液冷却后倒入有盖的大口玻璃缸内。清洁玻片时，将待洗的玻片逐张放入清洁中浸泡一两天后，取出清水冲洗至完全没有黄色为止。浸泡前最好用二甲笨除去镜油，清洁液颜色变为墨绿色后即失去清洁作用，不能再用。,二、制片,1.薄血膜涂制2.厚血膜涂制薄血膜 厚血膜 标记处,1.薄血膜涂制：,1.薄血膜涂制(1)先用7
3、5%酒精棉球将耳垂消毒，待酒精干后用采血针迅速刺入耳垂近下端边缘处。(2)用左手的拇指与食指以及右手的中指向相对的方向将耳垂轻轻挤压出血。(3)取一张洁净的载玻片，将它的左1/3的表面接触耳垂上的血滴（不要将玻片接触耳垂上的皮肤），使一小滴血在玻片上。血量1-1.5mm3.1/4火柴头大小。,(4)将推片置于血溶之前与血液相接触，待血液沿推片边缘展开后，将推片与载玻片保持30角度，用力均匀迅速将推片由右向左推出而制成薄血膜。涂制得较好的薄血膜只有一层血球，血球的分布排列比较均匀，血膜的末端突出如舌状。若取的血滴太大，则涂制的血膜太宽太厚；若推时用力不均匀，则易成梯田状.若用力太大，则血膜两端过
4、厚，若涂片上有油污，则血膜成多孔状。,薄血膜涂好后，再轻挤耳垂挤出约火柴头大一血滴，将这一滴血滴在玻片的中心1/3处然后用推片的一角由血滴中央向周围旋转涂成直径约一厘米的圆形血膜，旋转涂制时间不宜过短，以免形成纤维蛋白束，遮盖了疟原虫。厚血薄涂好后，应平放待干，防苍蝇舔食血膜或灰尘落在上面。受检者的编号可用铅笔或钢笔写在薄血膜的边缘上，也可用蜡笔写在厚血膜一端。,2.厚血膜涂制,血片制作和染色质量规范,血片制作和染色质量判定标准1.血片制作质量判定标准：好：厚薄血膜均好，或薄血膜好，厚血膜中。中：薄血膜中，厚血膜好或中。差：薄血膜差，或厚薄血膜均差。,2.血片制作和染色合格率要求：分别以血片制
5、作、染色和清洁度的好、中、差合并计算合格率。(1)血片制作合格率应在85%以上。(2)染色合格率应在85%以上。(3)清洁度合格率应在80%以上。,三、染色,常用的染色方法有姬姆萨氏和瑞氏两种(一)吉氏染色法：吉氏染剂是最可靠的血膜染剂，其优点是易于掌握很少染色过度，染好后的血膜褪色较慢.,吉氏染剂粉0.5g甘油（中性）25ml甲醇（纯，分析纯）25ml将吉氏染剂粉0.5置于乳钵中，加少许甘油充分研磨，再加甘油研磨，直至25ml甘油加完为止。将充分研磨的吉氏甘油液倒入无水，干净的棕色玻塞瓶中，然后分次加甲醇于乳钵洗出染剂倒入瓶中，直至25甲醇将乳钵洗净并全部倒入瓶中，塞紧，充分摇匀，放置室内一
6、星期，每天摇动数次，以后即可使用.,1.吉氏染剂的配制：,为了保证染色良好，使疟原虫的红核和兰胞浆分明，感染的红血球上的薛氏小点清楚，在稀释染剂原液时，所用的蒸馏水必须加缓冲液（缓冲蒸馏水）。新鲜蒸馏水可能接近中性，但贮存在一个时期后，由于吸收了空气中的二氧化碳而变为酸性，因此蒸馏水中必须加缓冲液，使其达到我们需要的酸碱度。,2.缓冲液的配制;,磷酸氢二钠（无水）9.5g蒸馏水1000ml磷酸二氢钾9.07g蒸馏水1000ml将上二液分别贮存于紧塞的玻瓶中。,缓冲液配制：,稀释染剂所用的蒸馏水的ph以7.0-7.2为最适宜，现用现配，可按下表配制：缓冲蒸馏水的配制（ml）,ph 磷酸二氢钠液磷
7、酸二氢钾液蒸馏水6.637639006.849519007.063379007.273279007.48119900在无条件的地方，此时也可用当地的饮用水煮沸过滤后试染，试染结果如淋巴细胞的胞浆呈兰色红血球染色不很兰就可使用。,3.染色步骤：,固定：用吉氏染液染色须先将薄血膜用甲醇或无水酒精固定。滴于薄血膜上，也可用玻棒沾取甲醇涂在薄血膜上，避免甲醇流至厚血膜，误将其固定，可用蜡笔划一条线，或者是斜放玻片，玻片上的甲醇蒸发干后即可染色。溶解血红蛋白，在厚血膜上加2-3滴蒸馏水，待血红蛋白充分溶解后倾去玻片上的水，待血膜干后即可染色。,染色：,快染：5：1(20%)，5滴水，1滴染液(原液)，染
8、5分钟清水冲洗即成。慢染：20：1(5%)，20滴水，1滴染液(原液)，染30分钟用清水冲洗。待片水干后镜检。,(二)瑞氏染色法：,瑞氏染色法的优点是操作简便快速，缺点是染液在热的环境中易变质，且染色时间不易掌握，血膜上有染剂沉淀；用本法染色的血膜退色较快，不宜作长久保存的标本。,瑞氏染剂粉 0.2g 甘油(中性)3ml(无中性的也可)甲醇(中性)97 ml 将瑞氏染粉放入乳钵中，加入甘油充分研磨，然后加入甲醇10 ml，混合后倒入干燥、清洁的棕色玻璃瓶内，分次将甲醇倒入乳钵内，至乳钵内染剂洗净为止，配制好的染液充分摇匀即可使用。,1.瑞氏染剂的配制,（1）先用蜡笔在厚薄血膜间划一界限，然后用
9、缓冲蒸留水滴2-3滴在已干的厚血膜上，溶血后倾去水滴。（2）加瑞氏染液5-8滴于薄血膜上，染色1-2分钟。（3）加5-8滴缓冲蒸留水于薄血膜上，用吸管混合均匀后把染液引到厚血膜上，使厚薄血膜同时染色约10分钟。（4）用清水轻轻冲去染液，将玻片直立待干后镜检,2.染色步骤,四、镜检,(1)间日疟原虫薄血片形态被寄生红细胞的形态变化 大小：显著胀大 色泽：褪色 斑点：红色的薛氏小点，细小数目多，重复感染：不多见,小滋养体,胞浆：淡蓝色，较大，稍粗厚，有一个空泡。核：红色，通常一个，圆形。体积：较大，约占红细胞直径的三分之一。,大滋养体,胞浆：阿米巴样，含数个空泡，体积较大，浅蓝色核：一个，呈点状或
10、杆状，疟色素：短杆状，细小，棕黄色,胞浆：阿米巴样，体积很大，空泡甚小或消失，兰色核：2-10个团块，不规则，疟色素：细杆状，棕黄色，分布不均匀,早期裂殖体,裂殖体,裂殖子：12-24个，多为16-18个，排列不规则，疟色素：棕黄色，常集中于一侧。,形状：圆形，较小胞浆：淡兰色，核：疏松，较大，常位于中央疟色素：棕色，杆状，均匀散在，,小配子体,大配子体,形状：圆形，较大胞浆：深兰色核：致密，位于一侧疟色素：棕黄色，均匀散在，数很多。,(2)间日疟厚血片形态,小滋养体 胞浆：大多呈“感叹号”，“问号”，飞鸟等形状。核：较大，多数是一个，,间日疟的大滋养体相当大，形状不一，变化很多，胞浆兰色，分
11、散断裂成为大小数目不等、边缘不清楚的圆块，这是间日疟原虫大滋养的特征，核一个，大而明显，呈不整齐的圆形，位于胞浆的中央或边缘。疟色素短杆状，棕黄色，分布于胞浆上中。,大滋养体,胞浆多，形态变化很大，有分布断裂成块现象，核分裂成数个，较大，呈圆形或不规则的圆形，零乱地分布在胞浆中，棕黄色短杆状的疟色素较多。,裂殖体前期,胞浆多，形态变化很大，有分布断裂成块现象，核分裂成数个，较大，呈圆形或不规则的圆形，零乱地分布在胞浆中，棕黄色短杆状的疟色素较多。,裂殖体前期,裂殖子12-24个不等，色素集中，位于中央或一侧。,成熟裂殖体,间日疟原虫的配子体很大，几乎同中性白细胞同样大小，胞浆完整致密呈圆形或椭
12、圆形，雌雄配子体的形态与薄片上的形态完全相同，配子体有时易与晚期滋养体相混淆，但配子体的胞浆比较固实，色素颗粒多而分散并有沿边缘分布现象。,配子体,间日疟雄配子体 间日疟配体子体,1恶性疟原虫薄血膜-环状体,环纤细,约为RBC直径的1/5核1个，但2个常见红细胞常含2个以上原虫虫体常位于红细胞的边缘，呈“鸟飞状”,2 恶性疟原虫大滋养体,一般不出现在外周血体小结实，圆形，不活动疟色素集中一团，黑褐色原虫此时开始集中在内脏毛细血管,3恶性疟早期裂殖体,4恶性疟原虫成熟裂殖体,裂殖子836个，通常1824个，排列不规则疟色素集中成一团虫体占红细胞体积的23至34,5 恶性疟原虫雌配子体,新月形，两
13、端较尖核致密，深红色，常位于中央疟色素黑褐色，分布于核周围,5 恶性疟原虫雄配子体,腊肠形，两端钝圆胞质色蓝而略带红核疏松，淡红色，位于中央疟色素黄棕色，小杆状，在核周围较多,恶性疟厚血片形态环状体 核1-2个，常呈“!”、飞鸟等形状。大滋养体常呈圆形、疟色素集成1-2个团。裂殖体较小，裂殖子8-26个。配子体新月形，雄配子体腊肠形。,五、是非区别,1.生物的物质 血液内的有性成分，白血球残块、血小板碎块、红血球内何杰-乔氏点、卡玻氏环，水生阿米巴、细菌、滴虫等。特点：无疟色素 凑合常不完善 大小与疟色素不符。,染料杂质、灰尘。特点：无生物体死亡的自如感觉 常折光 有凑合的痕迹。,2.无生命的物质,3.厚薄血膜之差,薄血膜：用血少，疟原虫形态完整，便于观察，利于鉴别虫种，但费时间，阳性率低。厚血膜：血量多而集中，省时间、准确性高、但较难掌握。,六、疟原虫计数,1.视野平均法：看的视野数除以原虫数(1-5+,6-10+,100以上+)。2.白细胞疟原虫比例计算法：按常规计算白细胞总数，查多少个白细胞找到几个疟原虫，公式 wbc/mm3疟原虫数/白细胞数。如wbc6000/mm3，数500个wbc，发现100个疟原虫，600100/500=1200个/mm3疟原虫。,谢谢,
