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1、3.3 总挥发性有机化合物（tvoc）的测定毛细管气相色谱法,职业任务模块三 有机污染物的测定,室内空气质量标准 GB/T 188832002附录C（规范性附录）室内空气中总挥发性有机物（TVOC）的检验方法（热解吸/毛细管气相色谱法）,3.3 总挥发性有机化合物（tvoc）的测定毛细管气相色谱法,选择合适的吸附剂Tenax(2,6-二苯基对苯醚）GC 或Tenax TA，用吸附管采集一定体积的空气样品，空气流中的挥发性有机化合物保留在吸附管中。采样后，将吸附管加热，解吸挥发性有机化合物，待测样品随惰性载气进入毛细管气相色谱仪。用保留时间定性，峰高或峰面积定量。,方法原理,1 测定范围：本法适
2、用于浓度范围为0.5g/m3100mg/m3之间的空气中VOCS的测定。2 检测下限：采样量为10L时，检测下限为0.5 g/m3。,室内空气质量标准规定：TVOC标准值为0.6mg/m3,适用范围,1 VOCs：为了校正浓度，需用VOCs作为基准试剂，配成所需浓度的标准溶液或标准气体，然后采用液体外标法或气体外标法将其定量注入吸附管。2 稀释溶剂：液体外标法所用的稀释溶剂应为色谱纯，在色谱流出曲线中应与待测化合物分离。3吸附剂：使用的吸附剂粒径为0.180.25mm（6080目），吸附剂在装管前都应在其最高使用温度下，用惰性气流加热活化处理过夜。为了防止二次污染，吸附剂应在清洁空气中冷却至室
3、温，储存和装管。解吸温度应低于活化温度。由制造商装好的吸附管使用前也需活化处理。4 纯氮：99.99%。,试剂和材料,分析过程中使用的试剂应为色谱纯；如果为分析纯，需经纯化处理，保证色谱分析无杂峰。,仪器和设备,1 吸附管：是外径6.3mm、内径5mm、长90mm或180mm，内壁抛光的不锈钢管，吸附管的采样入口一端有标记。吸附管可以装填一种或多种吸附剂，应使吸附层处于解吸仪的加热区。根据吸附剂的密度，吸附管中可装填2001000mg的吸附剂，管的两端用不锈钢网或玻璃纤维毛堵住。如果在一支吸附管中使用多种吸附剂，吸附剂应按吸附能力增加的顺序排列，并用玻璃纤维毛隔开，吸附能力最弱的装填在吸附管的
4、采样入口端。,仪器和设备,2 注射器：可精确读出0.1L的10L液体注射器；可精确读出0.1L的10L气体注射器；可精确读出0.01mL的1mL气体注射器。3 采样泵：恒流空气个体采样泵，流量范围0.020.5L/min，流量稳定。使用时用皂膜流量计校准采样系统在采样前和采样后的流量。流量误差应小于5%。4气相色谱仪：配备氢火焰离子化检测器、质谱检测器或其他合适的检测器。色谱柱：非极性（极性指数小于10）石英毛细管柱。,石英毛细管柱,长50m、内径 0.32mm石英柱，内涂二甲基聚硅氧烷，膜厚1-5m;程序升温50-250C，初始温度为50C，保持10min，升温速率5C/min;分流比为(1
5、:1)-(10:1).,仪器和设备,5 热解吸仪：能对吸附管进行二次热解吸，并将解吸气用惰性气体载带进入气相色谱仪。解吸温度、时间和载气流速是可调的。冷阱可将解吸样品进行浓缩。6 液体外标法制备标准系列的注射装置：常规气相色谱进样口，可以在线使用也可以独立装配，保留进样口载气连线，进样口下端可与吸附管相连。,将吸附管与采样泵用塑料或硅橡胶管连接。个体采样时，采样管垂直安装在呼吸带；固定位置采样时，选择合适的采样位置。打开采样泵，调节流量，以保证在适当的时间内获得所需的采样体积（110L）。如果总样品量超过1mg，采样体积应相应减少。记录采样开始和结束时的时间、采样流量、温度和大气压力。采样后将
6、管取下，密封管的两端或将其放入可密封的金属或玻璃管中。样品可保存5天。,采样及样品保存,分析步骤,1 样品的解吸和浓缩 将吸附管安装在热解吸仪上，加热，使有机蒸气从吸附剂上解吸下来，并被载气流带入冷阱，进行预浓缩，载气流的方向与采样时的方向相反。然后再以低流速快速解吸，经传输线进入毛细管气相色谱仪。传输线的温度应足够高，以防止待测成分凝结。解吸条件(见表1)。,解吸条件,分析步骤,2 色谱分析条件 可选择膜厚度为15m 50m0.22mm的石英柱，固定相可以是二甲基硅氧烷或7%的氰基丙烷、7%的苯基、86%的甲基硅氧烷。柱操作条件为程序升温，初始温度50保持10min，以5/min的速率升温至
7、250。,分析步骤,3 标准曲线的绘制 气体外标法：用泵准确抽取100g/m3的标准气体100ml、200ml、400ml、1L、2L、4L、10L通过吸附管，制备标准系列。液体外标法：利用标准系列进样装置取15l 含液体组分100g/ml和10g/ml的标准溶液注入吸附管，同时用100ml/min的惰性气体通过吸附管，5min后取下吸附管密封，制备标准系列。用热解吸气相色谱法分析吸附管标准系列，以扣除空白后峰面积的对数为纵坐标，以待测物质量的对数为横坐标，绘制标准曲线。,分析步骤,4 样品分析 每支样品吸附管按绘制标准曲线的操作步骤（即相同的解吸和浓缩条件及色谱分析条件）进行分析，用保留时间
8、定性，峰面积定量。,结果计算,1 将采样体积按式（1）换算成标准状态下的采样体积(1)式中V0换算成标准状态下的采样体积，L；V采样体积，L；T0标准状态的绝对温度，273K；T采样时采样点现场的温度（t）与标准状态的绝对温度之和，（t+273）K；P0标准状态下的大气压力，101.3kPa；P采样时采样点的大气压力，kPa。,结果计算,2 TVOC的计算（1）应对保留时间在正己烷和正十六烷之间所有化合物进行分析。（2）计算TVOC，包括色谱图中从正己烷到正十六烷之间的所有化合物。（3）根据单一的校正曲线，对尽可能多的VOCs定量，至少应对十个最高峰进行定量，最后与TVOC一起列出这些化合物的
9、名称和浓度。（4）计算已鉴定和定量的挥发性有机化合物的浓度Sid。（5）用甲苯的响应系数计算未鉴定的挥发性有机化合物的浓度Sun。（6）Sid与Sun之和为TVOC的浓度或TVOC的值。（7）如果检测到的化合物超出了（2）中VOC定义的范围，那么这些信息应该添加到TVOC值中。,结果计算,3 空气样品中待测组分的浓度按（2）式计算-(2)式中:c空气样品中待测组分的浓度,g/m3;F样品管中组分的质量,g;B空白管中组分的质量,g;V0标准状态下的采样体积，L。,本文观看结束！,谢 谢欣 赏！,5-Aza-CdR对人食管癌细胞株生物学行为及TFPI-2 mRNA表达的影响,5-Aza-CdR对
10、人食管癌细胞株生物学行为及TFPI-2 mRNA表达的影响 作者：杜雅冰，邵应举，樊青霞，孙桢，王琳，赵培荣 作者单位：(郑州大学第一附属医院肿瘤内科，河南郑州450002)【摘要】目的探讨5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-2-deoxycytidine,5-Aza-CdR)干预对食管鳞癌细胞株Eca9706生长增殖及其组织因子途径抑制物2(tissue factor pathway inhibitor-2，TFPI-2)基因表达的影响。方法选取食管鳞癌细胞株Eca9706，并用不同浓度的5-Aza-CdR处理该细胞株。MTT法检测干预前后细胞增长率的变化，FCM法检测干预前后细胞凋亡率的变
11、化，RT-PCR技术检测干预前后Eca9706细胞TFPI-2基因mRNA的表达，免疫组化检测干预前后Eca9706细胞TFPI-2蛋白的表达。结果食管鳞癌细胞株Eca9706存在TFPI-2基因超甲基化状态，经5-Aza-CdR处理后，超甲基化状态解除，细胞增殖受到抑制，细胞凋亡率明显提高(P0.05);细胞中TFPI-2蛋白表达明显增强，同时mRNA的表达水平也较处理前明显提高(P0.05)。结论食管癌细胞系TFPI-2基因超甲基化可抑制其mRNA表达，当其超甲基化解除后，细胞增殖受到抑制，同时细胞凋亡率相应提高。,【关键词】食管癌;组织因子途径抑制物-2;5-氮杂-2-脱氧胞苷;甲基化;
12、免疫组化;逆转录聚合酶链反应;凋亡 ABSTRACT：ObjectiveTo explore the effects of 5-Aza-2-deoxycytidine(5-Aza-CdR)intervention on the growth and proliferation of Eca9706 cell line and protein expression of tissue factor pathway inhibitor-2(TFPI-2).MethodsEca9706 cell line was treated by 5-azaCdR of different concentrat
13、ions;MTT，flow cytometry，immunohistochemistry and RT-PCR were used to determine the cell growth，apoptosis，and the expression of TFPI-2 gene and its protein.ResultsEca9706 cell line had hypermethylation of TFPI-2.After demethylation by 5-Aza-CdR treatment，the proliferation of Eca9706 was inhibited，the
14、 apoptosis rate was also increased significantly in the concentration-dependent manner.RT-PCR detected that mRNA expression of TFPI-2 gene in Eca9706 cell line recovered significantly(P0.05).Conclusion5-Aza-CdR can slow the growth of Eca9706 cell，increase the apoptosis rate，reactivate the TFPI-2 gen
15、e transcription and protein expression by demethylation.KEY WORDS：esophageal carcinoma;tissue factor pathway inhibitor-2;5-Aza-CdR;methylation;immunohistochemistry;RT-PCR;apoptosis,组织因子途径移植物2(tissue factor pathway inhibitor，TFPI-2)是丝氨酸蛋白酶抑制物，在调控肿瘤细胞浸润转移方面起着重要作用。目前，关于TFPI-2在食管癌中的基因表达情况的分析研究尚少。本研究旨在探讨
16、TFPI-2基因的失活机制，并寻找食管癌治疗的新靶点。1材料与方法 1.1材料 RPMI-1640培养基购自北京索莱宝生物科技有限公司;标准胎牛血清购自天津市灏洋生物制品科技有限公司;Trizol试剂购自MBI公司;RT-PCR试剂盒购自MBI公司;5-Aza-CdR购自Sigma公司;人食管癌细胞株Eca9706由郑州大学肿瘤生物学研究室惠赠。1.2细胞培养和药物处理 人食管癌细胞Eca9706以含10 mL/L胎牛血清的RPMI-1640培养基，37、50 mL/L CO2培养箱培养，每23 d消化传代1次。1.3MTT法检测干预前后细胞增长率的变化 取对数生长期细胞，调整密度至5104/
17、mL接种于96孔板，按5-Aza-CdR浓度分为6组：0、0.4、1.6、6.4、25.6、102.4 mol/L，每组复设5个孔。待细胞贴壁后，分别于24、48、72 h后加入MTT液，4 h后弃去上清液，每孔加DMSO 150 L，在490 nm波长测定各孔吸光度值(absorbance，A)。细胞增殖抑制率(cellular proliferation inhibition rate，CPIR)按公式计算：CPIR=(1-实验组A均值/对照组A均值)100%。,1.4流式细胞仪(FCM)检测干预前后细胞凋亡率的变化 取对数生长期细胞，按5105/mL的密度接种于6孔板内，待细胞贴壁后加药
18、，分组如下：对照组(0 mol/L),1.6 mol/L 5-Aza-CdR组，25.6 mol/L 5-Aza-CdR组，102.4 mol/L 5-Aza-CdR组。每组均于5-Aza-CdR作用48 h后消化收集细胞，700 mL/L冰乙醇固定，流式细胞仪进行细胞凋亡测定。1.5RT-PCR技术检测TFPI-2基因mRNA的表达 分组同FCM，每组细胞均5-Aza-CdR作用48 h。TFPI-2的上、下游引物分别为5-GTCGATTCTGCTGTTTTCC-3和5-ATGGAATTTTC TTTGGTGCG-3，合成产物为440 bp;-actin作为内参照，上下游引物分别为5-AGG
19、CATTGTGATGGACTCCG-3和5-AGTGATGACCTGGCCGTCAG-3，合成产物为301 bp。按照试剂盒说明书，用Trizol试剂提取细胞总RNA，经紫外分光光度计分析后，按Sigma公司RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit说明书操作。先逆转录制备单链cDNA，再以逆转录产物为模板，用上、下游产物进行PCR反应扩增目的基因。反应条件为：94 预变性3 min，然后94 变性30 s,51 退火30 s,72 延伸30 s，循环30次，最后72 延伸5 min,4 保温。扩增片段经20 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。,1.6免疫组化方
20、法检测TFPI-2蛋白的表达 取对数生长期细胞，按5104/mL的密度接种于经预处理的盖玻片上，待细胞贴壁后加药(分组同RT-PCR)。培养48 h后加入40 g/L多聚甲醛溶液固定30 min,30 mL/L H2O2封闭内源性过氧化物酶，室温下10 min,100 mL/L动物血清封闭，室温下10 min，滴加1100的稀释的TFPI-2抗体4 过夜，二抗室温下1 h，滴加辣根酶标记链霉卵白素，37 孵育30 min，DAB显色，苏木精复染，脱水透明封片。另取爬片滴加PBS 液代替一抗作为阴性对照。结果判定：TFPI-2蛋白阳性信号均呈棕黄色颗粒样物质，位于细胞质内。光镜下随机选取10个视
21、野(每个视野观察细胞数不少于100个)，按阳性细胞所占百分比进行结果判定。阳性率=(阳性细胞数/1 000)100%。1.7统计学处理 应用SPSS16.0软件进行统计学处理。实验数据采用均数标准差(x-s)表示，采用单因素方差分析加LSD两两比较法进行分析。检验水准=0.05。2结果 2.1干预前后细胞增长率的变化 经MTT检测，结果显示，实验组细胞抑制率明显高于未加药组，且随着作用时间的延长和浓度的增加而增加(表1)。表1不同浓度的5-aza-CdR对Eca9706细胞增殖的影响,2.2干预前后细胞凋亡率的变化 流式细胞仪分析可见，经不同浓度5-Aza-CdR诱导48 h后，Eca9706
22、细胞各处理组凋亡率分别为(13.760.47)%、(26.970.39)%、(41.030.19)%，与5-Aza-CdR诱导浓度成正比。与对照组(1.390.27)%比较差异有统计学意义(P0.05)，且各浓度组间比较差异亦有统计学意义(P0.05，图1)。以上实验重复5次。2.3干预前后Eca9706细胞mRNA的表达情况 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳显示，Eca9706细胞中TFPI-2 mRNA表达在各用药组和未用药组之间有明显差异，TFPI-2 mRNA在未用药组细胞中未见表达。经1.6、25.6、102.4 mol/L 5-Aza-CdR处理后可见TFPI-2 mRNA表达，表明在一定
23、范围内随5-Aza-CdR药物浓度的增加TFPI-2 mRNA表达逐渐增强(图2)。图1各组流式细胞凋亡散点图A：对照组;B：1.6 mol/L 5-Aza-CdR组;C：25.6 mol/L 5-Aza-CdR组;D：102.4 mol/L 5-Aza-CdR组。图25-Aza-CdR处理前后Eca9706细胞TFPI-2 mRNA的表达M：DNA marker;-actin：301 bp;TFPI-2：440 bp;1：对照组;2：102.4mol/L组;3：25.6 mol/L组;4：1.6 mol/L组;5：H2O对照组。,2.4干预前后TFPI-2蛋白的表达情况免疫组化结果显示，经5
24、-Aza-CdR作用Eca9706细胞48 h，,TFPI-2蛋白的阳性表达率增加，对照组、1.6 mol/L组、25.6 mol/L组、102.4 mol/L组TFPI-2蛋白的阳性表达率分别为(2.101.42)%、(9.312.70)%、(14.723.50)%、(68.203.20)%，不同浓度组之间以及用药组与对照组之间的差异均有统计学意义(P0.05，图3)。图3各组TFPI-2蛋白的表达情况 3讨论 人TFPI-2(hTFPI-2)基因定位于7q22区域，全长由8164个碱基组成，其cDNA全长为1 222 kb。其mRNA的启动子具有典型的管家基因特征，没有典型的TATA盒或C
25、AAT盒，在推定的转录起始位点区域GC含量超过80%1。TFPI-2可在体内多种组织广泛表达，在这些组织内一旦出现肿瘤，TFPI-2的表达水平也会随之显著下降2。有研究证实，在绒毛膜癌、乳腺癌、前列腺癌、神经胶质细胞瘤、纤维肉瘤和胸部恶性肿瘤组织中，与肿瘤产生相关的TFPI-2表达水平减少可能与其启动子的甲基化密切相关1,3-5。启动子区cpG岛高甲基化在肿瘤形成机制中的确切作用尚不清楚，然而众多证据表明，肿瘤抑癌基因CpG岛异常的甲基化导致基因失活和转录抑制是肿瘤发生的重要机制之一6-8。,目前，有体外实验表明，DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR通过去甲基化作用可使多种含有CpG岛的高
26、甲基化抑癌基因重新表达，从而恢复抑癌功能9。本实验RT-PCR结果显示，TFPI-2在Eca9706细胞中无表达，经过不同浓度的5-Aza-CdR处理Eca9706细胞后，TFPI-2亦重新出现表达，且在一定范围内随药物诱导浓度的增大表达逐渐增强。MIZUNO等10研究表明，肿瘤细胞中DNMT的表达较正常的高412倍，也证实DNMT上调参与肿瘤发生。这与我们的实验结果一致。根据MTT实验可知，经过5-Aza-CdR干预处理过的Eca9706细胞增殖明显受抑制，且随着药物浓度的增加，抑制作用越明显。从本实验结果分析，DNA启动子区去甲基化能较明显地抑制食管癌细胞增殖，并与其诱导剂量呈正相关，推测
27、这种抑制作用与去甲基化后重新激活TFPI-2基因的转录和表达有着直接关系;此外可能与去甲基化后诱导细胞凋亡有关。进而通过流式细胞仪分析，结果显示，经不同浓度5-Aza-CdR干预的Eca9706的细胞中，用药组与对照组相比细胞凋亡率凋亡率有所增加，并且与5-Aza-CdR诱导剂量有依赖性关系。BENDER等11在同等条件下用5-Aza-CdR处理恶性肿瘤细胞系和正常纤维细胞系时，发现肿瘤细胞增殖均被抑制，而纤维细胞增殖不被抑制。因此，5-Aza-CdR对Eca9706细胞增殖的抑制及凋亡的增加不是药物的毒性影响，可能是因为使TFPI-2重新表达的结果。,目前，国外以TFPI-2为药物研究靶点，
28、就TFPI-2在肿瘤治疗、肿瘤临床诊断、促进伤口愈合和动脉粥样硬化治疗等领域中的应用，也正在进行广泛深入的研究。本研究用甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR处理人食管癌Eca9706细胞株，检测TFPI-2基因表达的变化及其对细胞增殖和凋亡的影响，以期寻找治疗肿瘤的新靶点。【参考文献】1HUBE F，REBERDIAU P，IOCHMANN S，et al.Characterization and functional analysis of TFPI-2 gene promoter in a human choriocarcinoma cell line J.Thromb Res，203，10
29、9(4)：207-215.2MIYAGIi Y，KOSHIKAWA N，YASUMITSU H，et al.cDNA cloning and mRNA expression of a serine protein 5 and tissue factor pathway inhibitor-2 J.J Biochem，1994，116(5)：939-942.3RAO CN，SEGAWA T，NAVARI JR，et al.Methylation of TFPI-2 gene is not the sole cause of its silencing J.Int J Oncol，2003，22(
30、4)：843-848.4KONDURI SD，SRIVENUGOPAL KS，YANAMANDRA N，et al.Promoter methyl and silencing of the tissue factor pathway inhibitor-2(TFPI-2)，a gene encoding an inhibitor of matrix metalloproteinases in human glioma cells J.Oncogene，2003，22(29)：4509-416.,5STEINER FA，HONG JA，FISCHETTE MR，et al.Sequential5
31、-Aza-2-deoxycytidi-ne/depsipeptide FK228 treatment induces tissue factor pathway inhibitor 2(TFPI-2)expression in cancer cells J.Oncogene，2005，24(14)：2386-2397.6HERMAN JG，BAYLIN SB.Promoter-region hypermethylation and gene silencing in human cancer J.Curr Top Microbiol Immunol，2000，249：35-54.7JONES
32、PA，BAYLIN SB.The fundamental role of epigenetic events in cancer J.Nat Rev Genet，2002，3(6)：415-428.8EHRLICH M.DNA methylation in cancer：too much，but also too little J.Oncogene，2002，21(35)：5400-5413.9PAZ MF，FRAGA MF，AVILA S，et al.A systematic profile of DNA methylation in human cancer cell lines J.Ca
33、ncer Res，2003，63(5)：1114-1121.,10MIZUNO S，CHIJIWA T，OKAMURA T，et al.Expression of DNA methyltransferases DNMT1，3A，and 3B in normal hematopoiesis and in acute and chronic myelogenous leukemia J.Blood，2001，97(5)：1172-1179.11BENDER CM，PAO MM，JONES PA.Inhibition of DNA methylation by 5-Aza-2-deoxycytidine suppresses the growth of human tumor cell lines J.Cancer Res，1998，58(5)：95-101.申明：本论文版权归原刊发杂志社所有，我们转载的目的是用于学术交流与讨论，仅供参考不构成任何学术建议。,幻灯片放映结束！谢谢,请您提出宝贵意见！再见,O(_)O谢谢各位！OK,
