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1、第四章 微生物培养基,4.1 培养基的类型,4.2 微生物的营养类型,4.3 培养基的营养成分,4.4 选用和设计培养基的原则和方法,微生物的特点：,食谱广、胃口大,营养物质：那些能够满足微生物机体生长、繁殖和完成各种 生理活动所需的物质,营养：微生物获得和利用营养物质的过程,营养物质是微生物生存的物质基础，而营养是生物维持和延续其生命形式的一种生理过程。,微生物的营养要求,微生物细胞的化学组成,微生物细胞,水：70%-90%,干物质,有机物蛋白质、糖、脂、核酸、维生素等及其降解产物,无机物（盐）,微生物、动物、植物之间存在“营养上的统一性”,细胞化学元素组成：,主要元素：碳、氢、氧、氮、磷、
2、硫、钾、镁、钙、铁等；微量元素：锌、锰、钠、氯、钼、硒、钴、铜、钨、镍、硼等。,4.1 培养基的类型,4.1.1按成份不同划分,1)天然培养基(complex medium),以化学成分还不清楚或化学成分不恒定的天然有机物组成,2)合成培养基(synthetic medium),是由化学成份完全了解的物质配制而成的培养基，也称化学限定培养基(chemically defined medium),3)半合成培养基(semi-synthetic medium),多数培养基配制是采用一部分天然有机物作碳源、氮源和生长因子的来源，再适当加入一些化学药品以补充无机盐成分，使其更能充分满足微生物对营养的需
3、要。,4.1.2根据物理状态划分,固体培养基；半固体培养基；液体培养基；,4.1.3按用途划分,1）基础培养基(minimum medium),在一定条件下含有某种微生物生长繁殖所需的基本营养物质的培养基，也称为基本培养基。,牛肉膏蛋白胨培养基就是枯草芽孢杆菌等的完全培养基,2）完全培养基(complete medium),在一定条件下含有某种微生物生长繁殖所需的所有营养物质的培养基,3）加富培养基和富集培养基(enrichment medium),在普通培养基（如肉汤蛋白胨培养基）中加入某些特殊营养物质制成的一类营养丰富的培养基称加富培养基。这些特殊营养物质包括血液、血清、酵母浸膏、动植物组
4、织液等。用来培养营养要求比较苛刻的异养型微生物，如培养百日咳博德氏菌(Bordetella pertussis)需要含有血液的加富培养基。,根据待分离微生物的特点设计的培养基，用于从环境中富集和分离某种微生物称富集培养基。（目的微生物在这种培养基中较其他微生物生长速度快，并逐渐富集而占优势，从而容易达到分离该种微生物的目的。）,4）鉴别培养基(differential medium),5）选择培养基(selective medium),用于鉴别不同类型微生物的培养基特定的化学反应，产生明显的特征性变化，根据这种特征性变化,可将该种微生物与其他微生物区分开来。,用于将某种或某类微生物从混杂的微生
5、物群体中分离出来的培养基根据不同种类微生物的特殊营养需求或对某种化学物质的敏感性不同，在培养基中加入相应的特殊营养物质或化学物质，抑制不需要的微生物的生长，有利于所需微生物的生长。,4）鉴别培养基(differential medium),伊红和美蓝二种苯胺染料可抑制G+细菌和一些难培养的G细菌。在低酸度时，这二种染料结合形成沉淀，起着产酸指示剂的作用。试样中的多种肠道菌会在EMB培养基上产生相互易区分的特征菌落，因而易于辨。例如大肠杆菌强烈分解乳糖而产生大量的混合酸，菌体呈酸性，菌落被染成深紫色，从菌落表面的反射光中还可看到绿色金属闪光。,5）选择培养基(selective medium),
6、5）选择培养基(selective medium),4.1.4 按在发酵过程中的地位来分,1)孢子培养基,营养要求不要太高,所用无机盐浓度要适量,要注意培养基的pH和湿度,2.种子培养基中各种营养物质的浓度不必太高。供孢子发芽生长用的种子培养基，可添加一些易被吸收利用的碳源和氮源。,2)种子培养基,1.必须有较完全和丰富的营养物质，特别需要充足的氮源和生长因子。,3.种子培养基成分还应考虑与发酵培养基的主要成分相近。,3)发酵培养基,培养基能够满足产物最经济的合成,发酵后所形成的副产物尽可能的少,资源丰富,价格低廉,性能稳定,便于采购运输,适于规模储藏,最好本地生产,能满足生产工艺要求,4.2
7、 微生物的营养类型,异养型生物,自养型生物,生长所需要的营养物质,生物生长过程中能量的来源,光能营养型,化能营养型,光能自养型：以光为能源，不依赖任何有机物即可正常生长光能异养型：以光为能源，但生长需要一定的有机营养化能自养型：以无机物的氧化获得能量，生长不依赖有机营养物化能异养型：以有机物的氧化获得能量，生长依赖于有机营养物质,微生物营养类型(),微生物的营养类型(),1光能无机自养型（光能自养型）,能以CO2为主要唯一或主要碳源；,进行光合作用获取生长所需要的能量；,以无机物如H2、H2S、S等作为供氢体或电子供体，使CO2还原为细胞物质；,例如，藻类及蓝细菌等和植物一样，以水为电子供体（
8、供氢体），进行产氧型的光合作用，合成细胞物质。而红硫细菌，以H2S为电子供体，产生细胞物质，并伴随硫元素的产生。,CO2+2H2S,光能,光合色素,CH2O+2S+H2O,2光能有机异养型（光能异养型）,不能以CO2为主要或唯一的碳源；,以有机物作为供氢体，利用光能将CO2还原为细胞物质；,在生长时大多数需要外源的生长因子；,例如，红螺菌属中的一些细菌能利用异丙醇作为供氢体，将CO2还原成细胞物质，同时积累丙酮。,CHOH+CO2,H3C,H3C,2,光能,光合色素,2 CH3C0CH3+CH2O+H2O,光能无机自养型和光能有机异养型微生物可利用光能生长，在地球早期生态环境的演化过程中起重要
9、作用。,3化能无机自养型（化能自养型）,生长所需要的能量来自无机物氧化过程中放出的化学能；,以CO2或碳酸盐作为唯一或主要碳源进行生长时，利用H2、H2S、Fe2+、NH3或NO2-等作为电子供体使CO2还原成细胞物质。,化能无机自养型只存在于微生物中，可在完全无机及无光的环境中生长。它们广泛分布于土壤及水环境中,参与地球物质循环；,4化能有机异养型（化能异养型）,生长所需要的能量均来自有机物氧化过程中放出的化学能；,生长所需要的碳源主要是一些有机化合物，如淀粉、糖类、纤维素、有机酸等。,有机物通常既是碳源也是能源；,大多数细菌、真菌、原生动物都是化能有机异养型微生物；,所有致病微生物均为化能
10、有机异养型微生物；,4化能有机异养型（化能异养型）,腐生型(metatrophy)：,可利用无生命的有机物(如动植物尸体和残体)作为碳源；,寄生型(paratrophy)：,寄生在活的寄主机体内吸取营养物质,离开寄主就不能生存；,在腐生型和寄生型之间还存在中间类型：兼性腐生型(facultive metatrophy)；兼性寄生型(facultive paratrophy)；,不同营养类型之间的界限并非绝对：,异养型微生物并非绝对不能利用CO2；,自养型微生物也并非不能利用有机物进行生长；,有些微生物在不同生长条件下生长时,其营养类型也会发生改变；,例如紫色非硫细菌(purple nonsul
11、phur bacteria)：没有有机物时，同化CO2，为自养型微生物；有机物存在时，利用有机物进行生长，为异养型微生物；光照和厌氧条件下，利用光能生长，为光能营养型微生物；黑暗与好氧条件下，依靠有机物氧化产生的化学能生长，为化能营养型微生物；,微生物营养类型的可变性无疑有利于提高其对环境条件变化的适应能力,5营养缺陷型,某些菌株发生突变(自然突变或人工诱变)后，失去合成某种(或某些)对该菌株生长必不可少的物质(通常是生长因子如氨基酸、维生素)的能力，必须从外界环境获得该物质才能生长繁殖，这种突变型菌株称为营养缺陷型(auxotroph)，相应的野生型菌株称为原养型(prototroph)。营
12、养缺陷型菌株经常用来进行微生物遗传学方面的研究。,微生物生长需要的生长因子与营养缺陷型之间的关系？,4.3 培养基的营养成分,培养基几乎是一切对微生物进行研究和利用工作的基础,培养基（medium）是人工配制的，适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质。,任何培养基都应该具备微生物生长所需要六大营养要素：,碳源、氮源、无机盐、能源、生长因子、水,任何培养基一旦配成，必须立即进行灭菌处理；,常规高压蒸汽灭菌：1.05kg/cm2,121.315-30分钟；0.56kg/cm2,112.615-30分钟某些成分进行分别灭菌；过滤除菌；,微生物与动植物营养要素的比较,4.3.1 碳源,构成菌体成分
13、的重要元素，,产生各种代谢产物和细胞内贮藏物质的主要原料,同时又是化能异养型微生物的能量来源。,碳源种类,糖：,单糖中的己糖，,寡糖中的蔗糖、麦芽糖、棉子糖，,多糖中的淀粉、纤维素、半纤维素、甲壳质和果胶质等，其中淀粉是大多数微生物都能利用的碳源。,有机酸,如糖酸、柠檬酸、反丁烯二酸、琥珀酸、苹果酸、丙酮酸、酒石酸等,醇类,甘露醇、甘油、低浓度的乙醇,脂肪酸,如甲酸、乙酸、丙酸、丁酸等低级脂肪酸都可用作碳源。油酸和亚油酸等高级脂肪酸可被不少放线菌和真菌作为碳源和能源利用，低浓度的高级脂肪酸可刺激细菌生长，但浓度较高时往往有毒害作用。,正烷烃,一般是指从石油裂得到的14C至18C的直链烷烃混合物
14、,4.3.2 氮源,氮是构成微生物细胞蛋白质和核酸的主要元素，而蛋白质和核酸是微生物原生质的主要组成部分,氮素一般不提供能量，但硝化细菌却能利用氨作为氮源和能源,就某一类微生物而言，由于其合成能力的差异，对氮营养的需要也有很大区别,氮源可分为无机氮和有机氮,有机氮源：,花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母膏、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟等,有机氮源特点：含有丰富的蛋白质、多肽和游离的氨基酸还含有少量的糖类、脂肪、无机盐、维生素及生长因子,无机氮源,铵盐、硝酸盐、氨水等,微生物对其吸收利用比有机物快，所以也称速效氮。,利用无机氮时应注意引起的pH变化,4.3.3
15、水,（1）水是良好的溶剂，菌体所需要的营养物质都是溶解于水中被吸收的。（2）渗透、分泌、排泄等作用都是以水为媒介的；（3）水直接参与代谢作用中的许多反应。所以，水在生物化学反应中占有极为重要的地位。（4）水的比热高，能有效地吸收代谢过程中所放出的热，使细胞内温度不致骤然上升。（5）水是热的良导体，有利于放热，可调节细胞的温度,4.3.4 微量元素(无机盐类),无机盐类是微生物生命活动所不可缺少的物质。主要功用是：构成菌体成分作为酶活性基的组成部分或维持酶的活性调节渗透压、pH值、氧化还原电位等作为自养菌的能源。,无机元素包括主要元素(又称大量元素)和微量元素两类，这是依据微生物对它们需要量的大
16、小划分的。主要元素有P、S、Mg、K、Ca等；微量元素有Fe、Cu、Mn、Zn、Mo、Co、B等。当盐浓度太高时，对微生物生长有抑制作用，而在较低浓度时却能刺激生长。一般在复合培养基中由于加入许多动植物原料等都含有微量元素。,4.3.5 生长因子,前体,产物促进剂和抑制剂,1)生长因子,微生物生长不可缺少的微量有机物,如氨基酸,嘌呤,嘧啶,维生素等,培养基的有机氮源中含有丰富的生长因子,一般不需要另外单独添加,如玉米浆,2)前体,微生物生物合成过程中直接接入到产物分子中去而没有发生结构变化的一类物质,能较大提高产物产量,3)抑制剂与产物促进剂,促进剂:微生物生长所非必需的,且非前体,但能提高产
17、量的添加剂,抑制剂:加入培养基后能抑制产品生成的物质,如基因表达的负向调控中与阻遏蛋白结合的小分子物质,4.4 选用和设计培养基的原则和方法,在微生物学研究和生长实践中，配置合适的培养基是一项最基本的要求。,1、选择适宜的营养物质2、营养物的浓度及配比合适3、物理、化学条件适宜4、经济节约5、培养基的优化,大规模发酵的培养基应具有以下共同特点：,1、能够满足产物最经济的合成；2、发酵后所形成的副产物尽可能少；3、原材料应因地制宜、价格低廉、性能稳定、资源丰富、便于采购运输，适合大规模储藏，能保证生产上的供应；4、能满足总体工艺的要求。,4.4.1、选择适宜的营养物质,培养不同的微生物必须采用不
18、同的培养条件；培养目的不同，原料的选择和配比不同；,实验室的常用培养基：细菌：牛肉膏蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基）；放线菌：高氏1号合成培养基培养；酵母菌：麦芽汁培养基；霉菌：查氏合成培养基；,实验室一般培养：普通常用培养基；遗传研究：成分清楚的合成培养基；生理、代谢研究：选用相应的培养基配方；,例如枯草芽孢杆菌：一般培养：肉汤培养基或LB培养基；自然转化：基础培养基；观察芽孢：生孢子培养基；产蛋白酶：以玉米粉、黄豆饼粉为主的产酶培养基；,4.4.2、营养物质浓度及配比合适,营养物质的浓度适宜；营养物质之间的配比适宜；,高浓度糖类物质、无机盐、重金属离子等不仅不能维持和促进微生物的生长，
19、反而起到抑制或杀菌作用。,培养基中各营养物质之间的浓度配比也直接影响微生物的生长繁殖和(或)代谢产物的形成和积累，其中碳氮比(C/N)的影响较大。,发酵生产谷氨酸时：碳氮比为4/1时，菌体大量繁殖，谷氨酸积累少；碳氮比为3/1时，菌体繁殖受到抑制，谷氨酸产量则大量增加。,4.4.3、物理化学条件适宜,pH；水活度；氧化还原电位；,3、物理化学条件适宜,1）pH,培养基的pH必须控制在一定的范围内，以满足不同类型微生物的生长繁殖或产生代谢产物。,通常培养条件：细菌与放线菌：pH77.5酵母菌和霉菌：pH4.56范围内生长,为了维持培养基pH的相对恒定，通常在培养基中加入pH缓冲剂，或在进行工业发
20、酵时补加酸、碱。,2）水活度,在天然环境中，微生物可实际利用的自由水或游离水的含量，一般用在一定的温度和压力条件下,溶液的蒸汽压力与同样条件下纯水蒸汽压力之比表示，即：,式中Pw代表溶液蒸汽压力,POw代表纯水蒸汽压力。纯水w为1.00,溶液中溶质越多,w越小。,微生物一般在w为0.600.99的条件下生长,w过低时,微生物生长的迟缓期延长,比生长速率和总生长量减少。微生物不同，其生长的最适w不同。,2）水活度,3）氧化还原电位,氧化还原电位又称氧化还原电势（redox potential），是度量某氧化还原系统中的还原剂释放电子或氧化剂接受电子趋势的一种指标，其单位是V（伏）或mV（毫伏）。
21、,就跟微生物与pH的关系一样，不同类型微生物生长对氧化还原电位()的要求不同,好氧性微生物：+0.1伏以上时可正常生长,以+0.3+0.4伏为宜；厌氧性微生物：低于+0.1伏条件下生长；兼性厌氧微生物：+0.1伏以上时进行好氧呼吸,+0.1伏以下时进行发酵。,3）氧化还原电位,氧化还原电位与氧分压和pH有关,也受某些微生物代谢产物的影响,增加通气量(如振荡培养、搅拌)提高培养基的氧分压，或加入氧化剂，从而增加值；在培养基中加入抗坏血酸（0.1%）、硫化氢(0.025%)、半胱氨酸(0.05%)、谷胱甘肽、二硫苏糖醇、庖肉等还原性物质可降低值。,培养基中加入氧化还原指示剂刃天青可对氧化还原电位进
22、行间接测定,3）氧化还原电位,氧化还原电位与氧分压和pH有关,也受某些微生物代谢产物的影响,4.4.4、经济节约,配制培养基时应尽量利用廉价且易于获得的原料作为培养基成份,特别是在发酵工业中,以降低生产成本。,以粗代精,对微生物来说，各种粗原料营养更加完全，效果更好。而且在经济上也节约。,以野生植物原料代替栽培植物原料，如木薯、橡子、薯芋等都是富含淀粉质的野生植物，可以部分取代粮食用于工业发酵的碳源。,以“野”代“家”,以石油或天然气副产品代替糖质原料来培养微生物。生产石油蛋白将石油产品转化成一些产值更高的高级醇、脂肪酸、环烷酸等化工产品和若干合成物；对石油产品的品质进行改良，如脱硫、脱蜡等。
23、,以烃代粮,以废代好,以工农业生产中易污染环境的废弃物作为培养微生物的原料。例如，糖蜜(制糖工业中含有蔗糖的废液)、乳清(乳制品工业中含有乳糖的废液)、豆制品工业废液及黑废液(造纸工业中含有戊糖和己糖的亚硫酸纸浆)等都可作为培养基的原料。工业上的甲烷发酵主要利用废水、废渣作原料,在我国农村，已推广利用粪便及禾草为原料发酵生产甲烷作为燃料。另外,大量的农副产品或制品，如麸皮、米糠、玉米浆、酵母浸膏、酒糟、豆饼、花生饼、蛋白胨等都是常用的发酵工业原料。,某制药厂改进链霉素发酵液中的原有配方，设法减去30-50%的黄豆饼粉、25%的葡萄糖和20%硫酸铵，结果反而提高了产量。,以简代繁,开发利用纤维素
24、这种纤维素农副产品转变为优质饲料、工业发酵原料、燃料及人类的食品及饮料。,以大气氮、铵盐、硝酸盐或尿素等一类非蛋白质或非氨基酸廉价原料用作发酵培养基的原料，让微生物转化成菌体蛋白质或含氮的发酵产物供人们利用。,以无机氮代蛋白,以纤代糖,4.4.5 培养基的优化,进行生态模拟，研究某种微生物的培养条件；文献查阅，设计特定微生物的培养基配方；单因子试验,确定较好的培养基组成及浓度;运用统计学方法进行试验设计，确定特定微生物的最佳培养条件；,培养基优化的一般过程:,培养基优劣的初步评定标准转化率,理论转化率,实际转化率,培养基优劣的最终评定标准单位产品的成本,实验设计,正交试验设计,响应面分析法,见教材p112,本章习题,1、常用的培养基都必须符合哪些基本条件？2、适宜于大规模发酵的培养基应该具有哪些共同特点？3、培养基按用途分有哪几种？对各种培养基的要求怎样？4、培养基的营养成分有哪些？在考虑菌种对培养基的总体设计时，在成分选择时应注意哪几个方面？,
