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1、实 验 三,微生物培养基的配制和灭菌,微生物培养基的配制和灭菌,目的要求实验材料实验程序,目 的 要 求,了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程。了解几种灭菌方法，掌握干热灭菌法和加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。熟悉分离、培养微生物前的有关准备工作及操作方法。,实 验 材 料,药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、马铃薯、蔗糖；可溶性淀粉、K2HPO4、KNO3、MgSO47H2O、FeSO47H2O等。高压蒸汽灭菌器、恒温干热灭菌箱、细菌过滤器、紫外线杀菌灯。其它：天平、牛角匙、电炉、1N HCl、1N NaOH、pH试纸、刻度搪瓷杯、量筒、漏斗、漏斗架、玻棒、带玻璃珠的三角瓶、带棉塞的
2、无菌试管、无棉塞的空试管、培养皿、吸管、各种包装纸、防水纸、绳索、棉花、标签等。,实 验 程 序,培养基的配制分离培养微生物常用器皿的准备培养基和玻璃器材的灭菌方法,实 验 程 序1（培养基的配制）,培养基的种类培养基的配制方法和步骤三种培养基的配方及配制无菌水的制备,实 验 程 序2（培养基的种类）,据组成成分可分为:1.合成培养基：由各种纯化学物质按一定比例配制而成。2.半合成培养基：有一部分纯化学物质和另一部分天然物质配制而成。3.天然培养基：利用天然来源的有机物配制而成。从培养基的物理状态可分为 1.液体培养基：不加凝固剂的液体状态培养基。2.固体培养基：在液体培养基中加入2%左右的凝
3、固剂的固体状态的培养基或农副产品培养基。3.半固体培养基：在液体培养基中加入0.20.5%凝固剂而成的半固体状培养基。,实 验 程 序3（培养基的种类）,常用凝固剂为琼脂（其次为明胶），又叫洋菜、冻粉。,实 验 程 序4（培养基的配制方法和步骤）,称量：按照配方正确称取各种原料放于搪瓷杯中。溶化：在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解。调pH值：用1N NaOH或1N HCl调pH，用pH试纸对照。加琼脂溶化：加热过程中要不断搅拌，可适当补水。分装：注意不要污染棉塞。包扎成捆，挂上标签（必须用铅笔写），注明何种培养基。灭菌备用：培养基灭菌后必须在370C下恒温培养24h，确定无菌生长，方可
4、使用。,实 验 程 序5（培养基的配制方法和步骤）,实验程序6（培养基的配制方法和步骤）,实 验 程 序7（三种培养基的配方及配制）,牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（用于分离和培养细菌，是一种天然培养基）配方如下：牛肉膏 3g 蛋白胨 5g 氯化钠 3g 琼脂 20g 自来水 1000mL pH 7.27.4 灭菌 1.05kg/cm2，2530min,实 验 程 序8（三种培养基的配方及配制）,马铃薯（或豆芽汁）蔗糖（或葡萄糖）琼脂培养基（用于分离和培养真菌之用，是一种半合成培养基），其配方如下：去皮马铃薯（或鲜豆芽）200g 蔗糖（或葡萄糖）20g 自来水 1000mL 琼脂 20g pH 自然
5、灭菌：（含蔗糖）1.05kg/cm2 20min（含葡萄糖）0.1kg/cm2 30min,实 验 程 序9（三种培养基的配方及配制）,淀粉琼脂培养基（高氏一号Gause1），用于分离和培养放线菌，是一种合成培养基。配方如下：可溶性淀粉 20.0g KNO3 1.0g K2HPO4 0.5g MgSO4 7H2O 0.5g NaCl 0.5g FeSO4 7H2O 0.01g 琼脂 20g 自来水 1000mL 灭菌：1.05kg/cm2 30min,实验程序10（三种培养基的配方及配制）,无菌水的制备 无菌水为下一次微生物分离实验中所需要的材料。100mL三角烧瓶（装有玻璃珠），装自来水45
6、.0mL，试管中装9.0mL自来水，塞上棉塞，包扎、灭菌备用。三角烧瓶和试管须预先塞好棉塞，并经干热灭菌。,实验程序11（分离培养微生物常用器皿的准备）,清洗一些玻璃仪器：如三角烧瓶、试管、培养皿、吸管等。棉塞的制作 包装培养皿和吸管等。,实验程序12（培养基和玻璃器材的灭菌方法）,干热灭菌法：电热烘箱作为干热灭菌器加压蒸汽灭菌法 其步骤如下：1.灭菌器内加入一定量的水，将用防水纸包扎好的物品放入其中。2.接通电源，进行加热。3.排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待排出大气后关闭排气阀；或关闭排气阀，待压力上升到0.5kg/cm2时再打开排气阀，待压力回复到0时再关闭排气阀。4.当压力达1
7、5bl/in2（即1.05kg/cm2）时，此时灭菌器内的温度为1210C，维持30min。对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物时，应适当降低压力，延长时间。5.灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时，才能打开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品。,实 验 程 序13,实 验 程 序14,实验程序15（培养基和玻璃器材的灭菌方法）,间歇灭菌法：待灭菌的物品放在灭菌器或蒸笼里，每天蒸煮1次，每次煮沸1h，连续3d重复进行。在每两次蒸煮之间，将物品（指培养基）放在370C恒温条件下培养过夜，这样可以使每次蒸煮后未杀死残留的芽孢萌发成营养体，以便下次蒸煮时杀灭。过滤除菌法：不能用加热灭菌的液体物
8、质（如维生素、血清），一般可用细菌过滤器进行除菌。（教师示范）,实验程序16（培养基和玻璃器材的灭菌方法）,实验程序17（培养基和玻璃器材的灭菌方法）,紫外线灭菌法：一般30W灯管，9m3空间，距地面2m每次打开紫外线照射0.5h，就使室内空气灭菌。若照射紫外线时先喷洒石炭酸等化学消毒剂，可增强灭菌效果。紫外线虽有较强的杀菌力，但穿透力弱，即使一薄层玻璃或水层就能将大部分紫外线滤除，因此只适用于空气及表面杀菌。化学药剂消毒灭菌：微生物实验室中常用的化学杀菌剂有升汞、甲醛、高锰酸钾、酒精、碘酒、龙胆紫、石炭酸、漂白粉、新洁尔灭、煤酚皂溶液，它们有的是杀菌剂，有的是抑菌剂，详见表64。,实验程序18（培养基和玻璃器材的灭菌方法）,思考题,固体培养基加琼脂后加热溶化时要注意哪些问题？培养基中加琼脂的作用是什么？干热灭菌、高压蒸汽灭菌和间歇灭菌的场合有何不同？如何检查培养基灭菌是否彻底？,实 验 三,结 束,
