《基因工程一轮复习公开课.ppt.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《基因工程一轮复习公开课.ppt.ppt（46页珍藏版）》请在三一办公上搜索。
1、11、1.2DNA重组技术的基本工具 基因工程的基本操作程序,（一轮复习课）2011、1、7,(1)基因工程的诞生（A级要求）(2)基因工程的原理和技术(A级要求）(3)基因工程的应用(B级要求）(4)蛋白质工程(A级要求）,考纲要求：,基因工程的概念,基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。,优点：定向改造生物体的性状（目的性强）育种周期短，克服远缘杂交不亲和障碍,原理：基因重组,为什么基因工程能够成功呢？,基因拼接的理论基础：规则的双螺旋结构 基本单位都是脱氧核苷酸 遵循碱基互补配对
2、原则外源基因在受体内表达的理论基础：生物界共用一套遗传密码,DNA重组技术的基本工具,限制性核酸内切酶“分子手术刀”DNA连接酶“分子缝合针”基因进入受体细胞的载体“分子运输车”,限制性核酸内切酶“分子手术刀”,分布：主要在原核生物中作用特点：特异性，即识别特定核苷酸序列，切割特定切点切点：磷酸二酯键举例：EcoRI限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开（黏性末端）SmaI限制酶能识别GGGCCC序列，并在G和C之间切开（平末端）,限制酶所识别的序列有什么特点,限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。
3、,限制性内切酶,EcoRI限制酶,限制酶在原核生物中的作用,限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中不具备这种限制酶的识别序列,DNA连接酶,常用的DNA连接酶：,DNA连接酶与DNA聚合酶的比较,基因的载体“分子运输车”,载体的作用：1、将外源基因转移到受体细胞中去。2、利用运载体在受体细胞内，对外源基因进行大量复制。,常用的载体有：质粒，噬菌体的衍生物，动植物病毒等,质粒,质粒是基因工程最常用的运载体，它广泛地存在于细菌中，是细菌染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子，大小只有普通细菌拟核DNA的百分之一。,要对天
4、然质粒进行人工改造,1、能够在宿主细胞中复制并稳定地保存；2、具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接；3、具有某些标记基因，便于进行筛选。（如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等）4、对受体细胞无害,作为载体必须具备哪些条件？,原核细胞的基因结构(补充内容）,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,不编码蛋白质。,：编码蛋白质,连续不间断,编码区,非编码区,原核细胞的 基因结构,调控遗传信息表达,上 游有启动子，下游有终止子,启动子,真核细胞的基因结构（补充内容）,编码区,与RNA聚合酶结合位点,内含子,外显子,启动子,终止子,编码区上
5、游,编码区下游,真核细胞的 基因结构,编码区,非编码区,外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列,：有调控作用,上游有启动子，下游有终止子,非编码序列：,包括非编码区和内含子,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,连续,不连续,编码区,非编码,基因工程的基本操作程序,一、目的基因的获取,1、目的基因主要是指_,编码蛋白质的结构基因,请举出三个以上的例子,2、获取目的基因的常用方法,（1）从基因文库中获取,（2）人工合成,（3）利用PCR技术扩增目的基因,什么是基因文库？什么是基因组文库？什么是部分基因文库？怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？目的基因的有关信息与什么相联系？,(1
6、)从基因文库中获取目的基因,概念：基因文库（gene library）,将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库(gene library),基因组文库:基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库.部分基因文库:基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库.,基因组文库与部分基因文库的关系,基因组DNA文库与cDNA文库的比较,（2）利用PCR技术扩增目的基因,PCR聚合酶链式反应 是一项生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过此技术，可获取大量的目的基因。,PCR技术,
7、原理：前提：原料方式,PCR扩增仪,DNA复制,一段已知目的基因的核苷酸序列,：以_方式扩增，即_（n为扩增循环的次数）,指数,2n,模板DNA；DNA引物；四种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；离子,过程,变性、退火、延伸三步曲,变性：加热至9095双链DNA解链成为单链DNA退火：冷却至5560部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合延伸：加热至7075以目的基因为模板，合成互补的新DNA链,(3)PCR技术与DNA复制的比较,二、基因表达载体的构建核心,（1）用一定的_切割质粒，使其出现一个切口，露出_。（2）用_切断目 的基因，使其产生_ _。,（3）将切下的目的
8、基因片段插入质粒的_处，再加入适量_，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,的黏性末端,切口,DNA连接酶,相同,1.过程:,质粒,目的基因,限制酶处理,一个切口两个黏性末端,两个切口获得目的基因,DNA连接酶,表达载体,同一种,1.过程:,a、使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代,b、同时使目的基因能表达和发挥作用,思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？,不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：（1）生物之间进行基因交流，只有使
9、用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；（3）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（4）为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；（5）有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。,3.基因表达载体的组成：,它们有什么作用？,a、目的基因,b、启动子,c、终止子,d、标记基因,位于基因的首端,是RNA聚合酶结合位点,位于基因的末端,终止转录,检测目的基因是否导入受体
10、细胞,常用的受体细胞：,有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。,将目的基因导入受体细胞的原理,借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,三、将目的基因导入受体细胞,1、将目的基因导入植物细胞,（1）农杆菌转化法,特点:,能感染双子叶植物和祼子植物,对单子叶植物无感染能力,Ti质粒的TDNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上,转化过程:,Ti质粒目的基因,构建,表达载体,植物细胞,植物细胞染色DNA,新性状,农杆菌,（2）基因枪法,基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。,（3）花粉通道法,植物
11、花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。,2、将目的基因导入动物细胞,方法:,显微注射技术,操作程序:,提纯含目的基因表达载体,取受精卵,显微注射,移植到子宫,受精卵发育,新性状动物,3、将目的基因导入微生物细胞,常用法：Ca2+处理,常用菌：大肠杆菌,微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,过程：,Ca2+处理大肠杆菌,感受态细胞,表达载体与感受态细胞混合,感受态细胞吸收DNA,将目的基因导入受体细胞,(四)目的基因的检测与鉴定,导入检测：目的基因是否导入受体细胞,检测,表达检测,方法,转录检测分子杂交,翻译检测抗原抗体杂交,DNA分子杂交,分子检测法,鉴定,抗虫鉴定抗病鉴定活性鉴定等,个体水平的鉴定,知识延伸DNA分子杂交技术,该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链DNA解开，把单股的DNA小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的DNA中的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的DNA或基因。,返 回,
