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1、迪诺肿瘤个体化治疗基因检测 教程 v01.1,内部资料 版权所有,编者注：,此件为江苏迪诺肿瘤医学转化基地培训专用教材，主编 赖仁胜。为中国健康促进基金会医学生物技术转化专项基金培训迪诺技术人员所用，内涵保密内容已由双方签署文件所规定，并由知识产权注册保护。未经允许不得外泄和传播 2010.08-18,教程目录,第一章 病理常规操作第二章 样本前处理（申请单填写、标本类型、标本评估及登记等）第三章 样本预处理（DNA、RNA提取及质量评估）第四章 基因操作（测序、片段分析及Q-PCR）第五章 结果解读及诊断报告出具第六章 资料汇总，资料库建立,第一章 病理常规操作,1.病理样本的接收2.组织固
2、定3.取材4.包埋5.组织石蜡切片6.HE染色,1.病理样本的接收,1首先核对病理申请单与标本上的红色号码是否一致。2核查病理申请单上写明的送检标本及数目是否与实际送检标本一致。3观察送检标本的大小及固定液比例是否合适。(1)穿刺活检及纤支镜所取的小标本，4中性甲醛(10中性福尔马林)固定组织的量应在610倍。(2)对于较大的手术切除标本，应及时切开固定；核对后将病理申请单和标本编上病理标本号。4将病人姓名、性别、年龄、病历号、科别、临床诊断、部位、标本来源、标本例数等逐项录入电脑存储。5作为病理资料不仅要做好计算机录入工作，还须进行文字登记，以便病理档案长期保存。,2.组织固定,临床医师切取
3、标本后，应尽快将标本置于盛有足够量固定液的容器内，尽量避免可能出现固定不及时或不充分导致标本干涸或腐败，无法进行切片制作。添加的量应610倍于标本体积.,3.取材及其后期处理,病理科病理医生取材核对标本及其标志与申请单是否一致。按照病理取材规范选取病变及正常组织。对送检标本进行大体描述。取材后的标本保存至少两周。放入自动脱水机进行水洗脱水透明浸蜡前处理。,4.包埋,先将熔化的石蜡倾入模具，再用加热的镊子夹取已经浸蜡的组织块，注意：特定的制定面或最下面向下埋入熔蜡。注意标本的编号和标本要对准，防止污染。为下一步切片准备，提供介质。,5.切片,刀片锋利，组织块预冷。切5-10um的连续组织切片，置
4、于玻片上。捞片，烘干。,6.HE染色,苏木素伊红染色。苏木素染细胞核（核酸），伊红染细胞质（蛋白），使组织细胞对比清晰，便于显微镜下观察。主要流程：二甲苯脱蜡梯度酒精脱二甲苯苏木素染色分化、返蓝伊红梯度酒精、二甲苯封片。,临床技术操作规范病理学分册 2004年第1版,第二章 标本前处理,一、申请单填写1、登记患者基本情况，包括姓名、性别、年龄、送检单位、床位、门诊号/住院号、送检日期、取材部位、病理诊断、标本病理号等2、患者签署知情同意书，留下联系方式3、患者病史及临床情况,患者病史及临床情况登记事项,有无手术（穿刺标本）手术时间 术前术后有无化疗，化疗方案及化疗效果及毒副作用（相关血项指标、
5、胃肠反应、皮肤反应、神经反应等），治疗的单位。癌症有无转移，复发或者不能切除相关病史及家族史,送检标本种类：,外周全血；胸腹水；痰；尿新鲜(冰冻)标本；内镜活检标本；手术标本蜡块或切片,新鲜标本用10%中性福尔马林固定或用RNAlater浸泡20分钟以上（常温可保存10天）外借病理蜡块，常规病理大小即可常规石蜡切片（10张白片），5-10um，常温送检,送检标本要求：,样本评估,血：保存温度、时间，是否凝固胸腹水、尿及痰：涂片HE染色观察结果是否有癌细胞蜡块或白片：组织保存时间、福尔马林固定时间、组织大小、有无癌细胞,将申请单登记入册,登记基因检测申请号、姓名、送检单位、病理号、检测项目,肿瘤
6、个体化治疗基因检测项目,肿瘤个体化治疗基因检测项目,肿瘤个体化治疗基因检测项目,肿瘤个体化治疗基因检测项目,石蜡白片前处理1.烤片（90-95，0.5小时）2.脱蜡（过夜，最后一缸换新二甲苯）3.HE染色4.镜下区分选择肿瘤组织4.刮片5.消化肿瘤组织（200lTL+20lOB酶，552-3h消化时间视具体情况定）,第三章 基因检测前处理,HE染色结果,DNA的提取,1.血DNA的提取2.石蜡组织DNA的提取,血液DNA提取,250l抗凝血加入250l Buffer BL和25l OB酶，70孵育15分钟。加入260l无水乙醇震荡混合约20秒。取上清转入收集柱中，12000rpm离心2分钟。将
7、收集柱置一新收集管上，加入500l HB solution，12000rpm离心2分钟。加入700l wash Buffer，12000rpm离心2分钟。空甩离心，12000rpm2分钟。将收集柱置一新1.5ml离心管上，加入50l 70预热的洗脱液，静置5分钟，12000rpm离心4分钟洗脱，即为DNA模板。琼脂糖电泳检测提取DNA质量（或用分光光度计定量并记录）。,Omega Blood DNA kit protocol,石蜡DNA提取,在消化充分的组织中加入220l BUffer BL，震荡混合，于70孵育。加入220l无水乙醇震荡混合约20秒。取上清转入收集柱中，12000rpm离心2
8、分钟。将收集柱置一新收集管上，加入500l HB solution，12000rpm离心2分钟。加入700l wash Buffer，12000rpm离心2分钟。空甩离心，12000rpm2分钟。将收集柱置一新1.5ml离心管上，加入50l70预热的洗脱液，静置5分钟，12000rpm离心4分钟洗脱，即为DNA模板。琼脂糖电泳检测提取DNA质量（或用分光光度计定量并记录）。,Omega Tissuse DNA kit protocol,电泳图,RNA的提取,1.石蜡组织RNA的提取2.血RNA的提取（化疗后需1200微升血白细胞太少）,1.石蜡组织RNA的提取,RNAlater样本处理另注加入
9、40lbufferPKD和10l的蛋白酶K,涡旋混匀后，55C孵育2-3h，80C15min。然后加入500l的bufferRBC，充分混匀。将溶液转入gDNA Eliminator spin柱内，10000g离心30s，吸取收集管内液体至新的离心管，重复操作直至溶液都过滤收集柱。在溶液内加入1200l无水乙醇，混匀，将溶液转入RNeasy MinElute spin柱内，10000g离心15s，弃收集管内液体。加入500l buffer RPE，10000g离心15min，弃收集管内液体。加入500l buffer RPE,10000g离心2min。小心将柱取出，放入一新的收集管内，最大速度
10、离心5min（将柱盖打开）将柱放入1.5ml收集管内，加入40-60l无Rnase酶水，盖上盖子，室温放置2min，最大速度离心1min洗脱RNA.,Qiagen RNEASY FFPE RNA kit protocol,2.血RNA的提取,300l全血+1500l 1 buffer ERL（150l 10 ERL+1350l H2O）混匀。同时做3管。冰上孵育10min，至半透明。450g 4，10min，弃上清。600l 1 buffer ERL混匀，洗涤细胞。洗涤后合并3管液体。450g 4，10min，弃上清。600l TRK裂解液+12l-巯基乙醇吹打混匀（可以暂时-70冻存）。加等
11、体积70%乙醇，吹打混匀。将液体转入HiBind RNA提取柱内（800l/次），10000g离心1min，弃收集管内液体，重复操作直至所有液体都过柱。加700l RNA wash Buffer，10000g离心1min弃收集管内液体。换新的收集管，加500l RNA wash Buffer，10000g离心1min弃收集管内液体。柱内加500l RNA wash Buffer，10000g离心1min弃收集管内液体。12000g 空柱离心2min。取一新的1.5ml离心管，在柱中央加入40l洗脱液，12000g离心1min。核酸蛋白仪检测提取RNA纯度及浓度。-70保存RNA。,Omega
12、Blood RNA kit protocol,Quantifiler数据评估提取RNA质量OD260/OD280 1.82.0:纯度好 2.1:核酸降解 1.6:蛋白质污染,第四章 基因操作,PCR扩增（以K-ras为例）,反应体系为：10buffer dNTP(2mM)Mg2+TaqGenome DNAPrimer-F（10M）Primer-R（10M）H2O,2l 2l0.75l0.25l1l0.4l0.4l13.2l,Total 20l,PCR反应条件：置PCR扩增仪中95预变性15min，用TouchdownPCR，94变性50秒，63-58退火1分钟，72延伸1分钟，共循环10次，9
13、4变性50秒，57退火1分钟，72延伸1分钟，共循环30次，最后于72延伸10分钟。,电泳图,用1.5%琼脂糖凝胶电泳观察PCR扩增产物是否为单一目的条带。,PCR产物纯化,1.加100lPCR-A液，混匀，转入纯化柱内，室温静置10min，12000rpm离心2min。2.弃收集管内液体，加700lwashing buffer，12000rpm离心2min。3.弃收集管内液体，加400lwashing buffer，12000rpm离心2min。4.弃收集管内液体，12000rpm离心2min。5.柱内加30l70C预热洗脱液，12000rpm离心2min。,测序反应（以K-ras为例）,反
14、应体系为：BigDye（2.5X）1l BigDyeSeqBuffer（5X）1.5l Primer 3lPCR纯化产物 1lddH2O 3.5lTotal 10l,测序产物纯化,1.每管加1lEDTA（125mM）;1lNaAc（3M）到管里。2.每管加100l100%酒精，震荡混匀，室温静置15min。3.10C;4000rpm离心30min，马上倒置，1200rpm离心1min。4.每管加100l70%酒精，5C;4000rpm离心30min，马上倒置，1200rpm离心1min。5.37C;30min挥发净酒精，加10l Hi-Di溶解DNA。6.95C；变性5min，4C；4min，
15、加样上机。,片段分析操作,步骤,1多重荧光PCR：15lPCRmix五种（胃肠）或七种（尿）引物0.8l（其中D17S283加1.2l）1lDNA.条件：95 C15min，94 C1min，56 C1min，72 C1min，30个cycle.lPCR产物0.4lLIZ size standard+8l HiDi,95 C 5min,4C冰冷5min。上机，分析数据。,Q-PCR操作,详细步骤,1.RT反应:gDNA1l+RNA 6l；上机42C，2min；离心。RT Buffer 2l，RT酶0.5l，Primer 0.5l；上机A64程序。2.Q-PCR仪扩增（反应体系）2SYBR 2.
16、5l Primer 1(5uM)0.5lPrimer 2(5uM)0.5lRT产物+Nuclease-free water 1.5l Total 5l,7900PCR仪反应程序,95C 10min；95C 15s；60C 1min，40cycle。RQ Manager 1.2软件分析实验数据。,第五章 结果解读及诊断报告出具,基因测序结果分析RNA表达量结果分析,测序结果图及分析,ABI3100测序仪测序，SeqScape v2.0分析结果为。以K-ras和EGFR为例,K-RAS 基因测序突变类型,K-ras:K2第12（GGT),13密码子（GGC）K3第61（GGT）密码子共9种突变类型
17、：,GGT-GAT G12DGGT-GTT G12VGGC-GAC G13DGGT-TGT G12CGGT-GCT G12AGGT-AGT G12SGGT-CGT G12R,GGC-TGC G13CGGC-GCC G13AGGC-GTC G13V,7种 98%,3种 2%,EGFR基因测序突变类型：,EGFR 第18,19,20,21外显子和第一内含子（CA）EGGR 19:容易发生缺失 EGFR 21:L858R EGFR(CA):(CA)n16，EGFR非突变NSCLC患者服用TKI类药物具有短期疗效 EGFR 20:T790M 突变会使患者对EGFR-TKI 类药物产生耐药,EGFR18测序图,EGFR19测序图,EGFR20测序图,EGFR21测序图,EGFR intron 1测序图,RNA表达量结果图及分析,使用仪器为：ABI7900荧光定量PCR仪，分析软件为：RQ Manager 1.2,ERCC1,血液,石蜡组织,BRCA1,血液,石蜡组织,RRm1,血液,石蜡组织,VEGF,血液,石蜡组织,血液,石蜡组织,TS,第六章 资料汇总，资料库建立,将申请单，诊断报告按基因申请号装订成册按申请项目汇总电子版诊断报告，详细记录病人资料，做患者后续随访纪录治疗效果。统计总数，计算突变率，统计突变类型。可做纵向质控。方便后续资料检索查阅,
