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1、5.2 红霉素Erythromycin,5.2.1 结构与理化性质结构物理性质稳定性化学性质5.2.2 生物合成红霉内酯糖最后几步PKS,5.2.3 生产工艺生产菌种发酵工艺及控制要点提取与精制,5.2.1 结构与理化性质,结构Erythromycin A活力最强。,物理性质,Molecular formula:C37H67NO13,733.93(C37H67NO13 2H2O,769.96)CAS Number:114-07-8(59319-72-1)Description:White or slightly yellow,crystalline powder.Is odorless or
2、practically odorless.pKa:Erythromycin base8.8.Solubility:,物理性质,ErythromycinSlightly soluble in water;soluble in alcohol,in chloroform,and in ether.Erythromycin EstolateSoluble in alcohol,in acetone,and in chloroform;practically insoluble in water.Erythromycin StearatePractically insoluble in water;s
3、oluble in alcohol,in chloroform,in methanol,and in ether.,物理性质,Erythromycin EthylsuccinateVery slightly soluble in water;freely soluble in alcohol,in chloroform,and in polyethylene glycol 400.Erythromycin Lactobionate for InjectionFreely soluble in water,in alcohol,and in methanol;slightly soluble i
4、n acetone and in chloroform;practically insoluble in ether.稳定性化学性质,5.2.2 生物合成,红霉内酯6-dEB糖最后几步PKS,A putative assignment of the genes in the Ery cluster,5.2.2 生物合成,红霉内酯6-DEBDEBS,eryA,DEBS,AT,acyltransferase;ACP,acyl carrier protein;KS,ketosynthase;KR,ketoreductase;DH,dehydratase;ER,enoylreductase;TE,th
5、ioesterase,The 2.7-crystal structure,Tang,Yinyan et al.(2006)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103,11124-11129,X-ray crystal structure of the KS-AT didomain from DEBS module5,Orange,N-terminal coiled coil linker domain;blue,ketosynthase(KS)domain;green,acyl transferase(AT)domain;yellow,KStoAT linker;red,post-A
6、T linker peptide.Residues 458465,which lack electron density,are manually modeled and shown in gray.(A and B)Top view.(C and D)Side view.,Tang,Yinyan et al.(2006)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103,11124-11129,Chain elongation cycle catalyzed by a minimal PKS module,Shiou-Chuan(Sheryl)Tsai,Assistant Professo
7、r,Molecular Biology&BiochemistrySchool of Biological SciencesAssistant Professor,ChemistrySchool of Physical SciencesB.S.,National Taiwan University,1990M.S.,National Taiwan University,1992Ph.D.,University of California,Berkeley,1999 http:/www.structure.uci.edu/faculty/tsai.html,eryA,糖,糖,糖,最后几步,最后几步
8、,最后几步,A putative assignment of the genes in the Ery cluster,Saccharopolyspora erythraea complete genome,PKS,(A)Modeled structure of an intact PKS module.(B)Crystal structure of porcine FAS.1.Keatinge-Clay,A.T.&Stroud,R.M.(2006)Structure(London)14,737-748.2.Maier,T.,Jenni,S.&Ban,N.(2006)Science 311,1
9、258-1263.,PKS,PKS,PKS,组合生物合成(combinatorial biosynthesis)是九十年代中期在微生物次级代谢产物生物合成基因和酶学研究基础上形成并发展而来的，通过异源表达活性产物的生物合成基因放或将不同的生物合成基因簇亚单位进行排列组合后表达，并经翻译后修饰产生与天然化合物不同但活性更好的化合物（unnatural natural products)的一门现代生物技术。,组合生物合成的发展趋势,1、寻找高效表达系统(如E.coli，放线菌，真菌，粘细菌，植物，真核等表达系统)，优化表达条件。2、根据构效关系合理设计组合生物合成的切入点。3,、组合生物合成和组合
10、化学的联合。4、扩大产生菌的来源，如海洋，极端条件等微生物。将更多的疗效广泛的化合物进行组合生物合成。6、NRPS与PKS的组合。,5.2.3 生产工艺,生产菌种发酵工艺控制要点提取与精制,5.2.3.1 生产菌种,Saccharopolyspora erythraea Streptomyces erythraeus最早在1923年被发现，命名为Actinomyces erythreus；1948年被改名为Streptomyces erythreus。,5.2.3.1生产菌种,1975年，Lacey和Goodfellow把一种从甘蔗渣中取得的放线菌科土壤丝菌属的菌Saccharopolyspo
11、ra hirsuta独立出来，成为一个新的菌属Saccharopolyspora，后来Labeda就在1987年，将原来属于Streptomyces的Streptomycrs erythraeus移到这个新的菌属，并重新命名为Saccharopolyspora erythraea，Pseudonocardiaceae科,5.2.3.1生产菌种,是具有菌丝及孢子分化的革兰氏阳性菌G+，会产生由表面多刺的孢子组成的短孢子链。产生孢子的方式是由营养气生菌丝末端开始卷曲，然后菌丝会产生隔膜，将菌丝分为几段，接着逐渐加厚隔膜成壁，最后形成孢子释放。,5.2.3.1生产菌种,在营养良好的普通培养基就能长的
12、很好，例如营养琼脂或胰胨酶水解大豆琼脂。生长特色为菌丝会扩张并深入培养基。在合成培养基上生长的菌落由淡黄色变为微带褐的红色，气生菌丝为白色，孢子丝呈不紧密的螺旋形，约35圈，孢子呈球形。,5.2.3.2 工艺流程,砂土管,孢子斜面,710天37,二级斜面,150155h60h前35，60h后33,一级种子罐,24h 31,72h36,二级种子罐,24h31,发酵罐,调pH 分层 静置 离心,加甲醛，ZnSO4 pH8.28.8,发酵液,过滤,滤液,醋酸调pH为55.5静置分层,酸化水溶液,加NaOH碱化静置分层,碱化萃取液,于-5加丙酮冷冻结晶,结晶,洗净结晶干燥,成品,5.2.3.2 工艺流
13、程,砂土管,孢子斜面,710天37,二级斜面,150155h60h前35，60h后33,一级种子罐,24h 31,72h36,二级种子罐,24h31,发酵罐,调pH 分层 静置 离心,加甲醛，ZnSO4 pH8.28.8,发酵液,过滤,滤液,醋酸调pH为55.5静置分层,酸化水溶液,加NaOH碱化静置分层,碱化萃取液,于-5加丙酮冷冻结晶,结晶,洗净结晶干燥,成品,一级种子培养基配方：豆饼粉2.5，葡萄糖3，淀粉4，蛋白胨0.5，酵母粉0.5，（NH4）2SO4 0.5，玉米浆0.2，NaCl 0.4，KH2PO40.06%，MgSO40.025%，CaCO30.6，豆油0.3，pH6.57.
14、0（灭菌后）。培养温度35，通气量：24h内1：0.6（V/V），24h至36h为1：1（V/V），36h至转罐（约72h）为1：1.5（V/V）。当培养时间在71h左右时，培养基外形较稠，挂壁，不分层，菌丝密集，表面无泡沫，pH从最低开始稍有回升（6.2左右）时，应能及时转入二级种子罐。,二级种子培养基配方为：豆饼粉2.2，葡萄糖3，淀粉3，（NH4）2SO4 0.1，玉米浆0.8，CaCO30.6，pH6.57.0。培养温度31，通气量：3h内1：1.5（V/V），3h至转罐通气量维持不变。接种量约为10，培养时间24h。二级种子在生长过程中，pH变化不大。当菌丝体长而浓、原生质开始略有收
15、缩、外形较稠、还原糖至2以下时即可转罐。,斜面培养基配方为：淀粉1，(NH4)2SO4 0.3%，玉米浆0.61.0，NaCl 0.3，CaCO3 0.25（调好pH后加入），琼脂2，pH7.07.2。37培养710天，成熟孢子呈灰带微红色，孢子层丰满，取出保存于4冰箱中。保存期不超过21天。,发酵培养基配方为：豆饼粉2.4，葡萄糖3，淀粉2.5，（NH4）2SO4 0.1，玉米浆0.3，CaCO30.6，豆油0.15（作为灭菌时消泡用），丙酸或丙醇0.6（当发酵24h、48h和72h时分别加入），pH6.57.0（灭菌后）。培养温度：60h前为35，60h后为33。通气量：从开始至8h，逐渐
16、加到1：1（V/V），8h后至转罐通气量维持不变1：1（V/V）。接种量约为1015。培养时间150155h。,在发酵过程中，红色链霉菌的代谢可分为3个时期。,菌丝繁殖时期 红霉素分泌时期 菌丝自溶期,1 菌丝繁殖时期,此期约从接种开始到30h左右，菌丝生长快，繁殖旺盛，菌丝能较迅速地利用和含氮物质；pH值较缓慢地上升，约在6.56.9之间；菌丝体密集成网状，着色较均匀。此期红霉素的产量甚微。,2 红霉素分泌时期,菌丝体生长逐渐减弱或达到平衡，着色较浅，且不太均匀；pH逐渐上升至7.2，并保持在7.27.5之间；糖继续被利用，氮处于平衡状态，红霉素产量持续上升。,3 菌丝自溶期,菌丝体逐渐衰老
17、，着色很浅且不均匀，菌丝变短无规则，最终自溶；pH上升至7.5以上，红霉素的产量逐渐下降。当发酵进入即将放罐的时期时，应恰如其分地掌握好放罐时间。放罐的指标是：pH值上升至7.8，罐压上升缓慢，培养液开始转稀，效价增长缓慢。镜检菌丝开始自溶，着色浅，且不均匀。,5.2.3.3发酵过程主要控制对象,温度溶氧pH补料前体,1 温度控制,在发酵过程中除了满足生产菌种的营养需要外，还需维持菌的适当培养条件。其中之一就是保持菌生长和合成产物所需的最适温度。因为微生物的生长和产物的合成都是在各种酶催化下进行的，温度是保证酶活性的重要条件，因此在发酵系统中必须保证稳定而合适的温度环境。,1 温度控制,在生长
18、初期抗生素还未开始合成，菌丝还未长浓，这时应优先考虑合适的生长温度。到抗生素分泌期，菌丝已长到一定浓度，这时应满足生物合成的最适温度。最适发酵温度还随菌种培养基成分、培养条件和菌体生长阶段而改变。在使用较稀薄或较易利用的培养基时，提高培养温度则养料往往过早耗竭，导致菌丝过早自溶，使抗生素产量降低。例如，提高红霉素发酵温度在玉米浆培养基中的效果就不如在黄豆粉培养基中好，因后者相对难于利用。提高温度则有利于菌对黄豆粉的同化。,2 溶解氧对发酵的影响,在好气菌发酵过程中，必须连续通入无菌空气，氧由气相溶解到液相，然后经过液流传给细胞壁进入细胞体内，以维持菌的生长代谢和产物合成。利用溶氧浓度的变化，可
19、了解产生菌对氧利用的规律，反应发酵的异常情况。在发酵过程中，如图所示，红霉素发酵前期中，产生菌大量繁殖，需氧量不断增加。进入红霉素合成期，需氧量有所减少，溶氧浓度经过一段时间的随之上升后，就开始形成产物，溶氧浓度也不断上升。,3 pH控制,发酵过程中培养液的PH值是微生物在一定环境条件下代谢活动的综合指标，是一项重要的发酵参数。它对菌体的生长和产品的积累有很大的影响。因此必须掌握发酵过程中的PH变化规律，及时监测并加以控制，使它处于最佳的状态。,3 pH控制,发酵过程中由于菌在一定温度及通气条件下对培养基中碳、氮源等的利用，随着有机酸或氨基氮的积累，会使PH产生一定的变化。一般情况下:(1)生
20、长阶段:在菌体生长阶段PH有上升或下降趋势。(2)生产阶段:PH趋于稳定，维持在最适产物合成的范围。(3)自溶 阶段:随着基质的耗尽，菌体蛋白酶的活跃，培养基中氨基氮增加，致使PH又上升，此时菌丝趋于自溶而代谢活动终止。,PH 的变化会引起各种酶活力的改变，影响菌对基质的利用速度和细胞的结构，以致影响菌体的生长和产物的合成。因此，确定发酵过程中的最佳PH值及采取有效控制措施是保证或提高红霉素产量的重要环节。,生物合成的最适pH是6.76.9,生长最适pH是6.67.0,发酵培养基的初始pH为5.78.1时，对菌体生长无影响，但pH低于6.6或高于7.5时，发酵单位仅为对照的80，发酵至4896
21、h之间pH维持在6.76.9之间为宜。,3 pH控制,4 补料控制,为了解除基质过浓的抑制、产物的反馈抑制和葡萄糖分解阻碍效应，以及避免在分批发酵中因一次性投糖过多造成细胞大量生长，耗氧过多而供氧不足的状况，采用中间补料的培养方法是较为有效的。流加补料是选择与过程直接相关的可检测参数作可以解除底物抑制、产物反馈抑制和分解产物阻遏，控制目标。补料以避免在分批发酵中因一次投料过多造成细胞大量生长所引起的一切影响，改善发酵液流变学的性质。,5 前体,根据文献报道，在对红霉素生物合成有影响的有机酸和醇类中，正丙醉的影响最明显。在摇瓶发酵中，考察了正丙醇5种不同添加水平对红霉素发酵的影响。实验结果见表,
22、由表 看 出 正丙醇添加取第4水平时对应红霉素效价为最高，即接种后。小时加正丙醇0.15ml/25ml培养基，发酵48小时加0.15ml/25ml培养基，添加总量为0.30ml.,6 染菌对发酵的影响,细菌污染的现象在抗生素生产过程中是经常发生的，它严重影响产量和产品质量，给生产带来极大的危害。污染杂菌类型不同、时间不同对抗生素发酵的影响大小也不同，污染时间越早，红霉素链霉菌的生长量越少，发酵单位越低，反之，如果是晚期污染，红霉素链霉菌己经繁殖起来，与杂菌竟争原料的能力增强，同时，其代谢产物红霉素也积累一定量，对杂菌也产生一定的抑制作用，这样，杂菌的长势就会受到遏制，对发酵的影响不大。但拮抗菌
23、的影响仍大于非拮抗菌。,5.2.3.4 红霉素的提炼与精制,红霉素是一种有机碱化合物。在碱性时，它溶于有机溶剂；在酸性时则溶于水溶液。因此，可利用红霉素在不同酸碱度下溶解于不同溶剂中的特性，使红霉素从发酵液转移到有机溶剂中，再在适当的酸性条件下使红霉素从溶剂中转移到酸性缓冲液中，而后又在适当的碱性条件下，使红霉素再一次转移到溶剂中。,5.2.3.4 红霉素的提炼与精制,这样经过反复溶剂萃取，就可达到浓缩去杂提纯的目的，最后达到结晶浓度（21052.7105 IU/ml）时进行冷冻结晶，即得到红霉素碱。红霉素在低温水溶液中溶解度最大，在55溶解度最小。在提炼时，利用这一特性又可提高收率。,1 发
24、酵液处理,计算好发酵液实际过程后，加0.10.2的甲醛溶液，起杀菌和菌体蛋白凝集变性的作用。接着加4%6的ZnSO4，去除酸性蛋白并起助滤作用。用1520的碱液调pH至8.28.8之间，稳定红霉素，最后过滤。,2 滤液处理,先计算好醋酸丁酯的加入量，用碱液调pH至1010.5，边加边搅拌，再加适量的消泡剂，保温3032左右。,3 醋酸丁酯提取液处理,加适量磷酸化磷酸盐缓冲液，用10醋酸调pH至55.5，分层，去掉废醋酸丁酯，用10NaOH调pH到78，同时加适量的醋酸丁酯。,4 酸化缓冲液的处理,经过中和的酸性缓冲提取液保温3545，加醋酸丁酯萃取，用10NaOH碱化，调pH至1010.3，二次分级萃取，静置分层，得醋酸丁酯萃取液。,结晶,经冷冻结晶及结晶真空抽干，5060干燥分装。,思考题,红霉素生物合成途径红霉素发酵工艺红霉素提炼及精制工艺要求手绘带控制点工艺流程图,
